雪茄烟发酵过程微生物群落结构及物种均衡性变化特征.pdf

雪茄烟发酵过程微生物群落结构及物种均衡性变化特征陈燕1，张光海2*，朱宣全1，王戈1，姚恒2，夏华昌2，孔光辉2，王娜1，周鹏1，杜宇1，白羽祥1*（1.云南农业大学烟草学院，昆明650201；2.云南省烟草农业科学研究院，昆明650021）摘要：为明确雪茄烟叶发酵过程中微生物群落组成、结构及物种均衡性的变化特征，基于高通量测序技术，采用细菌、真菌多样性指数比值分析方法，对不同发酵阶段雪茄烟叶表面细菌、真菌进行分析。结果表明，随发酵进行，细菌 多样性先升高后降低，在 PEF3（中期）达到最高值；真菌 多样性基本稳定，仅在发酵 PEF4（后期）显著降低；物种均衡性在前中期小幅度升高，但在 PEF4 后显著降低。PCoA 分析显示，未发酵与发酵前中期细菌群落结构相似，与发酵后期明显分离。在发酵过程中，细菌葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和真菌明梭孢属（Monographella）、曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）为主要优势菌属。影响物种均衡性的关键微生物群落变化规律是:由发酵初期的泛生菌属（Pantoea）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），变为发酵中期马赛菌属（Massilia）、壤霉菌属（Agromyces）、根瘤菌科（Rhizobiaceae），最后稳定为 Staphylococcus、Pseudomonas、Trichomonascus、雷尔氏菌属（Ralstonia）、Monographella。将微生物分为两个模块研究，共筛选出 8 个有利于提高物种均衡性的关键菌属。最终结构方程模型表明，在雪茄烟叶发酵过程中，影响物种均衡性改变的主要环境因子是温度和湿度，二者通过影响关键菌属的丰度而影响物种均衡性。关键词：雪茄烟叶；发酵；微生物群落；物种均衡性中图分类号：TS41+4文献标识码：A文章编号：1007-5119（2024）01-0087-09Changes of Microbial Community Structure and Species Balance inFermentation of Cigar TobaccoCHENYan1,ZHANGGuanghai2*,ZHUXuanquan1,WANGGe1,YAOHeng2,XIAHuachang2,KONGGuanghui2,WANGNa1,ZHOUPeng1,DUYu1,BAIYuxiang1*(1.CollegeofTobaccoScience,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China;2.YunnanTobaccoAgriculturalScienceResearchInstitute,Kunming650021,China)Abstract:Aiming for the changes of microbial community composition,structure,and species balance in cigar tobaccofermentation,thesurfacebacteriaandfungiofcigartobaccoatdifferentfermentationstageswereanalyzedbyusinghigh-throughputsequencingtechnologyandratioanalysismethodofbacterialandfungaldiversityindex.Resultsshowedthatwiththefermentationprocess,thediversityofbacteriaincreasedatfirstandthendecreased,andpeakedinPEF3(middlestage).Thediversityoffungiwasbasicallystable,yetsignificantlydecreasedinPEF4(latestage).Thespeciesbalanceslightlyincreasedinearlyandmiddlestages,whilesignificantlydecreasedafterPEF4.PCoAanalysisshowedthatthebacterialcommunitystructureofunfermentedandprefermentationexhibitedsimilar,whilesignificantlyseparatedfromthatofpostfermentation.ThedominantgenerainfermentationwerebacterialStaphylococcus,Pseudomonas,andfungalStreptomyces,Aspergillus,Penicillium,respectively.ThekeymicrobialcommunitychangesaffectingspeciesbalancearefromPantoea,Methylobacterium,andSphingomonasofearlystagetoMassilia,Agromyces,Rhizobiaceaeofmiddlestage,andfinallystabilizedwithStaphylococcus,Pseudomonas,Trichomonas,RalstoniaandMonogramella.Microorganismsweredividedintotwomodules,andatotalof8keygenerabeneficialforimprovingspeciesbalancewereselectedout.Thefinalstructuralequationmodelindicatesthatinfermentationofcigartobacco,themainenvironmentalfactorsaffectingspeciesbalancearetemperatureandhumidity,whichaffectspeciesbalancebyaffectingtheabundanceofkeybacterialgenera.Keywords:cigartobacco;fermentation;microbialcommunity;speciesbalance基金项目：中国烟草总公司云南省公司科技项目（2021530000241004、2021530000241002）第一作者：陈燕（1996），女，在读硕士研究生，主要从事烟草栽培与植烟土壤保育研究。E-mail：*通信作者：张光海（1991），男，助理研究员，博士，主要从事雪茄烟叶研究开发。E-mail：；白羽祥（1991），男，副教授，博士，主要从事烟草栽培与生理生化、植烟土壤保育。E-mail：收稿日期：2023-07-25修回日期：2023-12-08中国烟草科学ChineseTobaccoScience2024,45(1):87-95DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2024.01.012雪茄烟的生产过程一般包括栽培、晾晒、发酵、卷制等工序。其中发酵是改善烟叶品质的重要过程，能有效降低烟叶的杂气、辛辣味和苦味，促进芳香化合物的积累1。发酵过程比较复杂，易受水分、温度、酶活性、理化性质和微生物的影响2，微生物在其中具有重要作用3-4。微生物以烟叶中的糖、蛋白质、淀粉、脂肪等大分子有机物作为代谢底物，并分泌代谢相关的酶，分解和利用烟叶中碳水化合物和含氮化合物5，进一步降解为小分子代谢产物6-7，促进物质转化和品质改良8-9。前人研究表明，墨西哥茄衣烟叶在发酵前期，主要优势菌为棒状杆菌属（Corynebacterium）和假单胞菌属，在发酵后期变为葡萄球菌属10。四川什邡雪茄烟叶发酵后，主要优势菌为芽孢杆菌属和青霉菌属11。海南茄衣发酵中以细菌为主要优势菌12，葡萄球菌属和乳杆菌属在发酵前期数量最多，在发酵后期放线菌属有所增加13。物种均衡性在一定程度上反映物种分布的均匀程度和生态系统稳定性14，研究物种均衡性有助于更好地理解烟叶发酵过程中微生物多样性变化情况，从而制定合理的发酵方案。先前的研究大多在发酵不同阶段分别对细菌或真菌进行分析，而对发酵过程中细菌与真菌的相互作用、群落结构和物种均衡性动态变化趋势研究甚少。因此，本研究通过在发酵不同阶段进行取样，利用高通量测序法进行检测，采用细菌、真菌多样性指数比值分析方法，从菌群结构变化方面揭示发酵机理，以期为云南雪茄烟叶发酵提供理论支撑和技术参考。1材料与方法1.1供试材料供试材料为“云雪 1 号”中部烟叶，种植和晾制地点为云南省普洱市江城县整董镇（东经 10155，北纬 2243），海拔高度 813m。发酵地点为云南省玉溪市元江县红塔集团烟叶醇化仓库，海拔高度 800m，发酵期室内日均温 22.28，相对湿度62.03%。按企业标准 Q/YNYC(KJ).J152022雪茄烟叶农业发酵技术进行发酵，采用堆积发酵，加湿水源为自来水。1.2试验设计1.2.1烟叶处理与发酵试验于 2021 年在玉溪市元江县红塔集团烟叶醇化仓库内进行。将烟叶样品混匀后扎把，采用堆积发酵法发酵。烟叶堆放在距离地面 0.15m 高的木架上，烟堆长 3.72m、宽1.50m、高 0.85m。在烟堆内不同位置处放置温湿度自动记录仪，当堆垛内温度达到 3343 时进行翻堆。按照上下翻中间、中间翻上下，外翻内、内翻外的原则，将烟叶重新堆垛，整个发酵过程34d，共翻堆 5 次。翻垛温度为 33.6342.38，相对湿度 89.86%96.78%。发酵开始后定期从固定位置取样，直至发酵结束。1.2.2烟叶取样取未发酵烟叶，叶片充分混匀作为发酵前样品（PEF0）。在发酵过程中，每天记录烟堆的温度、湿度，测定每次翻垛时烟叶的 pH 等指标。在发酵后 3、8、16、24 和 34d 进行取样，将第3 天、第8 天取样命名为发酵前期（PEF1、PEF2）；第 16 天取样命名为发酵中期（PEF3）；第 24、34天取样命名为发酵后期（PEF4、PEF5）。在堆积发酵过程中，每次翻垛时取上、中、下三层的烟叶共计 9 把烟叶，每把烟叶选外观质量一致的 6 片中部烟叶，灭菌剪刀剪取相同部位烟叶（避开主脉）约10g（每片烟叶约 2g）置于离心管中，液氮速冻后放80 冰箱保存。每个样品 3 个生物学重复，总共 18 份烟叶样品。取样具体时间及相关信息见表 1。表1雪茄烟叶样品信息表Table1Cigartobaccosampleinformation处理Treatment取样日期Samplingdate温度Temperature/湿度Humidity/%pHPEF02021-08-1227.7074.106.29PEF12021-08-1540.6896.026.37PEF22021-08-2040.4689.866.84PEF32021-08-2842.3896.206.62PEF42021-09-0535.5295.706.79PEF52021-09-1533.6396.786.751.3测定项目与方法采用试剂盒（型号 D3142，广州美基生物科技有限公司）提取样品基因组 DNA。对 18 个样本的16SrRNA 的V3-V4 区和真菌ITS1 可变区进行扩增，细菌扩增引物为 341F（5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3）和 806R（5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3）；真菌扩增引物为 ITS1-F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）和 ITS2（5-GCTGCGTTCTT88中国烟草科学2024 年第 45 卷CATCGATGC-3）。利用AMPureXPBeads 进行PCR产 物 纯 化，用 ABI StepOnePlus Real-Time PCRSystem（赛默飞世尔科技有限公司）进行定量，根据 Novaseq6000 的 PE250 模式 pooling 上机测序，使用 IlluminaMiSeq 测序仪进行基因测序（北京诺禾致源科技股份有限公司）。1.4数据处理与统计分析采用 MicrosoftExcel2010 软件进行制图和数据统计分析。采用 IBMStatisticsSPSS22.0 软件进行显著性方差分析。将有效数据在 97%水平上聚类成操作分类单元（OperationalTaxonomicUnit，OTU），基于 OTUs 聚类结果，对样品中物种进行注释与评估。利用 RStudio（版本 2023.03.0+386）进行微生物多样性分析，绘制图表。物种均衡性计算使用真菌 多样性指标与细菌对应的 多样性指标一一相比，获得每个样本的比值 ITS/16S（observed_species）、ITS/16S（shannon）、ITS/16S（simpson）、ITS/16S（ACE）、ITS/16S（PD_whole_tree）、ITS/16S（chao1），进行箱型图制作（以上 6 个值统称为 多样性比值 ITS/16S）。通过 多样性比值ITS/16S 来了解处理间物种均衡性的变化，比值越小，均衡程度越高14-15。基于 Bary-Curtis 距离算法的主坐标分析（principalco-ordinatesanalysis，PCoA）图分析微生物群落结构组成差异；使用 R“ggcor”包进行 Manteltest 检验；R“ggplot2”包进行 Spear-man相关性散点图绘制；R“WGCNA”包进行显著性物种筛选及作图；R“plspm”包计算偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析的有向图，OmniGraffle（7.18.1）绘制结构方程模型。2结果2.1微生物 多样性通过对 16SrRNA 和 ITS 基因片段的 Illumina测序，分析了雪茄烟叶未发酵（PEF0）、发酵前期（PEF1、PEF2）、中期（PEF3）和后期（PEF4、PEF5）6 个阶段的细菌、真菌群落组成。当使用 97%的序列相似性截止值时，共获得了 5858 个细菌和908 个真菌 OUT，对 OTU 进行物种分类注释，获得 391 个细菌属、576 个细菌种；258 个真菌属、373 个真菌种。随发酵时间增加，细菌多样性指数变化均呈现先升高后降低趋势，且处理间差异显著（p0.05）。由图 1a、b、c 可以看出，细菌群落多样性在发酵中期最高，细菌、真菌多样性在发酵后期均显著下降。由图 1d 可看出，在发酵前中期，多样性指标 Shannon diversity index Sharnon9(a)(b)(c)678543210PEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5 多样性指标 Simpson diversity index Simpson1.21.00.80.60.40.20PEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5 多样性指标 ACE diversity index ACE40003000350025002000150010005000PEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5(d)多样性比值 diversity ratio(ITS/16S)3.53.02.52.01.51.00.50PEF0PEF1PEF2PEF3PEF4PEF5(e)真菌 多样性指标 SimpsonFungal diversity index Simpson细菌 多样性指标 SimpsonBacterial diversity index Simpson0.6p=0.14r=0.360.40.20.20.40.60.81.0注：图中绿色为细菌，蓝色为真菌；e 为相关性散点图。Note:Thecolorofgreenrepresentsbacteria,bluerepresentsfungi;eisthecorrelationscatterplot.图1 多样性分析Fig.1Thediversityanalysis第 1 期陈燕等：雪茄烟发酵过程微生物群落结构及物种均衡性变化特征89物种均衡程度逐渐升高，而在发酵后期，均衡程度显著降低。Spearman 相关性分析表明（图 1e），细菌与真菌的多样性指数呈正相关（r=0.36，p=0.14），说明不同发酵阶段细菌、真菌多样性变化趋势相似。2.2微生物 多样性PCoA 结果表明，不同样本细菌群落（图 2a）结构信息主要集中在前 2 个主成分，其中 PC1 的贡献率为 48.25%，PC2 的贡献率为 23.44%，累计方差贡献率为 71.69%。发酵前、中期的细菌类群相似度较高，与发酵后期分离明显，表明发酵时间对烟叶细菌多样性有显著影响。真菌群落（图 2b）的相似性与细菌不同，发酵中期与其他阶段的群落明显分离，未发酵和发酵前期的真菌类群很好地聚在一起。基于样本间 多样性指数，进行 Manteltest分析（图 2c），从群落结构层面对比各发酵阶段细菌真菌群落结构变化。从图 2c 可看出，在 OTU 水平上，细菌真菌群落结构显著低度相关（p=0.005，r=0.311），说明细菌和真菌的组间差异不一致，暗示细菌和真菌不同的响应驱动机制。PCo2(23.44%)PCo1(48.25%)0.2(a)(b)(c)00.2PCo2(20.33%)0.100.1真菌 OTUsFungal OTUs0.40.50.30.20.200.20.4PCo1(45.58%)0.2 0.100.10.2细菌 OTUsBacterial OTUs0.250.500.75PEF0PEF1PEF2PEF3PEF4PEF5PEF0PEF1PEF2PEF3PEF4PEF5注：a 为细菌 PCoA 图；b 为真菌 PCoA 图；c 为 Manteltest 分析。Note:aisbacterialPCoAdiagram;bisfungalPCoAdiagram;cisManteltestanalysis.图2 多样性分析Fig.2Thediversityanalysis2.3细菌群落组成由图 3a 可知，在发酵过程中，雪茄烟叶表面细菌主要包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和未鉴定的拟杆菌门（unidentified_Bacteria）。变形菌门、厚壁菌门和蓝藻菌门为优势门类，在样本中的相对丰度达 85.52%。其中变形菌门在发酵过程中随时间的增加呈先降低后升高的趋势变化，在 PEF5 处理中相对丰度最高；蓝藻菌门则随发酵时间逐渐降低，各处理间差异显著（p0.05）；厚壁菌门相对丰度在 PEF4 处理中达最高值，变化趋势与其他 7 种菌门一致，随发酵时间OthersAcidobacteriotaMyxococcotaChloroflexiBacteroidotaActinobacteriotaunidentified BacteriaActinobacteriaCyanobacteriaFirmicutesProteobacteriaOthersGlutamicibacterBacillusSphingomonasExiguobacteriumPantoeaArthrobacterunidentified Mitochondriaunidentified_ChloroplastPseudomonasStaphylococcusPEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5PEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5相对丰度Relative abundance/%120100806040200相对丰度Relative abundance/%120100806040200(a)(b)图3不同发酵阶段细菌群落在门水平（a）和属水平（b）的相对丰度Fig.3Relativeabundanceofbacterialcommunitiesatphylumlevel(a)andgenuslevel(b)indifferentfermentationstages90中国烟草科学2024 年第 45 卷增加呈先升高后降低趋势。从属水平来看（图 3b），相对丰度前 10 的菌群中，相对丰度最高的 4 个属是葡萄球菌属（Staphy-lococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、未识别叶绿体属（unidentified_Chloroplast）、未识别线粒体属（unidentified_Mitochondria），相对丰度达 70.04%。其中假单胞菌属随发酵时间的增加呈升高趋势；未识别叶绿体属和未识别线绿体属随发酵时间的增加呈下降趋势；葡萄球菌属与其他 7 种菌属呈现先升高后降低的趋势，除了 Sphingomonas 在各处理间无显著差异外，其他菌属差异均显著。2.4真菌群落组成由图 4a 可知，6 个不同发酵时间阶段的 OTU属于 8 个真菌门，分别是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、螺旋藻（Fungi_phy_Incertae_sedis）、被孢霉门（Mortierellomycota）、捕虫霉门（Zoopagomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）、毛霉门（Mucoromy-cota）。子囊菌门为优势门类，在样本中的相对丰度达 95.96%。除毛霉门在 PEF5 处理中相对丰度显著高于其他处理外（p0.05），其余真菌门在不同发酵时间段无显著差异。OthersMucoromycotaRozellomycotaChytridiomycotaZoopagomycotaMortierellomycotaFungi_phy_Incertae sedisBasidiomycotaAscomycotaOthersPhomaBipolarisTrichomonascusPlectosphaerellaCladosporiumSaccharomycesSampaiozymaPenicilliumAspergillusMonographellaPEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5PEF0 PEF1 PEF2 PEF3 PEF4 PEF5相对丰度Relative abundance/%1021009896949290相对丰度Relative abundance/%120100806040200(a)(b)图4不同发酵阶段真菌群落在门水平（a）和属水平（b）的相对丰度Fig.4Relativeabundanceoffungalcommunitiesatphylumlevel(a)andgenuslevel(b)indifferentfermentationstages从属水平来看（图 4b），相对丰度前 10 的菌群中，排名前 3 的属是明梭孢属（Monographella）、曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium），相对丰度达 91%。其中 Monographella 随发酵时间的增加而升高；Penicillium 属随发酵时间的增加而下降；Aspergillus 在发酵中期相对丰度最高，在发酵后期呈显著下降趋势。2.5关键物种为了进一步分析发酵过程中微生物群落的变化规律，筛选出不同发酵阶段的关键物种。通过 R语言“WGCNA”包分析，经模块化处理后所有OTU 分为蓝绿色和灰色两个模块（图 5a），物种均衡性（多样性比值 ITS/16S）与模块呈显著负相关，挑选相关性最强的灰色模块（r=0.68，p=0.002），设置阈值|r|0.66、p0.05 筛选出 13 个关键物种，包括 11 个细菌和 2 个真菌（图 5b 右上角区域），分别是Stapbylococeus、Sphingomonas、Pseudomonas、泛生菌属（Pantoea）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，未识别到属）、马赛菌属（Massilia）、雷尔氏菌属（Ralstonia）、壤霉菌属（Agromyces）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、未识别叶绿体属（unidentified_Chloroplast）、明梭孢属（Monographella）、Trichomonascus。其中 8 个关键细菌属的相对丰度随发酵时间的增加而降低（图 5c），而关键真菌属则升高（图 5d）。在发酵中期（16 d），Rhizobium、Rhizobiaceae、Massilia、Agromyces 相对丰度升高；在发酵后期（2434d），Stapbylococeus、Pseudomonas、Ralstonia、Tricho-monascus、Monographella 相对丰度最高（图 6a），同时发现 Rhizobium、Massilia、Methylobacterium、Agromyces 与温度呈显著正相关关系（图 6b）。2.6结构方程模型使用 SEM 来表征导致物种均衡性变化的可能路径（图 7）。该模型的最佳拟合度 GOF 为 0.5741。发酵时间直接促进环境因子发生改变（路径系数为0.806），其中温度升高对关键细菌属丰度具有显著第 1 期陈燕等：雪茄烟发酵过程微生物群落结构及物种均衡性变化特征91促进作用（路径系数为 1.09），而对关键真菌属具有显著抑制作用（路径系数为0.722）；湿度增加对关键细菌属丰度具有显著抑制作用（路径系数为0.95），而对关键真菌属丰度具有显著促进作用（路径系数为 0.78）；关键细菌属丰度增加具有提高物种均衡性作用（路径系数为0.69）；发酵过程中，环境温度通过影响细菌属丰度而影响物种均衡性。3讨论研究烟叶发酵过程中微生物群落变化特征，可以明确发酵过程中微生物作用，为更精准地调控发酵过程奠定基础16。本研究中，雪茄烟叶微生物群落结构在发酵后期差异明显。细菌、真菌 多样性在发酵后期均呈下降趋势，这可能与发酵过程中微生物数量降低有关。李宁等11研究发现，发酵后雪茄烟叶表面微生物数量会明显降低，但细菌数量远高于真菌。本研究结合细菌真菌进行分析，观察 多样性比值 ITS/16S，发现物种均衡性在发酵过程中呈现先升高后降低趋势，这与前人研究结果类似12,17。物种均衡性变化可能与优势菌的相对丰度变化有关。从门水平来看，在本研究中变形菌门、毛霉菌门在发酵后期丰度增加明显，厚壁菌门、蓝藻菌门相对丰度则降低。HU 等18研究发现蓝藻菌门的相对丰度随发酵时间的延长而升高。温度是影响蓝藻菌门分布的主要因素，随温度的升高其丰度升高14，本研究中，发酵后期温度有所下降，导致蓝藻菌门丰度降低，这可能是与 HU 等18研究结果不一致的原因。从属水平来看，葡萄球菌属、假单胞菌属、明梭孢属、青霉属及曲霉属为本研究雪茄发酵过程中的主要优势菌属。相关性热图显示，葡萄球菌属、不同模块物种Different module species细菌相对丰度Relative abundance of bacteria/%真菌相对丰度Relative abundance of fungi/%1.00.500.51.00.6(0.009)(a)(c)0.28(0.3)0.9(4e07)0.62(0.006)0.18(0.5)0.52(0.03)0.66(0.003)0.15(0.5)0.61(0.007)0.68(0.002)pHPEF03.53.02.52.01.51.00.502.01.51.00.506543210PEF1PEF2PEF3PEF4PEF5PEF0PEF1PEF2PEF3PEF4PEF5时间Time温度Temperature湿度HumidityITS/16S0.60.40.2000.20.40.60.8灰色模块中关键属与 ITS/16S 的相关性系数The correlation coefficient between key generain grey modules and ITS/16S灰色模块中关键属与该模块的相关性系数The correlation coefficient between the key generain the gray module and the moduleSphingomonasMassiliaRhizobiumPantoeaAgrom ycesunidentified ChloroplastMethylobacterium(d)(b)RhizobiaceaeTrichomonascusMonographella注：a 为不同模块物种与环境因子相关性热图（红色表示正相关，绿色为负相关，颜色越深相关性越强，括号中数字是显著性 p 值大小）；b 为灰色模块内与 多样性比值 ITS/16S 显著相关的物种（关键属）；c 为关键细菌属相对丰度变化趋势；d 为关键真菌属相对丰度变化趋势。Note:aisheatmapofthecorrelationbetweendifferentmodulespeciesandenvironmentalfactors(thecolorofredrepresentspositivecorrelation,greenrepresentsnegativecorrelation,andthedarkerthecolor,thestrongerthecorrelation.Numberinparenthesesrepresentssignificancep-value.);brepresentsspecies(keygenus)significantlyrelatedtoITS/16Swithingreymodule;crepresentsthetrendofabundancechangesinkeybacterialgenera;drepresentsthetrendofabundancechangesinkeyfungalgenera.图5关键物种筛选及变化趋势Fig.5Screeningofkeyspeciesanditschangingtrends92中国烟草科学2024 年第 45 卷假单胞菌属、Trichomonascus、雷尔氏菌属为本研究发酵后期优势菌属。张鸽等16研究发现，葡萄球菌属丰度在发酵后期有所升高，与本研究结果相似。发酵后期是烟叶风味物质积累最多时期，葡萄球菌属是风味物质形成的关键菌属19，能参与烟叶中糖、脂肪代谢，形成醛类、甲基酮等芳香类物质20。LI 等21研究发现，随发酵的进行，假单胞菌属的相对丰度逐渐增大，这与本研究结果相似。可能是假单胞菌能以尼古丁作为底物，在发酵过程中有效降解尼古丁16，使其丰度增加。明梭孢属相对丰度随发酵时间增加而升高，说明该菌属在发酵后期发挥较大作用22。Trichomonascus 在发酵第 24 天时丰度最高，与前人在此时段的研究结果相似23，且与 pH、湿度呈正相关。有关明梭孢属、Trichomonascus 对雪茄烟叶品质和风味物质形成的影响，尚需进一步研究。本研究中共筛选出 13 个主要关键菌属，其中8 个菌属丰度与 多样性比值 ITS/16S 呈显著负相关，说明该类物种数量增加有利于提高物种均衡性。泛菌属、未识别叶绿体等菌属在发酵前期丰度较高，表明这些菌属能够在发酵环境下较好利用糖类、StaphylococcusPseudomonasTrichomonascusRalstoniaMonographellaSphingomonasPantoeaMethylobacteriumRhizobiumRhizobiaceaeMassiliaAgromycesunidentified_Chloroplast101未发酵发酵中期发酵前期发酵后期0.650.580.580.821.040.360.070.570.070.600.670.890.350.450.580.580.500.860.520.440.030.110.490.770.721.250.620.570.580.390.511.711.611.621.391.361.171.241.431.731.731.731.711.390.831.101.021.431.251.261.070.52StaphylococcusTrichomonascusPseudomonasRalstoniaMonographellaMassiliaMethylobacteriumAgromycesSphingomonasRhizobiumPantoeaunidentified_Chloroplast0.500.5pH温度湿度*(a)(b)Rhizobiaceae注：a 为关键属丰度热图，颜色越红数值越大表示该菌属丰度越高，反之颜色越蓝丰度越低；b 为关键属与环境因子的相关性热图，正相关程度越高则方格越红，反之越蓝。*,p0.05;*,p0.01;*,p0.01。Note:aisheatmapofkeygeneraabundance.Theredderthecolor,thehigherthenumericalvalue,indicatinghigherabundanceofthegenus.Conversely,thebluerthecolor,thelowertheabundance;bisheatmapofcorrelationbetweenkeygeneraandenvironmentalfactors.Thehigherthepositivecorrelation,theredderthegrid,andviceversa,thebluerthegrid.*,p0.05;*,p0.01;*,p0.01.图6不同发酵阶段关键物种相对丰度变化（a）及其与环境因子的相关性热图（b）Fig.6Relativeabundancechangesofkeyspeciesindifferentfermentationstagesandtheircorrelationwithenvironmentalfactors发酵时间环境因子pH0.200.95*0.69*0.722*0.78*0.181.09*0.32温度关键细菌属均衡性关键真菌属湿度0.806*注：方框表示模型中包含的变量，箭头表示方向，实线表示影响显著（p0.05），线条粗细表示标准化系数的大小，箭头权重与标准化系数成正比。*，p0.05；*，p0.01；*，p0.001。红色表示正相关，黑色表示负相关。该模型 GOF=0.5741。Note:Theboxrepresentsvariablesinthemodel,arrowrepresentsdirection,solid line represents significant impact(p0.05),thethicknessofthelinerepresentsthesizeofnormalization coefficient,and the arrow weight is proportional to thenormalization coefficient.*,p0.05;*,p0.01;*,p0.001.Redindicatespositivecorrelation,whileblackindicatesnegativecorrelation.ThemodelGOF=0.5741.图7发酵过程中环境因子对物种均衡性影响的结构方程模型（SEM）Fig.7Structuralequationmodel(SEM)oftheeffectsofenvironmentalf