高效液相色谱法同时测定牙膏中17种防腐剂和抗氧化剂的含量.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2024年4月第2期Apr.2024,No.2分析与测评181www.ffc-www.ffc-作 者北海市食品药品检验所，广西北海 536000 刘艳云 蒋居琼 张 铨 梁少东 伍国怡#高效液相色谱法同时测定牙膏中 17 种防腐剂和抗氧化剂的含量摘 要建立了同时测定牙膏中 17 种防腐剂和抗氧化剂的高效液相色谱法。样品经甲醇提取，经 Capcell Pak C18 MG 色谱柱分离，以乙腈-甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵溶液洗脱，经高效液相色谱仪（HPLC）-二极管阵列检测器（DAD）在 280 nm 处测定，采用外标法定量。结果表明，在 4.43 542.61 g/mL 范围内，17 种防腐剂和抗氧化剂呈良好的线性关系,相关系数（R2）为 0.997 75 0.999 96，回收率为 81.7%116.7%，相对标准偏差（RSD）不大于 2.9%，日内精密度 RSD 为 0.3%2.1%（n=6）。这 17 种防腐剂和抗氧化剂的检出限为 0.2 5.1 g/g，定量限为 0.5 17 g/g。该方法灵敏、准确、快速、稳定，满足牙膏中 17 种防腐剂和抗氧化剂的日常检验工作需要。关键词牙膏 高效液相色谱法 防腐剂 抗氧化剂Simultaneous Determination of 17 Preservatives and Antioxidants in Toothpaste by HPLCLIU Yanyun JIANG Juqiong ZHANG Quan LIANG Shaodong WU Guoyi#(Beihai Institute for Food and Drug Control,Beihai 536000,Guangxi,China)Abstract:A method for the simultaneous determination of 17 preservatives and antioxidants in toothpaste by high performance liquid chromatography(HPLC)was established.The sample was extracted by methanol,separated by Capcell Pak C18 MGcolumn,eluted with acetonitrile-methanol-0.02 mol/L ammonium acetate solution,and detected at 280 nm by HPLC-diode array detector(DAD).The external standard method was used to quantify the content.The results showed a good linearity in the range of 4.43-542.61 g/mL with the correlation coefficients(R2)of 0.997 75-0.999 96.The recovery rates were 81.7%-116.7%,the relative standard deviations(RSDs)were no more than 2.9%,and the within-day precisions were 0.3%-2.1%.The limits of detection were in the range of 0.2-5.1 g/g,and the limits of quantitation were in the range of 0.5-17 g/g.The method is sensitive,accurate,fast,stable,and meets the daily inspection needs of 17 preservatives and antioxidants in toothpaste.Keywords:toothpaste high performance liquid chromatography(HPLC)preservative antioxidant作 者 简 介刘艳云（1987），女，学士，主管中药师，主要从事食品药品化妆品质量分析研究。#通信作者：伍国怡（1982），女，学士，副主任药师，主要从事食品药品化妆品质量分析研究。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0089收稿日期：2023-04-10；修回日期：2023-05-14牙膏作为口腔清洁护理用品的第一大类，市场需求量随着行业创新产品的增多而变大1，防腐剂特别是对羟基苯甲酸酯类物质，因价廉稳定而常作为抑制细菌生长的成分被添加使用，但有研究发现对羟基苯甲酸酯类物质有类似人体雌激素活性，与乳腺癌的发病存在潜在关系2。三氯卡班作为一种新型抗菌剂，具有高效、广谱、安全的抗菌作用，可减少牙龈感染，但有证据显示分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品182www.ffc-www.ffc-三氯卡班可引发癌症3。抗氧化剂的添加能使牙膏因氧化作用导致的变色和变味现象得到抑制和延迟，提高了牙膏的稳定性，从而达到延长货架期的目的，但过量的添加会对人体产生一定的危害 4，特别是对内分泌系统产生干扰5。除对人身体健康的影响，防腐剂和抗氧化剂对水生态系统也会造成长期的慢性毒性影响6-7。目前，防腐剂的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）8-9、气相色谱法10-11、液相色谱-质谱联用法12-13、气相色谱-质谱法14-15等。抗氧化剂的检测研究多集中在食品方面，化妆品抗氧化剂的研究相对较少16-18。牙膏的检测研究主要在防腐抗菌剂和合成着色剂上19-21。拟建立高效液相色谱法同时对牙膏中 14 种防腐剂对氨基苯甲酸、水杨酸、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯、三氯卡班、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和 3 种抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）、丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）进行定性定量分析，可达到操作简单、检验效率高、方法准确度高等效果，以适用于基层检验单位开展日常检验活动。1 仪器、标准物质与试剂1.1 仪器1260 型高效液相色谱仪（配 DAD 检测器），美国安捷伦公司；S210 型 pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XH-C 型漩涡混合器，常州朗越仪器制造有限公司；AS30T 型超声波清洗器，安莱立思仪器有限公司；ST40R 型高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司。1.2 标准物质与试剂标准物质：对氨基苯甲酸、苯酚、脱氢乙酸，Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；水杨酸，中国计量科学研究院；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯，中国食品药品检定研究院；三氯卡班，Standford Chemicals 公司；特丁基对苯二酚（TBHQ）、丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT），CATO 公司；糖精钠、苯甲酸、山梨酸，北京坛墨质检科技有限公司。试剂：甲醇、乙腈，均为色谱纯，美国赛默飞世尔科学世界公司；乙酸铵（优级纯），天津试科密欧化学试剂有限公司；乙酸（分析纯），广州新建精细化工厂；0.45 m 微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司。1.3 试液的配制0.02 mol/L 乙酸铵溶液：称取 1.54 g 乙酸铵，加水至 1 000mL，溶解，用乙酸调节 pH 至 4.0，经 0.45 m 微孔滤膜过滤。2 方法2.1 混合标准系列溶液的制备分别精密称取 1.2 中的标准物质适量，用甲醇稀释得 1 10 mg/mL 各标准储备液，再精密吸取 17 种组分标准储备液适量，用甲醇稀释得混合标准储备液，于 4 冰箱保存。取混合标准储备液，用甲醇稀释得各混合标准系列溶液，现配现用。各组分用量见表 1。表 1 混合标准系列溶液配比组分序号组分名称混合储备溶液质量浓度/(mg mL-1)混合标准系列溶液质量浓度/(g mL-1)1234561对氨基苯甲酸2.008.7017.3943.4886.96130.43173.912水杨酸3.4915.1730.3575.87151.74227.61303.483苯酚2.139.2618.5246.3092.61138.91185.224对羟基苯甲酸甲酯1.365.9111.8329.5759.1388.70118.265对羟基苯甲酸乙酯1.084.709.3923.4846.9670.4393.916TBHQ1.898.2216.4341.0982.17123.26164.357对羟基苯甲酸异丙酯1.486.4312.8732.1764.3596.52128.708对羟基苯甲酸丙酯1.024.438.8722.1744.3566.5288.709对羟基苯甲酸异丁酯8.0535.0070.00175.00350.00525.00700.00第 2 期分析与测评刘艳云，等：高效液相色谱法同时测定牙膏中17种防腐剂和抗氧化剂的含量183www.ffc-2.2 试样制备 精密称取均匀后的牙膏 1 g，置于具塞比色管中，加入 10 mL 甲醇，高速涡旋 1 min 使充分混匀，超声提取 15 min，5 000 r/min 离心 5 min，取上清液经 0.45 m 微孔滤膜过滤，滤液进行 HPLC 测定。2.3 色谱条件色谱柱为 Capcell Pak C18 MG 柱（250 mm 4.6 mm5 m）；柱温为 35 ；流速为 1.0 mL/min；进样量为 5 L；检测波长为 280 nm；流动相 A 为乙腈，流动相 B 为甲醇，流动相 C 为 0.02 mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱，见表 2。表 2 流动相的梯度程序(均为体积分数)时间/min流动相 A/%流动相 B/%流动相 C/%0 1010805.0 30106012.0 65152026.0 65152027.1 10108028.0 1010803 结果与讨论3.1 提取溶剂和时间的优化从各组分的理化性质考虑，分别选用了甲醇、乙腈、体积分数 80%甲醇水溶液、体积分数 50%甲醇水溶液等溶剂的提取效率，结果见图 1，其中序号为表 1 对应物质。图中数据显示甲醇的提取效率明显高于其他 3 种溶剂，故选择甲醇作为提取试剂。试验过程考察了不同超声时间对回收率的影响，超声提取 5、10、15、20、25 min 的结果表明，随着超声时间的增加，各组分回收率有一定程度的增加，但 15 min 后回收率增加不明显，故选择超声提取 15 min。3.2 色谱柱的选择试验对比了 Capcell Pak C18 MG 柱（250 mm 4.6 mm5 m）、Athena C18柱（250 mm4.6 mm 10 m）、XBridge C18柱（250 mm4.6 mm 5 m）。Athena C18柱不能实现羟基苯甲酸乙酯和TBHQ、羟基苯甲酸异丙酯和羟基苯甲酸丙酯两两间的分离，且大部分组分峰型差，严重拖尾。组分序号组分名称混合储备溶液质量浓度/(mg mL-1)混合标准系列溶液质量浓度/(g mL-1)12345610BHA3.0913.4326.8767.17134.35201.52268.7011三氯卡班1.355.8711.7429.3558.7088.04117.3912BHT6.2427.1354.26135.65271.30406.96542.6113糖精钠1.005.0010.0025.0050.0075.00100.0014苯甲酸1.005.0010.0025.0050.0075.00100.0015山梨酸1.005.0010.0025.0050.0075.00100.0016脱氢乙酸2.9714.8529.7074.25148.50222.75297.0017对羟基苯甲酸丁酯1.989.9019.8049.5099.00148.50198.00表 1 混合标准系列溶液配比（续）图 1 不同提取溶剂对牙膏中防腐剂和抗氧化剂回收率的影响020406080100120甲醇水溶液1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17不同提取溶剂对牙膏中防腐剂和抗氧化剂回收率的影响甲醇乙腈体积分数50%甲醇水溶液体积分数80%甲醇水溶液120100806040200回收率/%分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品184www.ffc-www.ffc-XBridge C18柱分离度较好，但是存在部分组分在低含量时灵敏度较低的现象。故最终使用键合采用Si-C方式的Capcell Pak C18 MG 柱，基线平稳，保证大部分组分灵敏度的同时能实现比较好的分离。这 17 种防腐剂和抗氧化剂标准溶液图谱见图2，其中序号为表 1 对应物质。3.3 检测波长的选择 将 17 种防腐剂和抗氧化剂配制成一定质量浓度的溶液，进行 210、230、254、280 nm 波长扫描，结果 210 nm 波长下，大部分组分峰型不佳，个别组分响应很低，同时基线漂移严重。在 254 nm 波长下仅山梨酸和对羟基苯甲酸丁酯响应较高，其余15 种组分均响应低。而 230 nm 波长下各组分响应均可，但存在基线漂移现象。故考虑各组分响应值和基线分离情况，最终选择 280 nm 波长进行检测。3.4 线性范围、相关系数、检出限和定量限按 2.1 方法测定混合标准系列溶液，一定含量范围内考察各组分峰面积和相应质量浓度的线性关系。采用空白基质样品加标，以 3 倍的噪音值质量浓度作为检出限，以 10 倍的噪音值质量浓度作为定量限。这 17 种组分在 4.43 542.61 g/mL范围内线性关系良好，相关系数均不小于 0.997，检出限为 0.2 5.1 g/g-1，定量限为 0.5 17 g/g。线性范围、相关系数、检出限和定量限的结果见表 3。注：序号 1 17 为表 1 对应物质。图 2 17 种防腐剂和抗氧化剂标准溶液图谱表 3 17 种防腐剂和抗氧化剂的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限序号线性方程线性范围/(g mL-1)相关系数定量限/(ug g-1)检出限/(ug g-1)1y=21.368 92x 4.246 418.70 173.910.999 890.51.62y=5.433 45 x 0.849 2915.17 303.480.999 891.44.83y=9.954 19 x+1.167 879.26 185.220.999 840.82.74y=7.395 94 x 0.158 665.91 118.260.999 881.03.45y=6.677 23 x 1.235 014.70 93.910.999 871.23.96y=3.874 62 x 1.546 228.22 164.350.999 892.06.67y=5.804 5 x 0.841 1446.43 128.700.999 861.55.28y=6.510 09 x 0.764 674.43 88.700.999 871.23.99y=5.429 54 x 25.154 2935.00 700.000.998 791.34.310y=4.335 11 x 0.413 5813.43 268.70.999 891.86.111y=16.747 07 x+2.552 755.87 117.390.999 790.62.112y=3.208 13 x 0.660 0227.13 542.610.999 905.11713y=5.258 16 x+0.015 685.00 100.000.999 960.20.514y=4.085 22 x+21.253 755.00 100.000.997 750.20.515y=55.533 12 x+35.246 925.00 100.000.999 810.20.516y=19.901 13 x+73.377 2714.85 297.000.999 460.51.717y=15.859 76 x+30.506 929.90 198.000.999 760.51.8时间/min时间/min60050040030020010007006005004003002001000响应/mAU响应/mAU5 10 15 20 2513245671011121314151617982 4 6 8 10 12 14 16 18第 2 期分析与测评刘艳云，等：高效液相色谱法同时测定牙膏中17种防腐剂和抗氧化剂的含量185www.ffc-3.5 回收率和精密度精密称取 1 g 空白基质样品于具塞比色管中，分别加入 0.5、2.5、5.0 mL 混合标准系列溶液，氮吹至溶液近干，按 2.2 试样制备方法进行处理，每个添加质量浓度进行 3 次平行试验，计算各组分的平均回收率及相对标准偏差（RSD）。同时精密3.6 实际样品检测2023 年 3 月，牙膏监督管理办法22（以下简称办法）发布，明确牙膏的定义和监管事权、牙膏原料的管理要求、牙膏的功效管理和标表 4 17 种防腐剂和抗氧化剂的回收率和精密度组分序号添加质量浓度/(g mL-1)回收率平均值/%RSD/%日内精密度RSD%组分序号添加质量浓度/(g mL-1)回收率平均值/%RSD/%日内精密度RSD%18.70 100.8 0.7 0.8 1013.43 102.3 2.6 1.5 43.48 98.4 0.4 67.17 97.6 2.9 86.96 101.3 0.6 134.35 101.8 2.4 215.17 102.3 0.9 1.0 115.87 97.1 0.9 1.1 75.87 98.0 1.1 29.35 96.1 1.3 151.74 101.3 0.5 58.70 100.6 1.1 39.26 116.7 0.3 0.4 1227.13 103.4 0.5 0.7 46.30 97.5 0.7 135.65 90.6 1.6 92.61 95.3 0.9 271.30 99.3 1.0 45.91 105.3 1.2 1.5 135.00 84.7 1.5 2.1 29.57 99.7 1.0 25.00 87.6 1.9 59.13 101.9 0.6 50.00 90.8 0.9 54.70 98.2 0.8 0.9 145.00 84.9 1.7 1.3 23.48 98.3 0.4 25.00 81.7 2.5 46.96 101.3 1.0 50.00 85.6 2.7 68.22 99.7 1.3 1.6 155.00 87.5 0.9 1.9 41.09 98.2 1.7 25.00 94.0 1.6 82.17 101.5 0.9 50.00 91.6 1.3 76.43 100.6 0.4 0.3 1614.85 85.6 1.1 0.5 32.17 99.1 0.7 74.25 88.1 0.7 64.35 102.2 0.8 148.50 86.4 1.4 84.43 103.1 0.9 1.1 179.90 83.8 1.5 0.9 22.17 105.4 1.1 49.50 85.5 2.0 44.35 102.7 1.0 99.00 93.2 1.8 935.00 108.2 0.9 1.7 175.00 101.2 1.3 350.00 102.0 1.2 称取 6 份 1 g 空白基质样品，加入 2.0 mL 混合标准系列溶液，氮吹至溶液近干，按 2.2 试样制备方法进行处理作为各组分日内精密度的考察。结果显示 17 种防腐剂和抗氧化剂 3 个不同加标质量浓度回收率介于 80%120%，日内精密度均小于3.0%，且大部分小于 2.0%，结果见表 4。签标识要求，同时明确办法未规定的内容参照适用化妆品相关法规，强调儿童牙膏须严格监管。化妆品安全技术规范（2015 年版）中规定，“苯甲酸及其钠盐”“水杨酸”等可作为防腐剂应分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品186www.ffc-www.ffc-用，也可作为限用物质使用的，应根据其使用目的在产品标签上进行标注；配方中含“水杨酸”的，若产品可能被 3 岁以下儿童使用，需将“含水杨酸，3 岁以下儿童勿用”标注于标签上；羟苯酯类单一酯使用时最大用量为质量分数 0.4%（以酸计），混合酯使用时最大用量为质量分数 0.8%（以酸计），且羟苯丙酯及其盐类之和不得超过质量分数 0.14%23。目前糖精钠作为食品添加剂使用时有明确限量标准，但牙膏相关标准中暂未有糖精钠的限量规定。对 27 批次市售牙膏进行检测，仅有 2 批次牙膏均未检出 17 种防腐剂和抗氧化剂中任意一种。在检出的组分中，糖精钠的检出率最高，为85.2%，特别是儿童牙膏，检出糖精钠的质量比含量均在 500 g/g 以上，苯甲酸检出率 44.4%位列第 2。在检出的 25 批次牙膏中，仅有 3 批次牙膏在标签与说明书上标注含有防腐剂。检测结果还显示不同批次牙膏检出的防腐剂组分含量差异较大，例如水杨酸检出质量比含量在 84.3 2 136.7 g/g，最小值与最大值之间差近 25 倍，对羟基苯甲酸丙酯检出含量最小值与最大值之间也差近 14 倍。应用该方法对 27 批次市售牙膏进行检测，25 批次均检出含量差异较大的防腐剂，提示牙膏防腐剂的使用为普遍现象，但厂家对防腐剂和抗氧化剂添加含量的要求不一将会造成一定的安全隐患。结果见表 5。表 5 样品检测结果及检出防腐剂和抗氧化剂的含量检出组分检验量/批检出量/批检出率/%检出质量比含量/(g g-1)糖精钠272385.2 150.9 846.9苯甲酸1244.4 230.9 1 147.7水杨酸518.5 84.3 2 136.7对羟基苯甲酸甲酯518.5 588.1 1 658.2对羟基苯甲酸乙酯27.4 838.5 1 326.3对羟基苯甲酸丙酯518.5 245.6 3 389.54 结论方法线性关系良好，各组分回收率在 80%110%，分析灵敏度高，操作简易，检测时间短，试剂用量少，检验成本低，目前同时检测牙膏中防腐剂和抗氧化剂的研究相对较少，可为牙膏中防腐剂和抗氧化剂的日常检测提供参考。但尚存不足之处，一是分析的样本量较少，对市场上牙膏中 17 种防腐剂和抗氧化剂的添加情况还不能做更全面的掌握；二是方法选择的防腐剂和抗氧化剂组分覆盖面还较窄，一些可能添加的防腐剂和抗氧化剂不在本方法检测范围内，因而不能进行更充分地筛查。结果也说明目前牙膏中存在比较严重的防腐剂滥用现象，规范牙膏的标签或说明书应得到重视，建议完善相应标准以适应新形势下的市场监管。参考文献1 徐春生.中国口腔清洁护理用品技术发展的现状与趋势 J.日用化学品科学,2019，42(8):11-16.2 RAZA N,KIM K H,ABDULLAH M,et al.Recent developments in analytical quantitation approaches for parabens in human-associated samples J.Trends in Analytical Chemistry,2018,98(13):161-173.3 ZHANG H N,LU Y,LIANG Y S,et al.Triclocarban-induced responses of endogenous and xenobiotic metabolism in human hepatic cells:toxicity assessment based on nontargeted metabolomics approach J.Journal of Hazardous Materials,2020,392:122475.4 WANG W,KANNAN P,XUE J C,et al.Synthetic phenolic antioxidants,including butylated hydroxytoluene(BHT),in resin-based dental sealants J.Environmental Research,2016,151:339-343.5 YANG X X,SONG W T,LIU N,et al.Synthetic phenolic antioxidants cause 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