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16 心脑血管病防治 2024 年 2 月第 24 卷第 2 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,February 2024,Vol.24,No.2丹皮酚通过调节 p38 丝裂原活化蛋白激酶对缺血性脑卒中大鼠神经炎症的影响周华勇.赵玉萍.杨旭.张珊珊.季一飞【摘要】目的 探讨丹皮酚对缺血性脑卒中大鼠神经炎症的影响及其机制。方法 使用SPF级 雄性 SD 大鼠构建缺血性脑卒中大鼠模型，将大鼠分为假手术组（Sham 组）、模型组（Model 组）、丹皮酚组（Paeonol 组，20 mg/kg 丹皮酚）、丹皮酚联合 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）激活剂组（Paeonol+Anisomycin 组，20 mg/kg 丹皮酚+2 mg/kg Anisomycin）。造模 48 h 后观察大鼠神经功能缺损评分，检测脑梗死体积，使用 TUNEL 染色及免疫荧光染色观察神经元凋亡及小胶质细胞激活情况，酶联免疫吸附测定法检测缺血半暗带区脑组织肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素（IL）-1 和 IL-6 水平，Western blot 检测 p-p38 MAPK、p38 MAPK 蛋白表达。结果 与Sham 组比较，Model 组大鼠神经功能损伤严重，脑组织出现白色梗死灶，神经功能缺损评分及脑梗死体积、神经元凋亡率、小胶质细胞数量及 TNF-、IL-1 和 IL-6 水平、p-p38 MAPK 蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（P 0.05）；与 Model 组比较，Paeonol 组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积、神经元凋亡率、小胶质细胞数量及 TNF-、IL-1 和 IL-6 水平、p-p38 MAPK 表达水平降低，差异均有统计学意义（P 0.05）；与 Paeonol 组比较，Paeonol+Anisomycin 组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积增加，且丹皮酚改善缺血性脑卒中大鼠脑损伤及炎症反应的作用可被 Anisomycin 逆转（P 0.05）。结论 丹皮酚可能通过抑制 p38 MAPK 通路，抑制小胶质细胞激活及炎症反应，减轻缺血性脑卒中引起的脑损伤。【关键词】丹皮酚；缺血性脑卒中；神经炎症；p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路Influence of Paeonol on neuroinflammation in ischemic stroke rats by regulating p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway Zhou Huayong,Zhao Yuping,Yang Xu,Zhang Shanshan,Ji Yifei.Department of Neurology,Nanchong Central Hospital(Second Clinical College of North Sichuan University),Nanchong 637000,ChinaCorresponding author:Zhou Huayong,Email:【Abstract】Objective To investigate the influence of Paeonol on neuroinflammation in ischemic stroke rats and its mechanism.Methods Male SD rats with SPF level were used to establish a rat model of ischemic stroke.Rats were devided into Sham group,Model group,Paeonol group(20 mg/kg Paeonol),and Paeonol combined with p38 mitogen-activated protein kinase(p38 MAPK)activator group(Paeonol+Anisomycin group,20 mg/kg Paeonol+2 mg/kg Anisomycin).After modeling for 48 hours,neurological function deficit score were observed,cerebral infarction volume was detected,neuronal apoptosis and microglia activation were assessed by TUNEL staining and immunofluorescence staining.The levels of tumor necrosis factor (TNF-),interleukin(IL)-1 and IL-6 in the brain tissue of the ischemic penumbra were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The expression of p-p38 MAPK and p38 MAPK was measured by Western blot.Results Compared to the Sham group,rats in the Model group had severe neurological damage,white infarct lesions in the brain tissue,increased neurological function deficit score,cerebral infarct volume,neuron apoptosis rate,microglia cell count and levels of TNF-,IL-1,IL-6,and p-p38 MAPK protein expression,the differences were statistically significant(all P 0.05).Compared to the Model group,rats in the Paeonol group exhibited reduced neurological function deficit score,cerebral infarct volume,neuron apoptosis rate,microglia cell DOI:10.3969/j.issn.1009-816x.2024.02.004基金项目：四川省南充市科技局科研项目（NSMC20170454）作者单位：637000 四川省南充市中心医院（川北学院第二临床学院）神经内科通信作者：周华勇，Email：基础研究 17 心脑血管病防治 2024 年 2 月第 24 卷第 2 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,February 2024,Vol.24,No.2count and levels of TNF-,IL-1 and IL-6,and p-p38 MAPK protein expression,the differences were statistically significant(P 0.05).Compared to the Paeonol group,rats in the Paeonol+Anisomycin group showed increased neurological function deficit score and cerebral infarct volume,and the protective effect of Paeonol on ischemic stroke-induced brain injury and inflammatory response could be reversed by Anisomycin(P 0.05).Conclusion Paeonol may alleviate ischemic stroke-induced brain injury by inhibiting the p38 MAPK pathway,suppressing microglia activation and inflammatory response.【Key words】Paeonol;Ischemic stroke;Neuroinflammation;P38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway缺血性脑卒中具有比较高的发病率、致残率与死亡率，其病理机制包括兴奋性氨基酸毒性、能量耗竭与酸中毒、细胞内钙离子超载、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等，其中炎症反应是脑缺血损伤的重要病理进程1-2。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路在保护神经功能、降低神经元凋亡过程中发挥重要作用3。p38 MAPK 属于MAPK 家族，是一种应激活化激酶，可控制细胞分化、生长和对炎症的反应。脑缺血再灌注损伤期间，p38 MAPK 信号的激活可驱动多种下游转录因子的激活，这些转录因子可加重脑损伤4-5。研究显示，抑制p38 MAPK 信号通路的活化可减轻大鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤6-7。丹皮酚是从牡丹根皮等植物中提取的有效成分，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用，对中枢神经系统疾病，丹皮酚还具有抗抑郁、抗焦虑、改善脑缺血再灌注、认知障碍等作用8-9。研究显示，丹皮酚可通过抗炎作用对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经起保护作用10，然而丹皮酚对缺血性脑卒中的作用机制尚不清楚，本研究探讨丹皮酚对缺血性脑卒中大鼠神经炎症反应的影响及其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物、药物和试剂及仪器1.1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠，68周龄，体质量（23020）g，购自湖北省实验动物研究中心，生产许可 SCXK（鄂）2015-0018。大鼠适应性饲养 1 周 后进行实验，饲养环境温度为 2025，湿度为50%70%，光照 12 h/d，自由进食与饮水。研究经川北医学院动物伦理委员会审核批准（2023-07-182）。1.1.2 药物和试剂 丹皮酚（S24511，纯度 98%）购自原叶生物科技有限公司；茴香霉素-Anisomycin（p38 MAPK 信号通路激活剂，A5980）、TTC（T8170）购自 Solarbio 公司，TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（C1088）、大鼠肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-,TNF-）（PT516）、白细胞介素（interleukin,IL）-1（PI303）、IL-6（PI328）酶 联 免 疫 吸 附 测 定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测试剂盒购自Beyotime 生物；兔抗鼠p-p38 MAPK（4631）、p38 MAPK（8690）抗体购自美国 Cell Signaling Technology（CST）公司；离子钙结合衔接分子 1（ionized calcium binding adapter molecule 1,IBA-1）（ab178847）、山羊抗兔 IgG（Alexa Fluor 647，ab150079）、Alexa Fluor 488 荧 光 Anti-CD68抗体（ab222914）购自Abcam 公司。1.1.3 仪器 BX53 荧光显微镜（日本 Olympus 公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；DYY-6C 电泳仪电源、DYCZ-24K 电泳槽（北京六一生物科技有限公司）；Gel Doc EZ 凝胶成像仪（美国BIO-RAD 公司）。1.2 方法1.2.1 实验分组及缺血性脑卒中模型制备 将大鼠按照随机数字表法分为假手术组（Sham 组）、模型组（Model 组）、丹皮酚组（Paeonol 组）、丹皮酚联合p38 MAPK 激活剂组（Paeonol+Anisomycin 组），每组 12 只大鼠。Paeonol 组与 Paeonol+Anisomycin 组在术前分别使用 20 mg/kg 丹皮酚、20 mg/kg 丹皮酚联合2 mg/kg Anisomycin 腹腔注射给药10-11，Sham 组与Model 组给予等量的 0.9%氯化钠溶液，每日 1 次，连续 7 d。采用改良线栓法复制缺血性脑卒中大鼠模型12。造模48 h后，对大鼠进行神经功能缺损评分11，若 13 分则为造模成功。Sham 组除不插栓外，其余操作同Model组。1.2.2 神经功能缺损评分与脑梗死体积检测 造模 48 h 后进行神经功能缺损评分，评分标准11：0 分：无神经缺损症状；1 分：提尾时前肢向内屈曲；2 分：行走时向右侧转圈；3 分：行走时向右侧倾倒；4 分：无自主活动伴意识障碍。麻醉处死大鼠，取出脑组织，每组随机选择6只大鼠，冰冻后冠状面切成厚度为 2 mm的切片，用 2%TTC 溶液 37避光染色 15 min，4%多聚甲醛固定，梗死组织为白色，正常组织为红色，使用 Image J 1.47v软件对梗死和总脑容量进行量化，脑梗死体积（%）=（缺血对侧半球体积缺血侧半球非梗死体积）/缺 18 心脑血管病防治 2024 年 2 月第 24 卷第 2 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,February 2024,Vol.24,No.2血对侧半球体积100%。取出每组其余 6 只大鼠的脑组织，并将其冠状面切分为两部分，一部分分离缺血半暗带组织后于-80保存，用于炎症因子及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测；另一部分制备脑组织冰冻切片，用于TUNEL染色和免疫荧光染色。1.2.3 TUNEL 检测神经元凋亡 麻醉处死大鼠后，将脑组织取出冰冻后切片，0.5%Triton X-100透化30 min，使用 TUNEL 液染色 1 h，DAPI 复染细胞核，荧光显微镜观察并计算神经元凋亡率13。1.2.4 脑组织 TNF-、IL-1 和 IL-6 水平检测 取大鼠缺血半暗带区脑组织，加入脑组织重量9 倍的 0.9%氯化钠溶液研磨匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清，使用ELISA试剂盒检测TNF-、IL-1、IL-6 水平。1.2.5 免疫荧光染色检测小胶质细胞激活 取大鼠脑组织冰冻切片，使用 0.3%PBST 透化后分别加入IBA-1、CD68一抗孵育，再加入荧光标记的IgG二抗，孵育，DAPI 复染细胞核，荧光显微镜观察缺血半暗带区 IBA-1 表达。1.2.6 Western blot 检 测 脑 组 织 p-p38 MAPK、p38 MAPK 蛋白表达 取各组大鼠缺血半暗带区脑组织匀浆后，提取总蛋白经电泳、转膜与封闭后，分别加入兔抗鼠 p-p38 MAPK（1:1 000）、p38 MAPK（1:1 000）一抗稀释液，4孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育 1 h，显影后，以-actin 为内参，Image J 软件分析各蛋白相对表达。1.3 统计学处理 采用 SPSS 22.0 版统计软件分析，实验数据符合正态分布用 xs 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验，P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 丹皮酚对大鼠神经功能及脑梗死体积的影响 四组大鼠神经功能及脑梗死体积差异有统计学意义（F=46.719、106.328，P 0.01）。Sham组大鼠神经功能正常，脑组织无梗死灶形成（神经功能缺损评分及脑梗死体积为 0）；造模 48 h 后，Model 组大鼠神经功能损伤严重，脑组织出现白色梗死灶，神经功能缺损评分（2.800.90）分及脑梗死体积（28.786.72）%较 Sham 组增加，差异有统计学意义（P 0.05）；与 Model 组比较，Paeonol 组大鼠神经功能缺损评分（1.600.60）分及脑梗死体积（16.543.78）%减少，差异有统计学意义（P 0.05）；与 Paeonol 组比较，Paeonol+Anisomycin 组大鼠神经功能缺损评分2.2 丹皮酚对大鼠神经元凋亡的影响 四组神经元凋亡比较差异有统计学意义（F=55.824，P 0.01）。TUNEL染色结果显示，Sham组绿色荧光很少，几乎无神经元凋亡；与Sham组神经元凋亡率（1.650.32）%比 较，Model 组 绿 色 荧 光 增 强，神 经 元 凋 亡 率（28.545.26）%增加，差异有统计学意义（P 0.05）；与Model组比较，Paeonol组神经元凋亡率（15.343.61）%降低，差异有统计学意义（P 0.05）；与Paeonol组比较，Paeonol+Anisomycin组神经元凋亡率（23.424.28）%升高，差异有统计学意义（P 0.05），图2见封底。2.3 丹皮酚对大鼠缺血半暗带区脑组织炎症因子影响 与 Sham 组比较，Model 组大鼠脑组织 TNF-、IL-1和IL-6水平升高，差异有统计学意义（P 0.05）；与 Model 组 比 较，Paeonol 组 大 鼠 脑 组 织 TNF-、IL-1和 IL-6 水平降低，差异有统计学意义（P 0.05）；与 Paeonol 组比较，Paeonol+Anisomycin 组大鼠脑组织TNF-、IL-1 和 IL-6 水平升高，差异有统计学意义（P 0.05），见表1。图 1 TTC 染色观察丹皮酚对大鼠脑梗死体积的影响Paeonol+Anisomycin 组Model 组Sham 组Paeonol 组表1 丹皮酚对大鼠缺血半暗带区脑组织炎症因子的影响（xs）分组只数TNF-（ng/mL）IL-1（ng/mL）IL-6（ng/mL）Sham 组68.451.564.211.133.560.95Model 组621.693.42a18.553.67a14.522.73aPaeonol 组612.372.38b10.152.12b8.241.69bPaeonol+Anisomycin 组617.622.53c14.462.23c12.722.14cF 值30.97837.36736.562P 值0.010.010.01 注：TNF-：肿瘤坏死因子-；IL-1：白细胞介素-1；IL-6：白细胞介素-6；与 Sham 组比较aP 0.05，与 Model 组比较bP 0.05，与 Paeonol 组比较cP 0.052.4 丹皮酚对大鼠缺血半暗带区脑组织小胶质细胞（2.300.60）分及脑梗死体积（24.413.62）%增加，差异有统计学意义（P 0.05）。脑梗死体积比较见图1。19 心脑血管病防治 2024 年 2 月第 24 卷第 2 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,February 2024,Vol.24,No.2的影响 IBA-1 是小胶质细胞的标志物，呈红色荧光，CD68 是小胶质细胞激活的标志物，呈绿色荧光。与Sham 组（18.212.46）个 比较，Model 组红色荧光标记的小胶质细胞数量（49.503.32）个 增加（P 0.05），CD68绿色荧光标记的小胶质细胞数量也增加（4.350.61）个比（25.241.17）个，P 0.05，表明小胶质细胞激活明显；Paeonol 组红色荧光（25.682.90）个及绿色荧光（12.591.04）个标记 的小胶质细胞数量较 Model 组均减少（P 0.05），小胶质细胞激活下降；与 Paeonol 组比较，Paeonol+Anisomycin组红色荧光（42.353.02）个及绿色荧光（22.961.20）个标记的小胶质细胞数量均增加（P 0.05），小胶质细胞激活增加，图3见封底。2.5 丹皮酚对大鼠缺血半暗带区脑组织 p-p38MAPK蛋白表达的影响 四组大鼠 p-p38 MAPK 蛋白（p-p38 MAPK/p38 MAPK）比较差异有统计学意义（F=85.769，P 0.01）。与Sham组（0.210.04）比较，Model组p-p38 MAPK 蛋白表达水平（0.780.08）升高，差异有统计学意义（P 0.05）；与 Model 组比较，Paeonol 组p-p38 MAPK 蛋白表达水平（0.410.06）降低，差异 有统计学意义（P 0.05）；与Paeonol组比较，Paeonol+Anisomycin组p-p38 MAPK蛋白表达水平（0.580.07）升高，差异有统计学意义（P 0.05），见图4。神经保护作用16-17。炎症反应是引发脑缺血再灌注继发脑损伤的主要原因之一，脑缺血后，引发脑组织细胞释放大量的炎症因子（TNF-、IL-1、IL-6 等）促进组织修复，但炎症反应会引发瀑布效应加重脑损伤，通过抑制炎症介质的过度产生可显著减少脑梗死体积，对改善脑缺血再灌注损伤起着重要作用14,18。研究显示，丹皮酚可抑制 TNF-和 IL-1 的释放，改善弗氏完全佐剂诱导的炎症性疼痛19。本研究使用丹皮酚治疗缺血性脑卒中模型大鼠后，大鼠脑组织TNF-、IL-1 和 IL-6 水平降低，脑梗死体积和神经元凋亡水平均降低，提示丹皮酚可通过抑制炎症反应减轻脑损伤。另有研究发现，丹皮酚可抑制1-甲基-4-苯基吡啶诱导的 BV2 小胶质细胞激活，抑制 TNF-、IL-1、IL-6 等炎症因子的释放20。在本研究中，使用丹皮酚干预后，缺血性脑卒中大鼠脑组织中活化的小胶质细胞减少，提示丹皮酚可通过抑制小胶质细胞激活，抑制炎症反应，减少神经元凋亡。MAPK 信号通路（包括 ERK 通路、JNK 通路和p38 MAPK 通路）与神经元凋亡有关，其信号激活时蛋白磷酸化水平（p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK）升高，可介导细胞增殖与炎症反应；抑制 MAPK 信号通路可减少神经细胞凋亡，对缺血再灌注脑损伤有神经保护作用21-22。p38 MAPK 作为 MAPK 家族成员，在细胞炎症、氧化应激和凋亡等过程中具有重要作用。据报道，p38 MAPK 的激活可促进神经元凋亡，抑制其通路的激活，可保护缺血性脑卒中后的神经损伤23-24。本研究使用丹皮酚治疗缺血性脑卒中模型大鼠后，p-p38 MAPK 蛋白表达水平降低，提示丹皮酚可抑制p38 MAPK的激活。为了进一步验证丹皮酚的作用机制，本研究在丹皮酚治疗的基础上，使用p38 MAPK的激活剂Anisomycin进行干预，结果显示，丹皮酚改善缺血性脑卒中大鼠脑损伤的作用可被Anisomycin明显减弱，证实丹皮酚可能通过抑制p38 MAPK通路的激活减轻缺血性脑卒中引起的脑组织损伤，减少神经元凋亡。综上所述，丹皮酚可抑制小胶质细胞激活及炎症反应，减轻缺血性脑卒中引起的脑损伤，其作用机制可能与抑制 p38 MAPK 通路的激活有关，p38 MAPK通路可能是丹皮酚发挥神经保护作用的潜在靶点。但本研究仅限于再灌注后 48 h。因此，需要一项长期的观察性研究来了解p38 MAPK 通路在用丹皮酚治疗的缺血性脑卒中中的作用。参考文献1 朱慧渊，苗琦，王江，等.丹参、红花有效组分配伍对缺血性3 讨论缺血性脑卒中约占脑卒中的 60%70%，可导致患者偏瘫、失语、认知障碍。缺血缺氧可引起脑组织受损、神经元凋亡、炎症反应加剧等，抑制炎症反应，减少神经元凋亡可减少缺血引起的损伤14-15。本研究采用改良线栓法制备缺血性脑卒中大鼠模型，给予丹皮酚腹腔治疗后，神经功能损伤明显减轻，大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积、神经元凋亡率明显降低，表明丹皮酚可保护缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤。丹皮酚具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用。此外，丹皮酚对癫痫等中枢神经系统疾病具有图 4 Western blot 检测 p-p38 MAPK 蛋白表达（A：Sham 组；B：Model 组；C：Paeonol 组；D：Paeonol+Anisomycin 组；MAPK：丝裂原活化蛋白激酶）p-p38 MAPKp38 MAPK-actinABDC 20 心脑血管病防治 2024 年 2 月第 24 卷第 2 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,February 2024,Vol.24,No.2脑卒中大鼠脑组织致炎因子的作用机制 J.中国实验方剂学杂志，2020，26（21）：77-83.2 Yu J,Wang WN,Matei N,et al.Ezetimibe attenuates oxidative stress and neuroinflammation via the AMPK/Nrf2/TXNIP pathway after MCAO in ratsJ.Oxid Med Cell Longev,2020,2020:4717258.3 Gad SN,Nofal S,Raafat EM,et al.Lixisenatide reduced damage in hippocampus CA1 neurons in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion possibly via the ERK/P38 signaling pathwayJ.J Mol Neurosci,2020,70(7):1026-1037.4 Wang XG,Zhu DD,Li N,et al.Scorpion venom heat-resistant peptide is neuroprotective against cerebral 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0006 0005 0004 0003 0002 0001 0000年份A粗死亡率（/10 万）500450400350300250200150100500年份图 4 1990 至 2019 年全球不同地区标化 DALYs 的发展情况（DALYs 注解见图 2）标化 DALYs 率（/10 万）年份9 0008 0007 0006 0005 0004 0003 0002 0001 0000图 2 TUNEL 染色观察丹皮酚对大鼠缺血半暗带区脑组织神经元凋亡的影响（200）Paeonol+Anisomycin 组Model 组Sham 组Paeonol 组TUNELDAPIMerged图 3 免疫荧光染色观察丹皮酚对大鼠缺血半暗带区脑组织小胶质细胞的影响（200）IBA-1CD68MergedPaeonol+Anisomycin 组Model 组Sham 组Paeonol 组丹皮酚通过调节 p38 丝裂原活化蛋白激酶对缺血性 脑卒中大鼠神经炎症的影响周华勇.赵玉萍.杨旭.张珊珊.季一飞（正文见第 16 页）