抗肿瘤活性物SYUIQ-5在大鼠体内的药动学研究.pdf

博士学位论文抗肿瘤活性物SYUIQ-5在大鼠体内的药动学研究The pha rma cokinetic study of a novel a nti-tumor compound SYUIQ-5 in ra t抗肿瘤活性物SYUIQ-5在大鼠体内的药动学研究 摘要近年来，随着生命科学技术，化学，计算机技术以及高通量筛选技术的快速 发展，先导候选药的发现量大大提高。遗憾的是大约只有10%先导候选药能够 进入临床并最终进入市场，其中约40%是由于不良的体内药动学性质而成为高代 价的淘汰者，这足以说明如果能预测创新先导候选药的药动学特点，将能极大降 低药物研发的费用，提高成功率。所以，在药物研发过程中，药动学研究应早期 参与，在围绕先导化合物进行系列化合物的合成和筛选的过程中，可以与药物的 设计合成、药效及毒理学评价密切配合，从药动学的角度，对具有代表性的先导 化合物进行分析，了解其初步的药动学性质和特点，通过比较化合物结构、代谢 与药理毒理作用之间的关系，为创新药物的结构优化、药效和毒理评价提供参考 资料，同时也有助于其作用机理的阐明。为此，对药物药动学的研究已成为新药 开发的一个重要组成部分。口服给药以其安全、有效、经济、便利的特点，成为临床给药的首选给药途 径。如果药物的口服生物利用度低则不仅导致个体间和个体内血药浓度波动大，同时也增加生产成木，增大机体毒性的可能性，所以具有良好生物利用度的口服 药物制剂的开发已成为药学界的研究重点。大量有药理活性的化合物的出现，迫切需要能从实验和理论方面预测药物口 服吸收特点的体外模型。近年来，在包括药学界在内的很多领域，Caco-2细胞 模型被广泛应用于预测候选药物的吸收特点。Caco-2细胞一般培养在半透膜上，I抗肿瘤活性物SYUIQ-5在大鼠体内的药动学研究能在培养液中分化成融合的单层细胞，其结构和功能与小肠上皮相似，使用 Caco-2细胞研究药物的转运特点时，操作简单，所需药量少，所以在新药开发 早期，Caco-2首选作为口服药物的体外筛选工具，获得的信息对合理确定候选 药的结构优化，临床给药方案及指导制剂的处方设计都有重要意义。随着现代医药的发展及治疗的需要，绝大多数患者几乎都存在多药并用的情 况，所以药物相互作用所致的不良反应日趋严重。在1980-1998年的近20年里，PDA先后将其批准问世的13种新药从市场上撤出，这是因为陆续发现了未预料 的严重不良反应，另一个重要原因就是与其它药物合用后，发生了严重的代谢性 相互作用。药物相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用两大类。代 谢性相互作用(met abol ic in t e r act ion)发生率最高，约占药动学相互作用的40%，临床意义更为重要，其中，96%的代谢性相互作用由细胞色素P450介导。抗 高血压和抗心绞痛药咪拉地尔(mibefr adil),抗组胺药特非那定(t er fen adin e),感冒药中常用成分苯丙醇胺(ph en yl pr opan ol amin e)等，就是由于在细胞色素 P450代谢水平上的药物相互作用而遭淘汰。P450是参与众多外源物(药物、环境污染物、致癌物等)和内源物(类固醇 激素、维生素、胆汁酸等)在体内代谢，失活和活化的重要酶系，主要存在于肝 微粒体中，是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工嗨，目前在所有物种 中已发现480多个P450同工酶基因。CYP催化外源物的代谢具有范围广、专一 性差、结构差别大、个体差异大、催化底物有交叉重叠性以及易受诱导和抑制等 特点。所以，当多种药物联合用药时，有可能导致其中一种药物发生代谢障碍或 加快代谢速度，发生毒副反应或药物无效。因此，在新药研究过程中若能获得药物代谢酶选择性催化作用信息和代谢作 用机理以及药物对酶的诱导或抑制作用，则可预测药物在体内发生相互作用的可 能性，从而大大减少上市后因可能严重相互作用而被淘汰的巨大风险，对临床安 全、合理、有效用药，避免不良反应具有重要的指导意义，同时也为新药的分子 设计提供思路和依据。SYU1Q-5是由中山大学药学院最新合成的呷睬喳琳类衍生物，具有诱导染 色体端粒的-TTAGGG-重复序列形成稳定的G-四链体的作用，SYUIQ-5能抑制 人白血病K562细胞和人结肠癌SW620细胞中的端粒酶使端粒变短，从而使癌-IIThe pha rma cokinetic study of a novel a iiti-tumor compound SYUIQ-5 in ra t细胞停止生长直至衰老死亡而发挥抗肿瘤作用，动物体内实验也观察到明显的抗 肿瘤作用。.虽然我们得知SYUIQ-5具有抗肿瘤作用，但缺乏其药动学方面的资 料，所以本文的工作旨在对SYUIQ-5临床前药代动力学过程，吸收特点，参与 SYUIQ-5代谢的P450亚酶以及SYUIQ-5对P450的影响进行研究，以支持人的 药代动力学研究并为临床用药提供参考。主要工作包括以下六个部分：第一部分 测定大鼠血浆中SYUIQ-5的HPLC方法的建立目的：建立测定大鼠血浆中SYUIQ-5的HPLC方法。方法：血浆样品以氯化氨 缓冲液(pH=l O.O)碱化后用乙醍提取其中的SYUIQ-5和内标SUCLo色谱条件：Hyper s il BDS Ci8 t t(5 u m,4.6mm X 150mm)；流动相：30mmol L磷酸氢二钾 缓冲液(pH=8.0)-甲醇-三乙胺(30:70005,v/v/v)；流量为1 mL-min1；柱温：室 温；紫外检测波长：278n m。结果：线性范围为301500 u gL“，线性关系良好，相关系数为0.9990,最低检测限为20u g-L1,日内RSD日间RSD0.05)。结论：单次腹腔注射SYUIQ-5在大鼠体内的药动学过程呈线性动 力学特征，符合一室模型。III-抗肿瘤活性物SYUIQ-5在大鼠体内的药动学研究第三部分SYUIQ-5在Ca co-2细胞模型中的转运特点目的：考察SYUIQ-5在Caco-2细胞模型中的转运特点。方法：用Caco-2细胞 单层模型研究SYUIQ-5的双向转运，并考察时间，SYUIQ-5浓度，温度，能量 抑制剂和P-gp抑制剂对SYUIQ-5吸收的影响。用高效液相色谱法检测SYUIQ-5 在不同浓度，不同时间，不同温度，以及有无能量抑制剂和P-gp抑制剂的情况 下的吸收浓度，以计算其表观渗透系数(Pgp)。结果：在Caco-2细胞模型中，SYUIQ-5从单层细胞层顶端(AP)到基底端(BL)的转运呈时间和浓度依赖性，能量 抑制剂及低温能减小Paap，而P-gp抑制剂能促进SYUIQ-5的转运。另一方面，SYUIQ-5从单层细胞层基底端(BL)到顶端(AP)的转运没有浓度依赖性，不受温 度，能量抑制剂和P-gp抑制剂的影响。结论：在Caco-2细胞模型中，SYUIQ-5 从单层细胞层顶端(AP)到基底端(BL)的转运主要是由位于Caco-2细胞单层顶端(AP)的载体介导的主动转运，且受到P-gp的影响，这可能是导致其吸收差的原 因之一。第四部分SYU1Q-5在鼠肝微粒体中的代谢及其代谢物的初步确证(1)SYUIQ-5在鼠肝微粒体中的代谢目的：建立HPLC测定大鼠肝微粒体中SYUIQ-5的方法，确定参与SYUIQ-5代谢 的P450亚酶。方法：对SYUIQ-5在不同诱导剂6-秦黄酮(80mg,k gd”,3d),蕃 巴比妥(80mg*k g-Jd,3d),地塞米松(100mgk gd,4d),20%乙醇(5mL,k g-d 4d),SYUIQ-5(5mgk g”di,5d)和空白对照(生理盐水5mL，5d或植物 油2mL-k g I-d i,3d)处理的鼠肝微粒体中以及在加入各个CYP亚酶抑制剂的空白 大鼠肝微粒体中的代谢进行了研究。结果：发现地塞米松(De x)和B-秦黄酮(B-NF)能增加SYUIQ-5的代谢，酮康噬能抑制SYUIQ-5的代谢。结论：在SYUIQ-5 的代谢中，CYP3Al起主要作用，CYP1A1起次要作用。(2)SYUIQ-5在鼠肝微粒体中代谢物的初步确证目的：初步推测SYUIQ-5在大鼠肝微粒体中的代谢物。方法：SYUIQ-5(终浓度 3 u g*mL-:)在肝微粒体孵育体系(总体积500 u L,大鼠肝微粒体终浓度3mg#mL-1,-IV-The pha rma cokinetic study of a novel a nti-tumor compound SYUIQ-5 in ra t磷酸盐缓冲液pH=7.4）37水浴中预温孵5min后，向其中加入NADPH溶液（终 浓度l n）M），孵育20 min后加入冰冷的乙醴2 mL,迅速混合，以终止反应，涡旋 振荡2分钟，离心（4000r.min D 10分钟，吸取有机相，负压挥千，以HPLC和 LC/MS/MS进行分析。结果：样品HPLC色谱图上发现有代谢物的色谱峰，采用 LC/MS/MS综合分析代谢产物的准分子离子，二级碎片离子和色谱保留时间，确 定SYUIQ-5在大鼠肝微粒体中有2个代谢物产生。结论：确定SYUIQ-5在大鼠肝 微粒体中的代谢物为口引躲唆琳母核侧链末端叔胺发生了 N去甲基化和N一氧化 的产物。第五部分SYUIQ-5对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶基因，蛋白表达 和酶活性的影响（1）SYUIQ-5对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶基因，蛋白表达的影响目的：考察SYUIQ-5对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶基因和蛋白表达的影响。方法：SYUIQ-5 分 3 个剂量 0.1 mg*k g-,5 mg-k g1,l Omg-k g-1,雄性 SD 大鼠经 腹腔注射连续处理5天后，取肝组织，制备肝微粒体和提取总RNA,分别应用反 转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹杂交（Wes t er n bl ot）法检测CYP 3A1,2B1/2,1A1,2E1 mRNA和蛋白的表达结果：与空白对照组相比，SYUIQ-5可 显著诱导CYP 1A1 mRNA和蛋白的表达，对CYP3A1,2B1/2和2E1 n iRNA和蛋白 表达无影响。结论：SYUIQ-5可显著诱导CYP 1A1 mRNA和蛋白的表达。SYUIQ-5对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性的影响目的：考察SYUIQ-5对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性的影响。方法：SYUIQ-5 分3个剂量0.1 mg*k g 1,5 mg-k g l,l Omg-k g-1,雄性SD大鼠经腹腔注射连续处 理1,5和10天后，取肝组织，制备肝微粒体，应用HPLC法检测CYP 3AL 2B1/2,1A1,1A2和2E1的酶活性。结果；与空白对照组相比，SYU1Q-5可显著诱导CYP 1A1和CYP1A2的酶活性，对CYP3A1,2B1/2和2E1的酶活性无影响。结论：SYUIQ-5可显著诱导CYP 1A1和CYP1A2的酶活性。抗肿瘤活性物SYUTQ-5在大鼠体内的药动学研究第六部分SYUIQ-5和SYUIQ-5衍生物F318大鼠口服吸收比较目的：大鼠一次性灌胃相同剂量（60mg.k g-?的SYUIQ-5和F318后，比较二者 的吸收情况。方法：雄性SD大鼠一次性灌胃60mgk g SYUIQ-5和F318后，在不同的时间取血，离心（l OOOOr-min1,l Omin）,取血浆，加内标，以氯化氨 缓冲液（pH=10.0）碱化后用乙醛提取其中的SYUIQ-5和内标SUCL,挥干，用 HPLC 分析。结果：SYUIQ-5 和 F318 的 Cmax分别为 56.21、301.15P g-Ld（1：5.4）,AUC 分别为 325.02、900.08 H g L-h-1（1：2.77）。结论：大鼠一次性灌 胃相同剂量（60mg.k g_1）SYUIQ-5 和 F318,F3 18 比 SYUIQ-5 容易吸收。关键词 抗肿瘤活性物SYUIQ-5,药动学，HPLC,Caco-2细胞模型，细胞色素P450,肝微粒体，LC/MS/MS,RT-PCR,wes t e r n bl ot-VIThe pha rma cokinetic study of a novel a nti-tumor compound SYLTIQ-5 in ra tThe pha rma cokinetic study of a novel a nti-tumor compound SYUIQ-5 in ra tInstitute of Cl inical Pharmacol ogy,Sun Yat-sen University ABSTRACTIn r ecen t year s,t h e n umber of n ew ch emical en t it ies(NCEs)h as in cr eas ed en or mous l y al on g wit h t h e devel opmen t an d appl icat ion of n ew t ech n iques s uch as bioch ip,combin at or ial bios yn t h es is,an d h igh t h r ough put s cr een in g model s.However,on l y 10%of NCEs h ave been devel oped as a pot en t ial dr ug can didat e.Th e major r eas on fbr t h is l ow accept an ce of NCEs t o be a pot en t ial dmg can didat e is t h e un s at is fact or y ph ar macok in et ic pr oper t ies,wh ich s t r on gl y s ugges t t h at t h e ph ar macok in et ic s t udy s h oul d be in vol ved as ear l y as pos s ibl e dur in g t h e pr oces s of n ew dr ug devel opmen t.Mean wh il e,t h e ph ar macok in et ic s t udy coul d pr ovide r ichdat a on t h e opt imizat ion of s t r uct ur e,ph ar macodyn amics,an d t oxicol ogy an d ph ar macol ogy mech an is m.Al l t h es e in dicat e t h e impor t an t r ol e of ph ar macok in et ic s t udy in dmg devel opmen t.Or al admin is t r at ion is t h e mos t common an d popul ar r out e due t o it s con ven ien ce,efficien cy,an d s afet y.Th e l ow bioavail abil it y of t h e dr ug can didat es is t h e major un des ir abl e pr obl em aft er or al dos in g,wh ich oft en r es ul t s in fl uct uat ion in bl ood dr ug con cen t r at ion an d un expect ed s ide effect.Th er efor e,t h e devel opmen t of n ew dr ug wit h accept abl e bioavail abil it y becomes impor t an t.Lar ge n umber s of n ew t ech n iques an d model s in vit r o t or n ew dr ug s cr een in g-VII-抗肿瘤活性物SYUIQ-5在大鼠体内的药动学研究h ave emer ged in t h es e t en year s.For exampl e,t h e us e of h uman col on aden ocar cin oma cel l(Caco-2)h as in cr eas ed dr amat ical l y t o pr edict t h e abs or pt ion pr oper t ies of t h e n ew dr ug can didat es.Caco-2 cel l s gr ow on t h e s emi-per meabl e membr an e an d differ en t iat e dur in g cul t ur e t o for m con fl uen t mon ol ayer wh ich is r es embl ed t o t h e s mal l in t es t in al epit h el ium.Th e Caco-2 cel l l in e n ow becomes t h e mos t pr efer abl e t ool t o pr edict t h e abs or pt ion of dr ug can didat es in vit r o t or it s s impl e pr epar at ion an d h igh efficien cy.On t h e ot h er h an d,wit h t h e in cr eas in g un expect ed adver s e even t s an d met abol ic dr ug-dr ug in t er act ion t h e pr edict ion of t h e met abol ic pr oper t ies of n ew dr ug can didat es becomes mor e an d mor e impor t an t.Fr om 1980 t o 1998,FDA r emoved 13 ph ar maceut ical s fr om t h e mar k et becaus e of un expect ed adver s e even t s an d t h e s ever e met abol ic in t er act ion.For exampl e,t h e an t i-h yper t en s ion dr ug mibefr adil,an t ih is t amin e dr ug t er fen adin e an d ph en yl pr opan ol amin e wer e r eject ed due t o t h e s ever e met abol ic in t er act ion.Th e dr ug-dr ug in t er act ion con s is t s of ph ar macok in et ic an d ph ar macodyn amic in t er act ion s.40%of ph ar macok in et ic in t er act ion s wer e caus ed by t h e met abol ic in t er act ion s an d 96%met abol ic in t er act ion s ar e mediat ed by Cyt och r ome P450.Cyt och r ome P450(CYP)is on e of t h e mos t impor t an t famil ies of dr ug met abol is m en zymes an d pl ays a k ey r ol e in t h e met abol is m of mos t of t h e exogen ous an d en dogen ous compoun ds.CYP exis t s main l y in l iver micr os omes.CYP can be eas il y in duced or in h ibit ed by a n umber of ch emical compoun ds an d s h ows l ar ge var iat ion in s ubs t r at es,Co-admin is t r at ion,t h er efor e,woul d oft en caus e t h e ch an ge of CYP mediat ed met abol is m an d r es ul t in dr ug in t er act ion in ph ar macok in et ics.Th e s t udy on t h e CYP is ofbr ms in vol ved in t h e met abol is m,t h e mech an is m of met abol is m an d t h e effect of dr ug on t h e CYP can pr ovide dat a t o pr edict t h e met abol ic in t er act ion,s o t h at t o avoid un expect ed dr ug-dr ug in t er act ion.SYUIQ-5,a n ovel quin dol in e der ivat ive s yn t h es ized by Sch ool of Ph ar maceut ical Scien ces,Sun Yat-s en Un iver s it y,h as been ver ified t o in duce t h e G-r ich t el omer ic DNA s equen ce t o fol d in t o quadr upl ex an d s t abil ize t h e G-quadn.ipl ex.Tr eat men t wit h SYUIQ-5 coul d in h ibit t el omer as e act ivit y in h uman 一 VIII-The pha rma cokinetic study of a novel a nti-tumor compound SYTJIQ-5 in ra tl euk emia K562 cel l s an d col on can cer SW620 cel l s by s h or t en in g t h e t el omer e l en gt h.SYUIQ-5,wh en added t o K562 an d SW620 cel l,coul d in duce a mar k ed ces s at ion in cel l gr owt h an d cel l ul ar s en es cen ce.Dat a in vivo al s o in dicat ed t h e an t ican cer act ivit y of SYTJIQ-5.Sin ce SYUIQ-5 h as been pr oved t o h ave pr omis in g ph ar macol ogical pr oper t ies,we des ign t h e ph an n acok in et ic s t udy s oon aft er t o obt ain a bas ic pr ofil e on it s ph ar macok in et ic ch ar act er is t ics.Th us,t h e wor k s of t h is paper wer e des ign ed t o eval uat e t h e ph ar macok in et ic pr oper t ies of SYUIQ-5 in vivo,t h e abs or pt ion ch ar act er is t ics in Caco-2 cel l l in e in vit r o,P450 is ofbims in vol ved in met abol is m of SYUTQ-5 an d t h e effect of SYUIQ-5 on P450,s o as t o s uppor t t h e ph ar macok in et ic s t udy in h uman an d pr ovide r efer en ces for cl in ical appl icat ion.Th e s t udy in cl udes t h e fol l owin g s ix par t s:Pa rti The esta b lishment of HPLC method for determina tion ofSYUIQ-5 in ra t pla smaOb jective:To es t abl is h a h igh per for man ce l iquid ch r omat ogr aph y met h od wit h h igh s en s it ivit y,r el iabil it y,s pecificit y an d excel l en t efficien cy t o det er min e SYUIQ-5 in r at pl as ma.Methods:Th e pl as ma s ampl es wer e al k al ified wit h ammon ium ch l or ide buffer(pH=10.0)an d ext r act ed by diet h yl et h er.Th e or gan ic l ayer was evapor at ed t o dr yn es s.Th e ext r act ed s ampl e was s epar at ed by a Hyper s il BDS Cis col umn(5 口 m,4.6mm X 150mm)wit h UV det ect ion wavel en gt h at 278n m.A mobil e ph as e of 30n l mol L1 dipot as s ium h ydr ogen ph os ph at e(pH=8.0)-m et h an ol-t r iet h y 1 amin e(30:70:0.057 v/v/v)was r un at a fl ow r at e of 1 mL*min l.Results:A good l in ear it y was obt ain ed over t h e pl as ma con cen t r at ion r an ge of 30-1500 u g-L-1 of SYUIQ-5 wit h cor r el at ion coefficien t fr om 0.9964 t o 0.9986 an d t h e l imit of quan t it at ive was 20 u g-L-l.Th e pr ecis ion of in t r a-as s ay an d in t er-as s ay was eval uat ed by an al ys is of var ian ce wit h t h e r es ul t of 5.2%an d 3.8%(月=5),r es pect ivel y.Th e aver age ext r act ion r ecover y was 72.1%80.5%an d t h e r el at ive r ecover was 96.8105J%.Conclusions:Th e met h od is s h own t o be accur at e an d r epet it ive,s impl e t o oper at e,an d s uit abl e for appl icat ion of pr ecl in ical IX抗肿瘤活性物SYUTQ-5在大鼠体内的药动学研究an d cl in ical ph ar macok in et ic s t udy.Pa rt2 The pha rma cokinetic study of SYUIQ-5 in r atOb jective:To el ucidat e t h e ph ar macok in et ic pr ofil es of SYUIQ-5 in r at fol l owin g a s in gl e in t r a-per it on eal admin is t r at ion wit h differ en t dos es t o r at s（15,30 an d 60 mg*k g_1）.Methods:Th e bl ood s ampl es wer e col l ect ed at differ en t t ime aft er dos in g.Pl as ma was obt ain ed by cen t r ifugat ion at l OOOOr Tn in*1 fbr 3 min an d SYUIQ-5 in pl as ma was det er min ed by HPLC met h od des cr ibed in Par t i.Ph ar macok in et ic par amet er s cal cul at ion s an d ph ar macok in et ic model in g wer e car r ied out us in g t h e 3p87 s oft war e.Results:Cma x of t h r ee gr oup 15,30 an d 60mg*k g-1 wer e 142.75,190.88,336.41n g-mL I（l：1.4：2.4）,r es pect ivel y.AUC wer e 12739.44,17877.75,42454.98n g min 1-mL l：1.4：3.3）,r es pect ivel y;Cmax an d AUC wer e dos e-depen den t.t i/2 wer e 60.62,55.75,75.94m in,r es pect ivel y.CL/F wer e L18,1.68,1.4 IL min-1 k gr es pect ivel y.V/F wer e 102.98,134.98,154.85Lk g r es pect ivel y.Th er e n o s ign ifican ce differ en ces bet ween gr oups（夕0.05）.Conclusions:It was s h own t h at t h e pl as ma con cen t r at ion-t ime dat a was fit t o a s in gl e compar t men t ph ar macok in et ic model,t h e el imin at ion of SYUIQ-5 exh ibit ed fir s t or der k in et ic ch ar act er is t ics in r at s aft er a s in gl e in t r a-per it on eal admin is t r at ion.Pa rt3 Tra nsport cha ra cteristics of SYUIQ-5 in the Ca co-2 cell monola yer modelOb jective:To il l umin at e t h e t r an s por t ch ar act er is t ics of SYUIQ-5 in t h e Caco-2 cel l mon ol ayer model.Methods:Caco-2 cel l mon ol ayer model cul t ur ed on t h e pol ycar bon at e membr an e was us ed t o in ves t igat e t h e bi-dir ect ion al t r an s por t of SYUIQ-5,Th e t r an s por t ed amoun t of s ubs t r at e was meas ur ed by HPLC t o es t imat e t h e appar en t per meabil it y coefficien t s（P0他）at differ en t s ubs t r at e con cen t r at ion l evel s,t r an s por t t ime,t emper at ur e an d in t h e pr es en ce or abs en ce of en er gy in h ibit or s an d P-gp in h ibit or.Results:In t h e apical-t o-bas ol at er al fl ux,SYUIQ-5 upt ak e was t ime an d con cen t r at ion depen den t,an d was r educed by met abol ic in h ibit or s an d in fl uen ced-X-The pha rma cokinetic study of a novel a nti-tumor compound S YUIQ-5 in ra tby l ow t emper at ur e wh il e in cr eas ed in abs en ce of P-gp in h ibit or,an d t h us in dicat ed t h at t h e abs or pt ion was en er gy-d epen d en t.On t h e ot h er h an d,t h e appar en t per meabil it y coefficien t s(Pm夕)of SYUIQ-5 fr om bas ol at er al t o apical s ide was t ime-an d con cen t r at ion-in depen den t an d n eit h er affect ed by met abol ic in h ibit or s n or in h ibit or for P-gp.Conclusions:Th es e r es ul t s s ugges t t h at apic