特发性血小板减少性紫癜患儿血清生物标志物的蛋白质组学研究.pdf

硕士学位论文特发性血小板减少性紫瘢患儿血清生物标志物的蛋白质组学研 究特发性血小板减少性紫瘢患儿血清生物标志物的 蛋白质组学研究摘要目的：特发性血小板减少性紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是自身免疫性疾病，是小儿最常见的出血性疾病，急 性血小板减少性紫瘢和慢性血小板减少性紫瘢早期并不能鉴别诊断，对于急性血小板减少性紫瘢用药后其预后如何，临床上均难以判断。我们用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术结合蛋白芯片检测急性ITP,慢性ITP及正常儿童血清蛋白质谱 的差异性表达，筛选可用于特发性血小板减小性紫瘢早期诊断及分 型、病情变化监测及判断预后的血清蛋白质标志物，建立ITP诊断模 型并验证，在血清蛋白质组水平创立特发性血小板减小性紫瘢的分子 诊断新方法。方法：应用SELDI-TOF-MS检测结合在蛋白质芯片上的 血清蛋白质，获得25例急性ITP,10例慢性ITP,25例正常对照者 血清 蛋白表达指纹 图谱，并用Biomarker Wizard和 Biomarker Paterns System 5.0软件对数据进行分析，建立人工神经网络诊断 模型。结果：在分子质量/电荷比值(质荷比，mass electron ratio,M/Z)为200020000范围内，在质荷比为100020000范围内，特发 性血小板减少性紫瘢组与正常对照组之间有显著差异(P 0.01)的蛋白质峰有31个，其中高表达的蛋白质峰有6个,低表达的蛋白质峰有 25个，从分析的结果看最有意义的蛋白质是质荷比为4121.27 5327.56 5890.56 的蛋白质可以看成其ITP的血清生物标志物；急 性血小板减少性紫瘢组与慢性血小板减少性紫瘢组间有显著差异(P 0.01)的蛋白质峰有9个，高表达的蛋白质峰有7个，低表达的蛋白 质峰有2个，从分析的结果看最有意义的蛋白质是质荷比为3930.39 6097.56的蛋白质，可以看成是慢性ITP的血清标志物。在蛋白质库 中搜索与上述M/Z值相对应的蛋白质，乂/2是3930.39的标志物在 蛋白质库中未发现，可能为新蛋白质.分别运用其血清标志物进入人 工神经网络组合的诊断模型，可将ITP组与正常儿童准确分组，灵敏 度为100%,特异度为100%；而对急慢性ITP的诊断模型其敏感度是 92.9%,特异度833%。结论：1.特发性血小板减少性紫瘢(ITP)与正 常儿童血清蛋白质组学水平有显著差异；2.急性血小板减少性紫瘢与 慢性血小板减少性紫瘢血清蛋白质组学水平有显著差异；3.质荷比为 4121.27 5327.56 5890.56的蛋白质组合的诊断模型，能将ITP与 正常儿童完全准确的区分开，提示该蛋白质可能是ITP的血清生物标 志物；其中5327.56可能是新的蛋白质。4.质荷比为3930.39 6097.56的蛋白质组合的诊断模型，能将ITP组准确分型，其提供的差 异蛋白有助于了解急慢性ITP间临床和生物学特征差异的分子机制，并为药物靶向性治疗提供了可能，提示该蛋白质可能是慢性ITP的血 清生物标志物。5.SELDI-T0F-MS技术是寻找疾病相关性蛋白质的有 效工具。2关键词：特发性血小板减少性紫瘢；表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱；蛋白质组学；生物标志物；人工神经网络Study on proteomics of the serum biomarker from children with ITPAbstract Objective:Idiopathic Thrombocytopenic Purpura(ITP),an autoimmune disease,is the most common hemorrhagic disease among children.Acute thrombocytopenic and chronic thrombocytopenic can not be distinguished or diagnosed at the early stage,therefore significant biological marker is in short in the prognosis of medication for acute thrombocytopenic.The technology of Surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS)was adopted with protein chip to test the differential expressions among acute ITP(AITP),chronic ITP(CITP)and the serum protein spectrum from normal children.Serum protein maker was sieved for both the early diagnosis and grouping of ITP,monitoring change in condition and the prediction of prognosis.A diagnostic model for ITP was constructed and authenticated,thus a new method of molecule diagnosis based on the level of serum protein,was finally established.Methods:SELDI-TOF-MS was applied to test the serum protein combined with the protein chip.25 cases of acute ITP,10 cases of chronic ITP,25 finger prints of serum protein from the control group were collected.Biomarker X zard and the software of Biomarker Patterns System 5.0 were applied to analyze the data and a diagnostic model is established.Results:Withinthe range of mass electron ration(m/z)of 200020000,and the range of m/z of 1000-2000,when a contrast was made between the ITP group and the control group,31 protein peaks were statistically significant(p0.01),6 peaks of which were of high expression and 25 with low expression.The most significant protein was that with the m/z of 4121.27 5327.56 5890.56,which could be recognized as serum biomarker for ITP.9 protein peaks were found statistically significant(p0.05)2.SELDLTOF蛋白质芯片仪的组成及工作原理美 国 Ciphergen 生 物公司 生产的 SELDI-TOF MS(surface enhanced laser desorprion/ionization-time of flight mass spectrometry)主要包括四个基本部分。2.1特殊材料制成的固相载体，即蛋白质芯片阵列(proteinchip array):蛋白质芯片阵列呈lOrnin宽、80mm长的条索状外形，其中包含着 8 16个直径为2mm的圆形孔斑，亦被称为芯池(见图1)。图1：蛋白质芯片阵列(Figure 1:proteinchip array)12组成芯池的特殊材料是根据要捕获蛋白质的属性而设计的，概括 起来可归纳为两大类型:化学型材料;生物化学型材料。生物化学 型材料表面被习惯性地做为开放性准活化平台，可以粘附预设计的诱 饵分子，根据特定的分子识别机制(如抗原一抗体、酶一酶作用物、受体一配体及蛋白质一DNA等相互作用)，亦可选择性地从样品中捕 获目的蛋白。化学型平台则是利用蛋白质的疏水性、亲水性、电荷特 性及金属离子等普通属性设计而成，它可以使粗提液或样品中同一属 性的蛋白质结合到芯池表面(如图2)o化于衣面，由t 7K白勺 滓，尺白勺+4 勿衣(Tfl=肝丫 I|打L体 DMAU阳启广自勺I M/J 二营彳为图2:蛋白芯片表面化学成分(Figure 2:The displayed ectochemistry composition of proteinchip)2.2蛋白质芯片解读仪(proteinchip reader)蛋白质芯片解读仪是安装有脉冲式紫外线/氮激光光源的解析离 子化(laser desorption ionization,LDI)时间一飞行质谱仪(TOF MS)o计算机以每秒IX ICT Hz的速度从所获得的原始数据快速精确 的绘制出蛋白质质谱图。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋 13白质质荷比。结合在芯片上的蛋白质在激光的轰击下电离，带有电荷 的蛋白质在加速电场作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空 管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比（M/Z）与离子飞行时间 的平方成正比。蛋白质的相对含量 带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的 一瞬间，电子倍增将产生的瞬时电流转换成蛋白质的相对含量。（如 图3）positive charge on Betel chipProteinChip Array wi tli cryxtalli zed protein s5jnpl erri i rr orco OSr,er pr t e i ns tly tester irid hi t the detector first（图3）2.3蛋白质芯片软件控制分析系统（Proteinchip Software）SELDI蛋白质芯片仪可以加速比较蛋白质组学的研究进程。以 往蛋白质的研究多采用色谱纯化、二维电泳、质谱定量定性等分析化 学的研究技术。运用这些手段进行研究所必需的技术条件要求高，仪 14器昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适应于大规模的复查和临床检测。SELDI-TOF-MS技术是在基质辅助激光解析及离子化(Matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)的基础 上发展而来的，可直接从原始的样品中进行捕获、检测与分析,敏 感性高(检测范围为150 fmole蛋白质)，检测范围广(0.5500 Kda),所需样品体积小(0.5-400 u 1);检测简便：整个测定过程一 般可以在30 min内就全部完成，迅速且敏感，特异性高，同时不会 破坏所测定的蛋白质；有可靠的重复性。蛋白质芯片软件控制分析系统，使整个操作过程变得自动化、简 捷化、人性化。利用Software通过电脑显示屏上出现的对话框就可 以对实验进行控制操作，并对所得的数据进行分析、统计。软件控制 分析系统不断处于研发过程，目前所用的软件系统为proteinchip software 3.11版本，它主要包括：数据库的建立；内部信息及外 部信息的校准；通过PCIB设备采集数据，得到蛋白质的相对含量和 质荷比。2.4数据分析系统包括Biomaker Wizard 和 Biomarker Pattern 两个软件。前者 是一个较为简单的统计学软件，它用方差分析对Proteinchi software得到的数据进行初步的统计学分析，计算蛋白质均值、标 准差和P值，并对BP人工神经网络提供数据，建立神经网络诊断模型。2.4 BP人工神经网络原理人工神经网络(Artificial Neural Network,ANN)亦称为神经网络（Neural Networks,NN），是模仿脑神经系统处理信息智能问题 的一种大规模并行非线性处理系统，它根据数据本身的内在联系进行 建模，具有良好的适应性、自学习能力和较强的抗干扰能力，主要应 用于计算机智能决策系统，以提高计算机感知能力的预测精度。20 世纪80年代由D.E.Rumelhart和J.L.Me CleUand及其研究小组 开发设计出来的BP网络，目前已成为应用最广泛的神经网络之一。BP网络是一种反向传递并能自行修正误差的多层映射网络，不仅可 以逼近任意一个连续函数，而且能够收敛到较小的均方差。一般而言，对问题的机理不甚了解或不能用数学模型表示的系统，如故障诊断、特征提取和智能预测等问题，神经网络往往是最有利的工具，可以克 服传统分析过程选择具体函数形式的困难，是一种自然的非线性建模 预测过程，具有极大的灵活性和自适应性。基于误差反向传播算法（BP 算法）的多层前馈神经网络通常由一个输入层、若干隐含层和一个输 出层所构成，其拓扑结构如图1-3所示。在BP神经网络模型中，各 层次的神经元之间互相连接，同层次内的神经元之间没有连接。按照 神经元的输入输出特性，BP神经网络通过反向传播学习算法进行网 络的训练，其信号处理主要由两部分组成，即正向传播与反向传播。当学习样本送至输入层，经过隐含层运算后传至输出层，此结果若与 期望值存在误差，则计算该误差值，然后输入误差反向传播阶段，沿 着原来的连接从输出层返回到输入层，并逐层调整连接权重值w,以 使误差达到最小（如图4）16识差反向传播入层,层 层2倍息正向传播-图4 BP人工神经网络的拓扑结构(Figure 4：The topological structure of the BP artificial neural network)3实验设备和耗材Cl)96孔细胞培养板(FALCON,USA)(2)电子天平(BD202):(METTLER TOLEDO 公司)(3)eppendof 管，(BD 公司)(4)TY-B型多动摇床：上海新波无线电厂(5)PH 仪，(HANNA 公司)(6)BD真空抽血管(不抗凝)(7)-80 C冰箱：海尔公司(8)蛋白质芯片：C iphergen公司(9)蛋白质芯片时间质谱分析仪(PBS II C)(美国CiphergenBiosystems)(10)高速台式离心机(型号5415D)：(Eppendorf 公司)4实验试剂17(1)去离子纯净水：HPLC H20(Fluka,德国)(2)无水醋酸钠 Sodium Acetate(Sigma)(3)磷酸缓冲液 PBS Buffer(10X)(Sigma)(4)尿素 Urea(Sigma)(5)3 一环乙胺一1一丙磺酸 CHAPS(Sigma)(6)芥子酸 Sinapinic Acid(Sigma)C7)乙睛 Acetonitrile(Sigma)(8)三氟乙酸 TFA(Sigma)(9)二硫苏糖醇 DTT(Sigma)(10)盐酸Tris-HCl(Sigma)(11)氢氧化钠 NaOH(Sigma)5实验样本的收集和保存5.1血清样本：清晨空腹抽血，用BD真空抽血管(不抗凝)采集2-5ml血液，半小时内放入4冰箱保存，并在4小时内在4下3000转离心5分 钟。取上清液加入eppendof管。再次3000转离心5分钟，0.25ml eppendof管分装，150ul每管，放入-80冰箱保存，每个样本至少 三管以上。离体血清样本4小时以内，应放入-80保存。期间所有操作均 在冰上进行操作，所有样本保证只冻融一次。注：样本不能有溶血，不能将下层的细胞吸入，不能吸入上层油脂。185.2、样本材料准备：所有样本应该按统一的样本资料单填写。样本应具备资料：(1)年龄、性别，(2)病理诊断(分型)，(3)治疗方式(有无治疗，放化 疗)等，(4)住院号，病理号等。6实验试剂的配制方法(1)U9(9M Urea,2%CHAPS,1%DTT),总量 5ml:先用 2nli 左右 去离子水溶2.7g Urea(尿素)，(若太慢可加热到37度以下),完全溶 解后再加 0.lg CHAPS,0.05g DTT,定容到 5nli。其它用 0.5ml 管 100ul 分装后-20保存。(2)乙酸钠(pH4.0,50mM):总量500ml取2.05g乙酸钠到烧杯 中，加水到450ml调pH到4.0(用sigma HCL),500ml容量瓶定容 到 500mlo(3)Tris-HCl(pH 9.0,50mM):总量 500ml 取 Sigma Tris-HC1(pH 9.0)稀释到 50mMo(4)半饱和介子酸(SPA)(配50%乙氟，0.5%三氟乙酸(TFA).溶液200ul,用100ul加入到含过量SPA粉剂中，震荡，13000rpm离 心2分钟，取上清，用配好的溶液再稀释一倍(避光保存，当天用，不过夜)。(5)磷酸盐缓冲液 PBS(Sigma 10X)：10mM总量500ml稀释10 倍(6)乙酸钠(pH4.0,100mM)总量 100ml。7实验方法197.1实验设计：我们选取的芯片为弱阳离子芯片(CM10)。每个模型建模时要求将 所有样本(阳性和对照)混排，所有样本均用excel中的RAND函数 随机排列，每个芯片放7个样本，一个混合对照血清(混合对照血清 在芯片上也随机排列)，并在每个模型中加入一个空白对照(以去离 子水代替样本)。7.2芯片处理：(1)取样本，冰上融解(30分一 1小时)，lOOOOrpm 4离心2 分钟。Z(2)按实验设计的顺序排列好样本(冰上)。(3)取96孔板细胞培养板，放冰盒上，用10ul枪在每孔上加 10ul U9(9M Urea,2%CHAPS,1%DTT),每孔分另 U 再力口 5ul 血清(直 接用力打出，贴壁，不碰底，不吹吸；)，放入层析柜4,600rpm振 荡30分钟。(4)在还剩15分钟左右上芯片，记下芯片号，用排枪加200ul 50mM pH 4.0 NaAC,在层析柜中600rpm,5分钟，拍干，重复一次。(5)U9处理后96孔板放冰上，用排枪快速加入185ul NaAC(垂 直用力打出，不碰底，不吹吸，层析柜中600rpm振荡2分钟左右混 匀。(6)用排枪加100ul处理好的样本到芯片上，快速加，用手轻拍 加样板去除气泡，还有气泡的用枪头吹吸。层析柜40c 600rpm振荡 1小时。20(7)加200ul NaAC 600rpm 5分钟3次(常温)。甩掉，用力 拍干。(8)快速加HPLC水200ul 2次，甩掉，用力拍干。(9)干后用半饱和的介子酸SPA lul,5min后再点lul。(10)上机检测。8质谱检测8.1仪器调校：每次实验之前分别用all in one peptide和all in one protein调整仪器，用标准的calibrate protocol 方案调校(根 据all in one芯片定)。8.2用标准血清芯片确定仪器的开始激光强度并记录。(1)设置检测最高范围到100000 Daltons,优化范围为：2000Daltons 到 20000 Daltonso(2)设置开始激光强度为230。(3)设置开始检测灵敏度为10。(4)集中在优化中心。(5)设置从分子量为1000 Daltons开始检测。(6)用定量的方法获取数据。(7)设置Seldi参数值为20,开始值为20,结束位置为80,每个 位置5次平均(8)设置预热位置及打击强度。(9)用调出STD protocol low的设置，并用手工打标准芯片A spot，调整laser intensity使average谱的最高峰到50%强度左右(见下21图）确定laser intensity的参数ne用STD protocol low打标准芯片，normalize并初步计算强度变异系 数CV值（10-20个峰），计算各组的组内实验CV（15%以内）和组间实 验CV（20%以内），若不通过则调整各自仪器的detector voltage、intensity和sensitivity,并重新检测质谱，通过则继续下一步（每 次实验之前必须做这两步）。9蛋白质组鉴定将所检测到有显著差异蛋白质峰质荷比值异蛋白质峰质荷比值输 入蛋白质数据库，得到与这些蛋白质峰质荷比值相对应的蛋白质。操 作步骤如下：输入如下蛋白质库名称：http:/us.expasy.org/tools/tagident.html-*进入该网站在“Mw”项的方框中输入质荷比值，点击“Start Tagldent出现与输入质荷比值相对应蛋白质。10统计学分析应用 Biomarker Wizard 和Biomarker Pattern 两个软件对检测 数据进行分析。前者是一个较为简单的统计学软件，它用方差分析对 Proteinchip software得到的数据进行初步的统计学分析，计算蛋白 质均值、标准差和P值，并对BP人工神经网络提供数据，建立神经网 络诊断模型。22结 果1.蛋白质波峰检测结果通过SELD工-TOF质谱仪对结合在蛋白芯片上的蛋白质进行检测，获得到所有25例急性特发性血小板减少性紫瘢，10例慢性血小板减少 性紫瘢及25例对照的血清蛋白指纹图谱。然后对以上检测到的血清的原始蛋白质指纹图谱标准化后，用 Biomarker patter软件分析，质荷比为020000的范围内共检测到的 差异蛋白质峰经过对比分析T检验，我们可以发现：1.1 特发性血小板减少性紫瘢组与正常对照组间比较特发性血小板减少性紫瘢组与正常对照组之间有显著差异（P 0.01）的蛋白质峰有31个，（见表1,图8）,从图6中我们可见ITP组中高 表达的蛋白质峰有6个，低表达的蛋白质峰有25个，从分析的结果看 最有意义的蛋白质是差异最显著及P值最小（为0）的蛋白质是质荷比 为4121.27 5327.56 5890.56 的蛋白质。1-2急性血小板减少性紫瘢与慢性血小板减少性紫瘢组间比较急性血小板减少性紫瘢组与慢性血小板减少性紫瘢组间有显著 差异（P -.IQ工41Q1CDtfdOE7/nr nr 一.*-*-*-一 一 *!一 一4Z7ZT-=-i a工3L M 1TT181K*CD.1CKK3C 1SCCD-j-I j i-i-IzjdJULzXizzzzzb:T93IIO图5-124M_LMM_UMM_fk i d 4-U-SOJU 1 1OEEK 1S5CCD_ E I i 一SOZK3.1CKKK 1SK3LuMcLj kJLwudZ二）zSQOeJ tot EKi一 J z、-.一4一-K-a112113114115I1&ii a119图5-2.so=K3|imnc_Lij L Kl LZZ12025X21工NN123HN4I2S2627 二二-r2.未发现对应蛋白质，可能为新的蛋白质50S核糖体蛋白L3650S ribosomal protein L3650s核糖体蛋白L3550S ribosomal protein L3530s核糖体蛋白S1130S ribosomal protein S11碳甘酸酶轻链 Carbonic anhydrase 1small chain50s核糖体蛋白L1750S ribosomal protein L17Mb2626 蛋白 protein Mb26264.实验的重复性为保证实验的重复性和芯片间及不同批次实验数据间的可比性，在每张芯片上都设1个“内参”，即将10个对照样本等量混合后分装（标记为Nmix）,并在每一张芯片的8个点中随机选出一点以Nmix 做平行试验，并以不同批次实验中Nmix的明显蛋白质峰的平均值 校正不同批次、不同芯片间的差异。不同芯片上Nmix特征蛋白质峰 间具有较强的重复性（图8）。37图10同一血清样本在不同芯片上测验到的蛋白质质谱FigurelO:The protein mass spectrum on different array from same serun sample38讨论特发性血小板减少性紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是小儿时期常见的出血性疾病，患儿在发病前常有病毒 感染史。目前认为病毒感染不是导致血小板减少的直接原因，而是由 于病毒感染后使机体产生相应的抗体，这类抗体可与血小板膜产生交 叉反应，使血小板受到损伤而被核-巨噬细胞系统吞噬和破坏，使血小 板的寿命缩短，导致血小板减少。患者血中血小板相关抗体(PAIGG)含量多增高。研究证实，辅助性T细胞(TH)和细胞毒T细胞(CTL)的活化 及相关细胞因子紊乱是导致本病慢性化过程的重要原因。现已知道，血小板和巨核细胞有共同抗原性，抗血小板抗体同样作用于骨髓中巨 核细胞，导致巨核细胞成熟障碍，巨核细胞生成和释放均受到严重影 响，使血小板进一步减少。本病见于各年龄时期小儿，多见于广5岁小 JL,男女发病数无差异，春季发病数较高，急性患儿发病前广3周常有 急性病毒感染史，如上呼吸道感染，流行性腮腺炎，水痘，风疹，传染性 单核细胞增多证等，也偶见于免疫接种之后。大多数患儿发疹前无任 何症状，部分可有发热，以自发性皮肤和黏膜出血为突出表现，多为针 尖大小的皮内或皮下出血点，或为瘀斑和紫瘢，少见皮肤出血斑和血 肿。分布不均，通常以四肢为多，在易于碰撞的部位更多见，常伴有鼻 出血或齿龈出血，胃肠道大出少见，偶见肉眼血尿。青春期女性患者可 有月经过多，少数患者可有结膜下出血，颅内出血少见，如一旦发生，则预后不良.出血严重者可致贫血，肝脾偶见轻度肿大，淋巴结不大。目前ITP的诊断很大程度上仍属临床排除诊断。临床上诊断主 39要靠外周血小板减少但其无特异性；而骨髓检查创伤性大，患儿及其 家属不易接受；早期的血小板聚集试验由于敏感性和特性低早也被 淘汰。20世纪70年代建立的PAIg测定法由于不能区分血小板表面糖蛋 白特异性自身抗体和非特异性结合于血小板表面的Ig,而且不能鉴别 免疫性血小板减少性紫瘢非免疫性血小板减少性紫瘢，尽管敏感性较 高，但特异性低，临床上对ITP诊断的实用价值不大，一般仅作初筛 试验。20世纪80年代末建立的GP-specific Ab检测法是辅助诊断 工TP的重要方法.常用方法包括免疫印迹法(immunoblot assay)、免 疫 沉淀法(immunoprecipitation)和 血小板 糖蛋白 固定法(glycopbi 1 ization immobilization assay)。前 两种方法较为繁 琐，不太适合临床检测，而且敏感性较低；血小板糖蛋白固定法 在鉴别免疫性和非免疫性血小板减少性紫瘢方面具有较大临床实用 价值，主要包括：微滴定孔法(microtiter well assay),为一间 接抗体检测法，敏感性较低(3屐 30%)；免疫磁珠法(mmunobeed assay),敏感性可达58%75%；改良抗原捕获酶联免疫吸 附 法(modified antigen-capture enzymelinked immunoabsorbent assay,MACE),敏感性与免疫磁珠法相当；血小板抗原特异性单抗 固定法(monoclonal anti body-spec i f i c immobilization,MAIPA),敏感性 49%66%o PAIgG检测法(PAIgG characterization assay,PAICA),敏感性40%70%。目前免疫磁珠法和MAIPA应 用相对较多。阳性结果有助于ITP的诊断但阴性结果不能排除诊断o总之，目前尚无一种简便实用、敏感特异的ITP血清学检测方40法，可以早期诊断及分型ITP而且由于血小板GPspecific Ab也存 在于部分非免疫性血小板减少症患者(如MDS、淋巴瘤、白血病和慢 性肝病等)，因此GP-specific Ab的检测对ITP的诊断不具有特异 性，而且各种检测方法的敏感性有待进一步提高。因此我们需寻 求一种血清蛋白标志物为ITP的患儿的临床病情判断早期分型，预后 估计，制定个体性的治疗方案提供依据。蛋白质组学的出现和发展极大地推动了疾病生物标志物的研 究，可以从整体水平对一个细胞，一种组织中所包含的全部蛋白质进 行时间和空间上的动态研究每种疾病在不同的发病阶段，在任何症 状出现之前，在蛋白质水平方面已经发生了变化。各种疾病都有蛋白 质谱的动态变化。而这些被确认在早期发生变化的蛋白质都有潜力发 展成为临床早期诊断指标切。新近出现由2002年诺贝尔化学奖得主 田中(Tanaka)发明，赛弗吉(Ciphergen)系统生 物公司制造的SELDI TOF MS蛋白芯片技术，以其操作简单，方便快捷，样本需要量少，敏感性高，特异性强及高通量等特点，在癌症、老年病、传染性疾病、心血管病和神经系统疾病等早期准确诊断上取得了引人瞩 目的成果，给诊断学带来一场革命或革新，大大改变目前一些疾病如肿瘤、传染性疾病等诊断落后的情况。并在血液系统疾病中得到了广泛的运 用.在基础方面Kern的等研究肿瘤坏死因子亚家族BAFF(Bcell activation factor of the tumor necrosis factor family)在慢性 淋巴细胞白血病的发病机理时运用蛋白质芯片技术使BAFF在慢性淋 巴细胞白血病的发病中的作用被认识。这能启发我们探索新的治疗方法例如给患者注射BAFF抗体或可溶性的BAFF受体；Joshi的等使 用蛋白芯片技术研究造血机制时发现，用SCF刺激造血时P物质增多,但随后P物质的裂解产物SP(14)也增多。由于SP(14)的量微小，一般技术很难检测到，蛋白芯片技术使这一问题迎刃而解；Cochran 等研究提示依据机体是否存在IgVH高突变CD38高表达可将慢性淋 巴细胞白血病分为不同亚类。高通量功能蛋白质组学方法可用于研究 蛋白质与蛋白质之间交互作用，而双向电泳质谱飞行技术已被用于鉴 定转录因子调节靶蛋白在髓系分化和白血病中的重要作用Hegedus 等闻 利用蛋白质组学分析儿童白血病中急性非淋巴细胞白血病与急 性淋巴细胞白血病细胞的蛋白质表达谱差异提示差异蛋白质将有助 于了解急性非淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病间临床和生物 学特征差异的分子机制。Juan】等结合微芯片蛋白质组，生物信息学 方法，明确了影响白细胞介素-60分化的调节基因和蛋白质信息.运 用蛋白质组学分析血清的特异蛋白质来对急性白血病进行筛选和诊 断.有研究应用蛋白质组学研究发现GDP解离抑制因子2和其他蛋白 质组可对急性白血病进行诊断和鉴别的Oveland等.认为蛋白质组学 可以对骨髓来源的恶性肿瘤进行可靠的诊断和分型，认为酪氨酸激 酶信号途径的改变是慢性粒细胞白血病发病的重要原因。蛋白质组学技术虽然广泛的运用于血液系统疾病，但是绝大多数 是运用于肿瘤标志物的早期筛查，而国内外对蛋白质组学运用于特发 性血小板减少性紫瘢的研究仍然是空白。我们利用SELDI技术设定参数分别对急性ITP,慢性ITP及正常 42对照三组血清所得的质谱图进行分析，发现：1.特发性血小板减少性 紫瘢组与正常对照组之间有显著差异（P 0.01）的蛋白质峰有31 个，ITP组中高表达的蛋白质峰有6个，低表达的蛋白质峰有25个，说 明这些低表达的蛋白质可能为特发性血小板减少性紫瘢的一些蛋白 受到抑制，而其高表达的蛋白质可能为其ITP中的一些抗血小板的抗 体所表达。而其P值最小（P为0）的蛋白共有3个我们认为是最有 意义的蛋白，可能为ITP的生物标记物，其中M/Z是5327.56的蛋白 质在蛋白质库中未发现与它相对应蛋白质，可能为新蛋白质。以往有 不少研究表明有细胞免疫异常在ITP的发病机制中有很重要的功能，这些受到抑制的蛋白质可能是因为在ITP时一些含量降低的细胞因 子，进一步分析和鉴定出这些蛋白质分子有助于进一步研究ITP的发 病机制。2.慢性血小板减少性紫瘢组与急性血小板减少性紫瘢组间 有显著差异（P0.01）的蛋白质峰有9个，所有这些蛋白质峰均包含 在ITP组与正常对照组之间的差异蛋白质峰中，其中，低表达的蛋白 质峰有7个，高表达的蛋白质峰有2个，说明在慢性ITP中一些蛋白 质的含量比急性ITP更为减少，同样的我们也把其P值最小的蛋白质 认为是最有意义的蛋白，可能是其慢性工TP的血清标志物，而 M/Z 是3930.39的蛋白质在蛋白质库中未发现与它们相对应蛋白质，可能 为新蛋白质。我们研究这些蛋白质对揭示慢性ITP的发病机制奠定基 础，并可对慢性ITP新药开发提供靶标。3.我们分别选用ITP慢性 ITP的血清标志物通过BP神经网络建立ITP诊断模型及分型模型，其诊断模型诊断ITP的灵敏度100%,特异度100%；而分型模型鉴别 43急慢性ITP的灵敏度为92.9%,特异度83.3%o由于我们本次实验统计 例数较少，在大样本实验中尚未得到进一步的验证结果，需要进一步 实验研究来验证。如果我们能建立一个多中心的协作组，长期随访 ITP的病情变化与患儿血清中这些蛋白质质谱的变化关系，能够证实 这些蛋白质是其血清标志物，那我们就发现一种新的、更简单的早期 诊断及分型方法，为有效预测与评估特发性血小板减小性紫瘢的病情 提供一种更敏感更简捷可靠的无创伤检测方法。从而在血清蛋白质组 水平创立特发性血小板减小性紫瘢的分子诊断新方法。当然SELDI-TOF-MS也并非完美无暇的技术，对于不同的样本，根 据检测的目标不同采取一种或几种芯片，理论上可以把所有的相同性 质蛋白质捕获，实际上仍有少量的分子没与表面探针结合。使用 SELDI-TOF-MS系统，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的 序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用 蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋 白质序列所闻。除此之外，SELDI-TOF-MS系统还存在以下缺陷：并 非所有的蛋白质都能同等被显示，分子量低于30kDa的蛋白质能被很 好检测，高于此分子量的蛋白质其敏感性明显下降。蛋白质动力学 方面的影响，如血清蛋白质组是高动力性的，其中各蛋白质浓度相差 巨大，高丰度蛋白质的出现干扰了低丰度蛋白质的定量和定性检测，因此面临一个将高丰度蛋白通过有效的预先分储分离手段改善低丰 度蛋白的检测问题。蛋白质峰强度某些情况下受蛋白质与芯片结合 力强弱的影响，也很难依此进行蛋白质的准确定量。虽然SELDI 44系统是一种高通量技术，但系统都为人工操作，从样本的储存、处理，缓冲液的配制，参数的设定等，各实验室均不完全相同，难免影响检 测结果。标记物蛋白质的仍然依靠传统的方法浓缩或分离，依靠MS 等可靠性及准确性更高的装置鉴定，目前有此条件的单位并不多，另 外，该芯片及设备和分析软件等费用均较昂贵，且分析质谱需要大量 后续工作支持等都限制了该技术的进一步推广应用。尽管目前 SELDITOF-MS蛋白质芯片系统存在许多不足，但至今仍是高通量系 统检测蛋白质多样性质的唯一技术平台，利用这个技术平台结合生物 信息学的方法对与肿瘤诊断、预后和对特异治疗方法的反应等相关蛋 白质谱的研究将可以找到可用于肿瘤临床诊断、预后及判断不同治疗 反应的特异蛋白指纹谱，临床医师对疾病的诊断和分类将不再仅仅依 赖于传统的组织病理学方法，疾病治疗方案的制订也将更加科学，对 疾病预后的判断也更加准确。随着蛋白芯片技术及设备的进一步