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博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究中文摘要背景及目的肝癌是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一，目前临床上主要应用超声扫 描和常用的血清标志物AFP来作为早期肝癌的筛查手段，但肝癌的早期诊断率 一直未有突破性的提高。随着蛋白质组学的发展，出现一些新的质谱技术分离 和鉴定蛋白质，可快速有效的发现血清中肿瘤早期诊断标志物。本课题主要运用新近发展的蛋白质组学技术ClinProt系统和iTRAQ技 术，从血清学上为肝癌早期诊断寻找高效、灵敏和特异的肿瘤标志物，为筛选和 诊断早期肝癌提供一定的参考依据。研究方法收集血清标本150例，包括正常组25例、慢性肝炎组25例、肝硬化组25 例、肝癌组75例作为训练组，应用ClinProt系统Cu2+螯合磁珠分离样本，对各 组间进行质谱分析，利用神经网络算法和快速分类算法分别建立分类预测模型。另收集血清标本37例，包括非肝癌组22例（其中正常组10例，慢性肝炎组6 例，肝硬化组6例）,肝癌组15例，利用ClinProt诊断模型对肝癌组与非肝癌 组进行验证。采用二级鉴定筛选肝癌特异诊断标志物，并用 Western Blot和 RT-PCR的方法验证。将肝硬化组25例和小肝癌组25例各自混合后用iTRAQ试剂标记，分离肽 段并进行鉴定，得到肝硬化组与小肝癌组之间差异蛋白定性和定量信息。对筛选 出的差异蛋白进行 Western Blot和ELISA验证。-I-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究研究结果ClinProt系统建立的模型对于各组间有较好的交叉验证能力和识别率，应用 神经网络算法建立的诊断模型识别肝癌的灵敏度为86.67%,特异度为72.73%；应用快速分类算法建立的诊断模型识别肝癌的灵敏度为86.67%,特异度为100%。质荷比1465.6的蛋白峰在肝硬化组远远高于肝癌组，经鉴定为homeobox A3(HOXA3),Western Blot和RT-PCR均证实HOXA3在肝癌组织中的表达低于癌 旁肝组织。iTRAQ技术在肝硬化组与小肝癌组中共鉴定到255个肽段，对应60个蛋白 质，其中肝硬化组中表达上调的蛋白有10个，表达差异1.2倍的蛋白有4个；在小肝癌组中表达上调的蛋白有50个，表达差异1.2倍的蛋白有41个。差异 蛋白之一 clusterin在小肝癌组的表达高于肝硬化组，升高倍数为1.3倍。Western Blot结果显示肝癌组织中clusterin表达明显高于癌旁肝组织，肝硬化血清中 clusterin的表达明显低于肝癌组。ELISA结果显示肝癌血清中clusterin含量明显 低于正常组、HBV携带组、慢性肝炎组，而明显高于肝硬化组。ROC曲线表明 当clusterin浓度达到时，区分肝癌与肝硬化的灵敏度为91%,特异度为 83%o当血清clusterin和AFP各取最适值50gg/ml和15ng/ml时，二者的曲线下 面积分别为0.973和0781(尸V0.05)。结 论ClinProt系统可以应用于筛选肝癌血清早期诊断标志物，有效的区分正常组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝癌组。用筛选出的差异峰组成的诊断模型对肝癌诊断 具有较高的灵敏度和特异度。经质谱鉴定的差异蛋白HOXA3,可以作为一个新 的肝癌候选早期诊断标志物。iTRAQ技术检测肝硬化组和小肝癌组有较好的定性和定量结果，该技术可 用于肝癌发生过程中蛋白表达的动态监测。鉴定到的差异蛋白clusterin可作为肝 癌血清的早期诊断标志物，并且比血清AFP具有更高的灵敏度和特异度。关键词肝细胞癌，蛋白质组学，肿瘤标志物，ClinProt,iTRAQ-II-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究Proteomics Study of Serum Biomarkers for Hepatocellular Carcinoma AbstractBACKGROUND AND OBJECTIVE:Hepatacellular carcinoma(HCC)is a common human cancer worldwide.Abdominal ultrasound scan and serum alpha fetoprotein measurement are used to be the surveillance tools fbr HCC,but they are not so good.Some new protiomic methods could help to find some serum biomarkers fbr the early detection of HCC.We aimed to use ClinProt system and iTRAQ to find the serum biomarkers with better sensitivity and specificity to differentiate HCC patients from the controls.METHODS:Serum samples from 150 cases(25 healthy,25 chronic hepatitis,25 liver cirrhosis and 75 HCC)were collected and analyzed by ClinProt system.The spectral data were analyzed and potential biomarkers were chosen fbr system training and used to construct diagnostic models by Supervised Neural Network(SNN)and Quick Classifier(QC)algorithm.Then,37 cases(15 HCC and 22 non-HCC)were validated by using the diagnostic models.We identified the diagnostic biomarkers and tested with Western Blot and RT-PCR.-Ill-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究ITRAQ technology was applied to discuss the protein expression between liver cirrhosis and 5cm HCC,and then we used Western Blot and ELISA to validate the identified protein.RESULTS：The diagnostic models constructed by ClinProt system had well cross validation and recognition among the groups.The sensitivity and specificity for HCC by SNN was 86.67%and 72.73%,and by QC was 86.67%and 100%.The peak with mass charge ratio 1465.6 was down-regulated in HCC.It was identified as protein HOXA3,and expressed lower in HCC tissues.About 255 peptides were identified by iTRAQ between liver cirrhosis and 5cm HCC.Among the 60 proteins,there were 10 up-regulated in liver cirrhosis and 50 up-regulated in 5cm HCC.Clusterin was 1.3 times in 5cm HCC than in liver cirrhosis.Western Blot showed overexpression of clusterin in HCC tissue and serum.The serum clusterin levels in HCC were significantly lower than that in healthy,HBV carrier and chronic hepatitis,but statistically higher than in cirrhosis.Receiver operator characteristic(ROC)curve indicated that a serum clusterin value of 50 jxg/mL yielded the best sensitivity(91%)and specificity(83%)for differentiating HCC patients from those with cirrhosis.The optimal alpha fetoprotein(AFP)cutoff value was 15 ng/mL and was inferior to the clusterin value of 50 g/mL,the area under the ROC curves being 0.937 versus 0.781,respectively(P 0.05).CONCLUSION:ClinProt system could used to screen the serum early diagnostic markers of HCC.The diagnostic models set by the different peaks had good sensitivity and specificity.HOXA3 could be used as one of the biomarkers for early diagnosis of HCC.ITRAQ could be a good tool for the identification of differentially regulated proteins between cirrhosis and HCC.Serum clusterin was more sensitive and specific than serum AFP for differentiating HCC patients from cirrhosis,and may be a useful surveillance tool of HCC.KEY WORDSHepatacellular carcinoma,Proteomics,Tumor marker,ClinProt,iTRAQ-IV-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究绪论肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全世界范围内位居第四，每 年约有25万人死于肝癌1,2o但近二十年来，肝癌病人的生存率并没有得到 显著的提高，5年生存率仅从2%提高到5%3o肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝脏恶性肿瘤中的最主要类型，东亚，东南亚，中西非 等地区为HCC的集中高发区域。我国亦属肝癌的高发地区，20世纪90年代以 来，我国HCC的发病率已上升到恶性肿瘤的第二位，在中国的肿瘤致死原因中 高居第二位，年死亡率约为20.37/10万，占恶性肿瘤死亡率的第23位4。迄 今为止，HCC的发病原因仍然不明，病毒感染、黄曲霉素B1的摄入和酗酒等被 认为是主要的风险因子5,6o在中国和曰本，75%-80%的HCC发病与肝脏慢 性病毒性感染有关，其中B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染占50%-55%,并且世界范围内80%90%的HCC病例合并有肝硬化7,8。因此，肝脏的HBV 感染及肝硬化是HCC发病最主要的高危因素和癌前病变过程。HCC起病隐匿，早期常因无明显症状而漏诊，多数HCC在诊断时已达中晚 期，错过了最佳治疗时间，因此对HCC发生的监测和早期诊断非常的重要。目 前临床上对于HCC发生的常规监测方法是结合6个月的腹部超声扫描和血清甲 胎蛋白(alpha fbtoprotein,AFP)水平的测定。腹部超声扫描对于HbsAg携带者 的诊断灵敏度可达71%,特异度可达93%,但其阳性预测值只有14%9O而AFP 也不是非常理想的筛查指标，其诊断灵敏度、特异性和阳性预测值分别只有 39%-64%、76%-91%和9%-32%9-11。AFP在临床上存在假阴性和假阳性，高 分化或分化很差的HCC往往不产生AFP,肝硬化患者的血清AFP检测也有一定 的阳性率，近年来，AFP阴性的HCC患者也呈上升趋势214。正因如此，亟 需找到更加简单可靠的方法来提高早期HCC的检出率。近年来肿瘤标记物已成为肿瘤研究的热点，肿瘤标志物(tumor markers)是指 由恶性肿瘤细胞合成、分泌并释放，能在机体组织或体液中用生化或免疫组化等 方法进行定量测定的生物分子(通常为蛋白质)，可以给临床提供恶性肿瘤的诊 断、预后或治疗监测等信息。理想的恶性肿瘤早期诊断标记物应在病灶局限时(即中山大学博士学位论文 肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究早期)便能检出，对肿瘤具有高度特异性，检测方法方便简单，能在一定程度上 反应肿瘤的进展，但是能符合这些条件的现有肿瘤标记寥寥无几，至今，任何一 个分子改变都不足以成为恶性肿瘤尤其是早期肿瘤诊断中唯一的肿瘤标记物 15-18。在恶性肿瘤的早期诊断中，血清学检查一直是临床上最为简便和有效 的无创性检测方法之一，其实用价值和临床意义尤为突出。目前发现的肿瘤血清 学标记物还不多，其发展趋势迅猛，是目前被广泛研究的热点问题，探讨和构建 一组高效、灵敏且特异性高的血清学标记群，用于综合筛选和诊断早期恶性肿瘤，是一亟待解决的问题。随着人类基因组计划的完成，生命科学开始进入了后基因组时代。恶性肿瘤 在发生发展的各个环节均可追朔到多种基因表达的改变，而这些改变最终都会导 致疾病出现病理变化之前细胞内的蛋白质表达在成分和数量上相应的改变口 9,因此蛋白质组学的研究得到了更加深入的发展。蛋白质组是指一个基因组、一个 细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质20,21。蛋白质组学(Proteomics)是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的 学科。与传统的针对单一蛋白质进行的研究相比，蛋白质组学的研究及其新兴技 术的开展可以采用高通量和大规模的研究手段来筛选特异的肿瘤标志物。血清蛋 白质组学是指研究选定的目标人群中血清中表达的全部蛋白质，在建立正常蛋白 质表达图谱(protein expression map,PEM)的基础上，寻找其差异蛋白质点，鉴定疾病相关蛋白质，进而研究其结构和功能。血清蛋白质组学的研究具有取材 方便简单的优势，并且通过对血清蛋白的动态监测，可以对疾病的诊断、治疗和 预后提供有价值的信息，具有十分重要的意义。目前，蛋白质组学研究的主要技术包括双向凝胶电泳(twodimensional gel electrophoresis,2-DE)技术、以质谱(mass spectrometry,MS)为代表的蛋白 质鉴定技术和生物信息学技术2225。2-DE技术是一种传统的蛋白质分离技术，但由于其不能分离低分子量及低丰度的蛋白，对极酸极碱性蛋白分离困难以及重 复性较差等技术本身的问题，限制了其在蛋白质组学研究中的广泛应用26。蛋 白质分离之后的鉴定是蛋白质组学的重要内容，质谱技术的出现为解决这一问题 带来了巨大的突破，它具有高通量、高灵敏、准确、自动化等特点，逐步成为蛋 白质鉴定的核心技术。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)-2-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究和电喷雾电离串联质谱(ESI-MS-MS)是较多采用的软电离方法，样品分子电离 时可以保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。离子化的肽段因质量电荷比(m/z)差异发生分离，通过测量肽段离子的相关参数，可获得肽质量指纹图谱，通过搜索蛋白质组数据库，实现对蛋白质的定性鉴定。目前也出现一些技术，例 如结合稳定同位素标记方法(iTRAQ),还可进行蛋白质的定量分析(即定量蛋 白质组学)。伴随着人类基因组计划、计算机技术、网络技术的发展而产生的生 物信息学技术也大大的推动了蛋白质组学的发展，在分析2DE图谱及搜索构建 蛋白质组数据库方面发挥着重要作用。本研究以HCC为研究对象，并选择健康人群、慢性肝炎和肝硬化患者作为 对照，应用蛋白质组学的研究方法分析各组间蛋白质表达的差异，以期从蛋白水 平寻找高效、灵敏、特异的血清学肿瘤分子标志物，为筛选和诊断早期肝癌提供 一定的参考依据。参考文献1.Yuen MF,Lai CL.Serological markers of liver cancer.Best Pract Res Clin Gastroenterol.2005 Feb;19(1):91-9,2.Kew MC.Hepatocellular cancer.A century of progress.Clin Liver Dis.2000 Feb;4(l):257-68.3.El-Serag HB,Mason AC,Key C.Trends in survival of patients with hepatocellular carcinoma between 1977 and 1996 in the United States.Hepatology.2001 Jan;33(l):62-5,4.Wright LM,Kreikemeier JT,Fimmel CJ.A concise review of serum markers fbr hepatocellular cancer.Cancer Detect Prev.2007;31(1):35-44.5.Tang,Z.Y.Hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol Hepatol,15 Suppl:Gl-7,2000.6.Peto,J.Cancer epidemiology in the last century and the next decade.Nature,411:390-5,2001.7.Li C,Tan YX,Zhou H,et al.Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma:identification of potential tumor markers.Proteomics 2005;5:1125-39.-3-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究8.Spangenberg HC,Thimine R,Blum HE.Serum markers of hepatocellular carcinoma.Semin Liver Dis,2006;26(4):385-90.9.Collier J,Sherman M.Screening fbr hepatocellular carcinoma.Hepatology.1998 Jan;27(1):273-8.10.Okuda K.Early recognition of hepatocellular carcinoma.Hepatology.1986 Jul-Aug;6(4):729-38.11.Sherman M.Alphafetoprotein:an obituary.J Hepatol.2001 Apr;34(4):603-5.12.Daniele B,Bencivenga A,Megna AS,et al.Alpha-fetoprotein and ultrasonography screening for hepatocellular carcinoma.Gastroenterology,2004,127(5 Suppl l):S108-112.13.Cedrone,A.,Covino,Mr Caturelli,E.,Pompili,M.,Lx)renzeHi,G”Villani,M.R”Valle,D.,Sperandeo,M.,Rapaccini,G.L.,and Gasbarrini,G.Utility of alpha-fetoprotein(AFP)in the screening of patients with virus-related chronic liver disease:does different viral etiology influence AFP levels in HCC?A study in 350 western patients.Hepatogastroenterology,47:1654-8,2000.14.Guo,Q.,Uchida,H.,Matsuo,N.,Nishimura,Y.,Sakaguchi,H.,Nishimine,K”Hirohashi,S.,Ohue,S.9 Nagano,N.,Ohishi,H.,and et al.Study on the evaluation of recurrence of HCC and the effect after transcatheter hepatic arterial embolization-fluctuations in AFP values.Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi,53:195-203,1993.15.Steams V,Yamauchi H,Hayes DF.Circulating tumor markers in breast cancer:accepted utilities and novel prospects.Breast Cancer Res Treat 1998;52:239-25916.Srinivas PR,Verma M,Zhao Y,Srivastava S.Proteomics for cancer biomarker discovery.Clin Chem 2002;48:l 160-116917.Lindblom A,Liljigren A.Tumor markers in malignancies.Br Med J 2000;320:424-42718.Sturgeon C.Practice guidelines for tumor marker use in the clinic.Clin Chem 2002;48:1151-115919.Verma M,Srivastava S.New cancer biomarkers deriving from NCI early detection research.Recent Results Cancer Res,2003,163:72-84.-4-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究20.Peng J9 Gygi SP.Proteomics:The move to mixtures.J Mass Spectrom 2001,36:1083-1091.21.Abbott,A.A post-genomic challenge:learning to read patterns of protein synthesis.Nature,1999,402:715-720.22.Opiteck GJ,Ramirez SM,Jorgenson JW,Moseley MA 3rd.Comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed proteins and proteome mapping.Anal Biochem 1998;258:349-36123.Davidsson P,Westman A,Puchades M,Nilsson CL,Blennow K.Characterization of proteins from human cerebrospinal fluid by a combination of preparative two-dimensional liquid-phase electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry.Anal Chem 1999;71:642-64724.Tragas C,Pawliszyn J.On-line coupling of high performance gel filtration chromatography with imaged capillary isoelectric focusing using a membrane interface.Electrophoresis 2000;21:227-23725.Fenyo D.Identifying the proteome:software tools.Curr Opin Biotechnol 2000;11:391-39526.Dattelbaum AM,Iyer S.Surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.Expert Rev Proteomics.2006:3(l):153-61。一 5 一中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究第一部分ClinProt技术在筛选肝癌血清 早期诊断标记物中的应用前言肝癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，临床上如能对肝癌进行早期诊断 进而早期治疗，可以大大提高肝癌患者的生存率，因此找到一些灵敏度高特异性 强的诊断标志物显得十分的必要。近年来蛋白质组学特别是质谱技术的的发展为 在血清中筛选理想的肝癌早期诊断标记物提供了非常广阔的前景。目前出现的ClinProt系统是一种新的液体芯片-飞行时间质谱技术12,于 2004年由德国Bruke altonics公司开发。该系统可分为磁珠分离系统、质谱系统、分析软件和可选的体液样本自动处理系统四个部分。具体过程为收集疾病组和对 照组的临床体液样本（如血清、血浆、尿液、脑脊髓液等），进行磁珠分离，利 用特定磁珠富集低丰度目的蛋白或多肽，并去除样本中的高丰度蛋白和其他杂 质，分离后得到的多肽样品按一定比例与基质混合后点靶，进行飞行时间质谱测 定作出质谱图，通过软件分析比较疾病组与对照组之间的差异表达蛋白或多肽，得到两者的特异质谱谱图模型，继而据此预测未知样品的归属。ClinProt系统具有以下几个优点：磁珠颗粒小，表面积大，磁珠表面的 特异基团可与血清中特异低丰度蛋白充分接触，俘获的低丰度蛋白或多肽种类 多，从而保证了系统有很好的特异性和很高的重复性；磁珠种类多达十几种，可适用于不同的疾病和蛋白；检测的灵敏度高，一级TOF可测出含量低至 Ifinol的蛋白；可对高丰度的蛋白或多肽进行直接鉴定；可同时比较多组之 间质谱表达差异谱图，并通过多种形式表现；样品处理通量高，操作简便快捷，消耗品价格低，适合临床开展大规模的检验2,3。本研究采用ClinProt系统，检测正常人群、慢性肝炎、肝硬化和HCC各组 的血清样本，根据血清蛋白质表达谱分析各组间蛋白质表达差异，探索具有潜在 诊断意义的血清标志物，检测其是否可用于筛选肝癌早期诊断及血清学诊断的特 一 6 一中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究异标志物，并进一步验证应用该系统对HCC的识别能力。筛选出的差异蛋白进 行 Western Blot和RT-PCR的验证，检验其作为肝癌诊断标志物的能力。第1章材料与方法1.1血清样本的采集处理及其分组信息L1.1试剂及仪器EP管、枪头购自Axygen公司，高速低温离心机购自Sigma公司，微量加 样器购自Gilson公司。1.1.2血清样本的采集与处理在本实验中使用的血清标本均来自2002年至2007年间中山大学肿瘤防治中 心和中山大学附属第一医院的住院病人及体检人群。严格遵从统一的程序和条件 收集、处理和贮存样本，并与供血者签署知情同意书。血清样本采集前未经输血、化疗、介入及手术等治疗。1）在清晨空腹下抽取外周静脉全血5ml,采集到不加促凝剂的采血管中，立 即放于冰上或贮存于4冰箱中，尽快处理。2）25008 49离心10111。3）小心吸取上层血清，移入2管L5mlEppendorf管，溶血标本不予使用。4）将 L5ml Eppendorf 管 10,000g4离心 lOmin,去除残余细胞。5）小心吸取血清，切勿带入血细胞。6）分装入 250pl Eppendorf 管，每管 30p.lo7）分装好的血清每管都要标记样本编号及样本类型，同一份样本装入一个密 封袋中，袋外表面注明样本编号及采集时间。8）分装好的血清储存于-80低温冰箱中。-7-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究9）登记样品抽取时间，样本信息及分装情况。Eppendorf管、枪头经高温高压灭菌后一次性使用，全程在冰上操作，尽量 减少操作时间。1.1.3血清样本分组信息血清样本根据临床特征分为4组：正常组：基本健康，无重大疾病，无肝炎病毒感染，无肝脏疾病史，且无其 他恶性肿瘤。肝脏相关生化检查均在正常范围以内。慢性肝炎组：包括轻至重度慢性B型肝炎，HBs-Ag（+）。临床、生化及影像 学检查均未发现肝硬化及其他肿瘤。肝硬化组：HBs-Ag（+）的肝硬化病人。肝硬化的诊断是建立在临床、生化、影像（超声和CT）及组织学诊断的基础上。肝癌组：原发性肝细胞癌患者。HBs-Ag（+）且伴肝硬化。部分肝癌为术后病 理证实，其余肝癌的诊断建立在超声与CT的影像学诊断基础上。肝癌组按照肝 癌大小可分为三5cm肝癌组和5cm肝癌组。LL3.实验组共150例，包括正常组25例，慢性肝炎组25例，肝硬化组25例，肝癌组75例（其中g5cm肝癌组25例，5cm肝癌组50例）。1.1.3.2验证组共37例，包括非肝癌组22例（其中正常组10例，慢性肝炎组6例，肝硬化组6 例）,肝癌组15例（其中4cm肝癌组5例，5cm肝癌组10例）。一 8 一中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究1.2 ClinProt质谱分析1.2.1试剂 及仪器Cu2+螯合(IMAC-Cu)磁珠试剂盒、弱阳离子交换(WCX)磁珠试剂盒、标准 品peptide mixture和protein mixture购自美国Bruker公司,a-氟基-羟基肉桂酸(CHCA)购自Sigma乙睛(ACN)购自Fisher公司，三氟乙酸(TFA)购自 Fluka公司。检测仪器采用Bruker Ultraflex MALDITOF/TOF质谱仪。分析软件 采用 Bruker 公司的 Fl exAnalysis 和 Clinprotools2.2 oL2.2方法1.2.2.1 Cu2+螯合磁珠(IMAC-Cu)试剂盒操作流程(1)4P冰箱取出磁珠试剂盒，取出铜螯合磁珠悬浮液一管，手动上下摇动，完全混匀磁珠悬浮液，1分钟。(2)取出5gl磁珠加入200禺 样品管，再加入50gl铜螯合磁珠结合缓冲液(BS),将样品管放入磁珠分离器，在前后相邻两孔间反复移动样品管10次(注 意磁珠在管中的运动)。(3)样品管在磁珠分离器上停留20秒，使磁珠富集于管壁。(4)用加样枪小心吸去样品管中的溶液。(5)重复24步骤两次。(6)向样品管中加入20国铜螯合结合缓冲液使磁珠重新悬浮，再加5gl血 清，用加样枪小心吸打至少5次，混匀。(7)室温放置5min。(8)将样品管再放入磁珠分离器静置20秒，使磁珠与悬浮的液体分开。(9)用加样枪吸去悬浮的液体，枪头应避免接触到磁珠，避免吸走磁珠。(10)再向样品管中加入100国 铜螯合磁珠清洗缓冲液(WS),在磁珠分离 器前后相邻两孔间反复移动样品管10次(注意磁珠在管中的运动)。一 9 一中山大学博士学位论文 肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究(11)使样品管在磁珠分离器上静置20秒。(12)用加样枪吸去悬浮的液体，枪头应避免接触到磁珠，避免吸走磁珠。(13)重复10-12步骤两次，最后一次加样枪吸去悬浮的液体时，要保证悬 浮液完全被吸走。(14)从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入10山 铜螯合磁珠洗脱 缓冲液(E S),混匀贴壁的磁珠，反复吸打10次混匀，吸打过程应避免起泡，室温静置5mino(15)样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁20秒，磁珠与洗脱液分离。(16)用加样枪小心将洗脱下来的多肽样品溶液移入干净的0.5ml样品管，可 用于直接质谱分析或冻存-20 24小时之内质谱分析。1.2.2.2 基质液的配制使用3mg/mlCHCA(a-氟基乂-羟基肉桂酸)作为基质液在实验中使用。具体配 制方法：溶质为CHCA,溶剂为50%ACN+2%TFA,配成终浓度为3mg/ml的基 质溶液，在涡旋混合器上充分振荡混匀备用。基质液必须每天新鲜配制。1.2.2.3 点样靶的清洗1)热水冲洗2)丙酮擦洗3)热水冲洗4)80%TFA 擦洗5)热水冲洗6)乙腾擦洗7)蒸储水冲洗8)甲醇冲洗9)室温干燥-10-中山大学博士学位论文 肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究1.2.2.4 样品点靶使用bruker公司普通点样靶，将磁珠分选后洗脱下来的多肽样品点到靶上。每个样本点1山，重复点4次。在室温下自然干燥。点基质在室温下自然干燥后待检测。样品溶液与基质液的比例为1：U1.2.2.5 标准品点靶使用 peptide mixture(1 pmol/p,l)和 protein mixture(4pmol/|il)的混合物作为夕卜标,将二者按1:5混匀后取1闻点靶，待室温下自然干燥后点1似基质。在室温下自 然干燥后待检测。1.2.2.6 质谱分析将点样靶放入质谱仪(bruker ultra Flex TOF/TOF)中，用标准品校正仪器后，检测样品采集信号，激光频率为50hz,每个靶位轰击100下，轰击4个不同区域,也就是100*4=400下。获得由不同质荷比(mass charge ratio,m/z)的蛋白峰构成的 质谱图。1.2.2.7 软件分析将信号分组，导入到分析软件(Clinprotools2.2),进行分析比较。11-中山大学博士学位论文肝癌血清中早期诊断标志物的蛋白质组学研究13组织样本收集及其总蛋白、总RNA的提取及定量1.3.1 试剂及仪器RIPA缓冲液、PMSF购自上海博彩生物科技有限公司，BCA Protein Assay kit 购自 PIERCE 公司，RNAlater,RNAfree 枪头、EP 管购自 Axygen 公司，Trizol Reagent购自Invitrogen公司,DEPC原液购自Amresco公司,氯仿，异丙醇，无 水乙醇购自购自广州威佳科技有限公司O水浴箱购自上海一恒科学仪器有限公 司，紫外分光光度计购自Eppendorf公司，高速离心机购