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固定化酶在现代工业中的应用 作者： 日期：10 个人收集整理 勿做商业用途固定化酶在现代工业中的应用姓名:胡艳芬 学号:2008132106 指导教师:张孟摘要 酶是一类有催化功能的蛋白质，具有反应条件温和, 底物专一性强， 可在水溶液和中性pH 下操作等优点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处.本文简要介绍了固定化酶的概念、制备方法及其在生物、医药、环境保护等方面的广泛应用。重点介绍一些固定化酶在现代工业中的应用，并对其应用前景进行了展望。关键词 固定化酶 制备 工业 应用 前景酶是一类由活细胞产生的具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质,具有极高的催化效率、高度的特异性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的.由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点,符合绿色化学的要求，从而被大家高度重视，已在许多领域得到广泛的应用1。酶的最大缺点是其不稳定性,在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失；而且酶反应后，会在溶液中残留,造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯,这些都大大阻碍了酶工业的发展，所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多，其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内，但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能2.已固定化的酶像化学反应所用的固体催化剂那样, 既能发挥它们的催化特性， 又能回收， 并能多次反复使用, 使整个生产工艺可以连续化、自动化。近年来， 国内外科技工作者在固定化酶在工业生产中的应用做了大量研究，并得到了广泛的发展,本文将对这些成就做具体介绍.1 固定化酶的概念1916 年Nelson 和Griffin 最先发现了酶的固定化现象后， 科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969 年日本一家制药公司第1 次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L氨基酸, 开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的,而经过固定化以后,酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶 3, 4 .与游离酶相比, 固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时， 又克服了游离酶的不足， 呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。2 固定化酶的制备酶的固定化( enzyme immob ilization） 是指采用有机或无机固体材料作为载体( carrier or support),将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中, 使其仍具有催化活性， 并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。2。1 传统的酶固定化方法传统的酶固定化方法大致可分为4 类: 吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。吸附法是最早出现的酶固定化方法, 包括物理吸附和离子交换吸附.该法条件温和， 酶的构象变化较小或基本不变， 因此对酶的催化活性影响小， 但酶和载体之间结合力弱， 在不适pH、高盐浓度、高温等条件下， 酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。交联法是利用双功能或多功能交联试剂， 在酶分子和交联试剂之间形成共价键， 采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料, 可以产生物理性质各异的固定化酶.交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段5 .包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后, 借助引发剂进行聚合反应， 通过物理作用将酶限定在载体的网格中， 从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的构象及酶分子的化学变化, 反应条件温和， 因而酶活力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失, 常存在扩散限制等问题， 催化反应受传质阻力的影响, 不宜催化大分子底物的反应。载体偶联法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法, 又称共价结合法。载体偶联法所得的固定化酶与载体连接牢固, 有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法.但该法较其它固定方法反应剧烈, 固定化酶活性损失更加严重。文档为个人收集整理，来源于网络文档为个人收集整理,来源于网络2.2 传统固定化技术的改进保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。改善酶固定化效果的途径有： 改善表面积以及孔径等物理结构,如采用分子筛或纳米纤维微孔膜; 改善化学交联的反应及方式， 如辐照, 引发剂引发等; 改善结合的方向选择性， 如采用定向固定化的方法; 其他手段， 如利用长臂使酶远离载体表面, 使载体- 酶体系的溶解度随温度、pH 值等条件的改变而改变， 以便于产物的分离及酶的回收.针对不同的酶有不同的策略, 对于某些酶可能取向很重要, 而对于其他酶可能载体造成的环境重要一些, 因此, 每种酶固定的最佳条件目前还是特异的， 没有统一的理论, 其原因可能是相互间的影响因素太多, 而酶又多由具有复杂组成和空间构型的蛋白质构成， 不存在明显的因果联系。今后可望建立起适用的模型， 使用计算机得到最优的固定策略.2。3 新型酶固定化方法开发新型酶固定化方法的原则是: 实现在较为温和的条件下进行酶的固定化， 尽量减少或避免酶活力的损失。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶。Mohy 等 6 以137 Cs 为辐射源，通过C2射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面, 经进一步活化, 用于青霉素酰化酶的固定。光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶， 由于条件温和， 可获得酶活力较高的固定化酶。Li等 7 利用含芳香叠氮基的光活性酯, 在远紫外光辐照下， 叠氮基光解生成氮烯与PES 膜表面的C H 键间发生插入反应形成仲胺， 将脲酶共价键合到PES 膜的表面。等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体， 大量的等离子体常在室温下存在.载体材料表面可以由等离子体进行有用修饰 8, 9 ， 从而引入活性基团。Puleo 等将钛合金T i26Al24V 表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基， 然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面， 或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理, 再用含碳硝化甘油接枝， 进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定, 实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。本文为互联网收集，请勿用作商业用途本文为互联网收集，请勿用作商业用途3 固定化酶在现代工业中的应用3.1 酶蛋白工程在工业酶中的应用目前酶蛋白质工程主要集中在工业用酶的改造， 因为工业用酶有较好的酶学和晶体学研究基础， 酶的发酵技术(包括诱变技术和筛选方法)也比较成熟， 而且其微生物的遗传工程发展较好, 其次工业酶无须进行医学鉴定， 能很快地投入使用。 如用作洗衣粉添加酶的枯草杆菌蛋白酶, 是一种天然的丝氨酸蛋白酶， 它能够分解蛋白质, 使衣服上的血迹和汗渍等很容易洗掉. 但这种酶一般比较脆弱， 在漂白剂的作用下容易被破坏而失去活性, 原因是222位的甲硫氨酸容易被氧化成砜或亚砜。 现在利用蛋白质工程技术, 用丝氨酸或丙氨酸替代后, 酶的抗氧化能力大大提高， 可在0。 5mol/L 的过氧化氢溶液中停留1小时而活性丝毫未损， 这样便可与漂白剂混合使用。 可以预见生物工程技术的发展和酶固定化技术可以相互补充， 共同发展对酶在工业领域的应用必将起到更大的推动作用。3.2 固定化酶在食品工业中的应用酶固定化在食品工业中的应用是早期发展起来的一个传统领域。 其中最有名的， 也是规模最大的过程, 就是采用固定化葡萄糖异构酶， 从葡萄糖生产高果糖浆. 其它还包括采用固定化乳糖酶去除牛乳中的乳糖、采用固定化脂肪酶通过转酶反应生产可可油替代品、采用固定化耐热蛋白酶制造甜味剂2天冬甜精， 以及应用固定化L2天冬酶从富马酸铵生产天冬氨酸等 7 .1973 年,日本用聚丙烯酸酰胺为载体，用包埋法制成固定化天冬氨酸酶,用于工业化生产。固定化乳糖酶和固定化天门冬氨酸- 脱羧酶分别于1977 年和1982 年用于工业化生产。3.2。1 固定化酶在乳制品生产中的应用牛奶中含有一定量的乳糖,有些人体内缺乏乳糖酶,在饮用牛奶后常出现腹泻、腹胀等症状;另外,由于乳糖难溶于水,常在炼乳、冰淇淋中呈沙样结晶析出，影响风味。乳糖酶可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,如将牛奶用乳糖酶处理则可解决上述问题。Fernandes等 6 研究用琼脂糖作载体，固定来源于南极的冷适应菌Pseudoalterom onas sp的 半乳糖苷酶，并应用于牛奶中乳糖的降解,生产低乳糖牛奶；Caterina等 7 运用固定化技术，研究牛奶中碱性磷酸酶的耐热性；Mona等 8 研究用离子吸附法固定来源于B acillus licheniform is 5A1的牛奶凝结酶,并用于干酪生产。3。2。2 固定化酶在啤酒生产中应用在啤酒生产中,需添加外源性的淀粉酶来补充天然酶的不足.此外,长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得混浊,为防止出现混浊,目前主要采用添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽.温燕梅等以化学共沉淀法制得的磁性聚乙二醇胶体粒子为载体，固定胰蛋白酶，该磁性酶对啤酒澄清、防止冷浑浊有明显效果； Stepanova等研究用DEAE-纤维素固定葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶,用于樱桃、李子的果酒生产。3。2.3 固定化酶在茶饮料生产中的应用将固定化酶法应用于茶饮料生产中,可去除异味，提高适口性,提高营养价值。李平等 9 研究从黑曲霉（Aspergillus niger）发酵液中提取-葡萄糖苷酶酶液,用丝素蛋白将其固定,此固定化酶可应用于茶汁的风味改良； 苏二正10 等以海藻酸钠为载体,采用交联包埋交联的方法共固定化了单宁酶和-葡萄糖苷酶，可应用于茶饮料的除浑和增香处理.3。3 固定化酶在化工领域中的应用。水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合成,如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成Leu - 脑啡肽前体Boc - Phe Leu - OMe 、产率高达90 以上;固定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂Aspartame 的前体Z - L - Asp - L - Phe -OMe 、并可同时实现天冬甜精的生物合成与DL -苯丙氨酸甲酯的光学拆分11 。通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备、且具有潜在的应用前景.脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解,也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要工业价值, 故固定化脂肪酶的研究颇受重视。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题,通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备，且具有潜在的应用前景。3。4 固定化酶在皮革工业中的应用皮革工程是经过一定的处理过程,将原料皮中的可溶性蛋白质、毛、脂肪、弹性蛋白和网硬蛋白等非制革成分去除掉,加入所需要的鞣剂、复鞣剂、加脂剂等材料以提高其使用性能,满足人们的各种需要的过程。由于酶具有较好的专一性、温和性和高效性等生物催化特性,在制革的过程中已有许多工序（浸水、浸灰、脱脂和软化等) 得到应用,在高档皮革的制造过程中则更为如此.在皮革工业废水的处理及固体废弃物的资源化与有效利用方面，酶更是得到了广泛的应用12 。在皮革的生产中，在传统的酶处理后应尽快转入下一道工序。例如，在浸水、浸灰、脱脂和软化等达到预期的目的之后，都要尽快地转入下一道工序。否则,其中的酶还存在一定的活性,还会对皮坯进行作用,影响产品的质量。如果在皮革的生产过程中采用磁性固定化酶技术，在酶处理达到预期目的之后，将其中的酶完全回收。一方面,酶还可以继续使用,有一定的经济效益;另一方面，皮革中已没有酶，不会在没有转入下一工序之前继续作用，影响皮革的质量，有利于皮革产品质量的控制。3。5 固定化酶在处理工业废水中的应用。在工业污水处理中,往往要用到生物曝气法。其原理是在生物细胞内酶的催化作用下产生氧化分解作用。污水中溶解性的物质透过细胞壁,在胞内酶的催化作用下,迅速完成氧化、合成一系列生化反应；被吸附在细胞壁周围的污水中的固体物质,则由细菌分泌出的胞外酶将其转化成可溶性物质，再渗入细胞壁，由胞内酶去进行生化反应。一部分有机物被氧化分解为二氧化碳、水、氨等，并放出能量,另一部分有机物则转化为生物体所必需的营养物质，组成新的原生质,通过这一过程,污水中的COD、BOD、色度等都得到降低,污水得到净化10。如果在皮革污水处理池中设置一固定化装置，采用现代技术将处理污水所必需的生物酶固定在其表面上,在污水处理的过程中，随着污水的运动，这些酶就可以与其中的有机物进行广泛的接触而发生所需要的生物化学反应，达到净化污水的目的。在处理的过程中,固定化酶还可以一直使用下去,而其活性也不会降低.漆酶作为一种高效，绿色的催化剂，随着固定化技术的不断发展,扩大了漆酶的工业应用范围和前景，固定化酶在废水处理中有着重要的应用价值。工业废水中含有大量的难降解的酚类物质，如氯酚等，国内外许多学者已经对固定化酶降解有毒的酚类物质进行了大量的研究，张树江等用固定化漆酶去处废水中的2 ，4- 2 二氯酚的去除率可达99.5 %以上，且不产生二次污染，催化效率高13 。随着染料工业的发展,染料结构复杂且不易降解,固定化漆酶对染料的降解也有独特的作用，且可以回收重复使用，降低成本。4 固定化酶在其它领域的应用及展望 4。1 固定化酶在生化制药中的应用固定化酶的另一个巨大市场是用来生产工业、医学等领域的一些纯度要求较高的制剂， 这其中有最早生产的氨基酸, 还有抗生素、核酸、蛋白质抗体、高纯度的蛋白酶等。科研人员首先于1973 年用固定化的青霉素酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素, 后来，我国的科学家也不断地尝试各种固定化方法, 有的直接用戊二醛交联产该酶的大肠杆菌， 也有用ABSE 交联琼脂糖与青霉素酰化酶直接偶联, 还有的利用三醋酸纤维素包埋和戊二醛交联相结合固定青霉素酰化酶高产菌, 这些试验的结果都显示各种固定化方法均可在很大程度上提高酶的稳定性、增加酶的转化率14 。4.2 固定化酶在生物传感器和环境保护中的应用生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统， 可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质,在临床分析、工业监测等方面有着重要的意义。固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种。制药厂将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上， 制成检验妇女是否妊娠的试纸， 只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检测出尿样的葡萄糖是否超标, 从而断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠14 。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求15 。固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有害物质， 防止污染，从而有效的保护了生活环境。五 结语酶作为一种生物催化剂对人类的生产生活起到了极其重要的作用，而酶的固定化技术的产生与发展更使得酶的功能在工业生产的各个领域得到了体现。近年来酶的固定化及应用研究已得到长足进展， 并且不停的开发新型固定化技术、改进传统固定化方法。一些生物技术， 特别是蛋白质工程和基因重组等分子生物学技术的发展和酶固定化技术可以相互补充, 必将对固定化酶在环境保护、食品工业、生物传感器、有机合成等领域的应用起到更大的推动作用。而在不停进步的现代工业生产中固定化酶更将继续发挥其不可取代的作用,特别是新技术的开发利用使得固定化酶在工业生产中更具广阔的发展前景。 参考文献 1 马建标. 高分子对酶、抗体、DNA 的修饰、固定化及其生物医学应用J 。 高等学校化学学报,1997 ，18 （7) ：1127. 2 李彦锋，李军荣，伏莲娣1 固定化酶的制备及应用J 1 高分子通报,2001 :13 - 231 3 彭志英1 食品酶学导论M 1 北京: 中国轻工业出版社， 20021 4 罗贵民，曹淑桂，张今1酶工程M 1北京：化学工业出版社， 2002 5 杨昌英， 潘家荣， 钟珩等. 醋酸纤维素固定化脂肪酶催化猪油合成单甘酯 J 。 湖北化工, 2002， (6) ： 20 21. 6 Mohy M Y， Ben civenga U， Rossi S, et al . 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This paper introduces the concept of the immobilized enzyme, preparation methods and in biology， medicine， environmental protection and other aspects of the wide range of applications. Highlights some of the immobilized enzyme applications in modern industry, and its application prospect。文档为个人收集整理，来源于网络文档为个人收集整理，来源于网络Key words Immobilized Preparation Industry Application foreground朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典