水稻D1基因新等位突变体的鉴定与功能分析.pdf

中国水稻科学(Chin J Rice Sci),2024,38(2):140149 140 http:/ DOI:10.16819/j.1001-7216.2024.230502 水稻 D1 基因新等位突变体的鉴定与功能分析高郡茹 权弘羽 袁刘珍 李钦颖 乔磊 李文强*（西北农林科技大学 生命科学学院,陕西 杨凌 712100；*通信联系人,email:）Map-based Cloning and Functional Analysis of a New Allele of D1,a Gene Controlling Plant Height in Rice(Oryza sativa L.)GAO Junru,QUAN Hongyu,YUAN Liuzhen,LI Qinying,QIAO Lei,LI Wenqiang*(College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;*Corresponding author,email:)Abstract:【Objective】Plant height is an important agronomic trait in rice breeding.Identification of genes controlling plant height and their functional characterization can provide useful genetic resources for high-yield breeding.【Methods】A dwarf mutant,d1-11,was screened from the rice variety Nipponbare by EMS mutagenesis.Phenotypic and cytological observations,gene expression,hormone content and drought resistance were analyzed.The d1-11 mutant gene was identified through map-based cloning.【Results】The d1-11 mutant exhibits dwarfism,with more shortened and widened leaves,and more rounded grains compared to the wild type.The d1-11 mutant leaf has a smaller midvein,reduced number and area of large and small veins,resulting in abnormal leaf morphology in the d1-11 mutant.The d1-11 gene is genetically mapped between two molecular markers on rice chromosome 5.Map-based cloning reveals that a single base substitution at the junction of the ninth exon-intron in the D1 gene results in the loss-of-function mutation of d1-11.The D1 gene has a higher expression level in various tissues at the seedling stage,but the expression levels decrease from the tillering stage.Exogenous abscisic acid(ABA)treatment for 24 hours induces D1 gene expression,exogenous gibberellin(GA)treatment inhibits D1 gene expression,and salt stress treatment for 24 hours can strongly induce D1 gene expression.The contents of several hormones such as GA,brassinosteroid(BR),and indole-3-acetic acid(IAA)were increased in the d1-11 mutant.The d1-11 mutant shows a significant increase in relative water content(RWC)and a reduced rate of water loss in leaves.Furthermore,d1-11 mutant plants exhibit stronger resistance to drought stress.【Conclusion】The d1-11,a novel allele in D1 locus was identified in the present study.It was showed that the d1-11 mutant had increased levels of various endogenous hormones,increased leaf water content,and enhanced resistance to drought stress.This study will further enrich the genetic resources related to dwarfism and reveals some new biological roles of the D1 gene in rice.Key words:plant height;dwarfism;D1 gene;d1-11 mutant;plant hormones;drought stress 摘 要：【目的】株高是作物重要的农艺性状，挖掘株高控制基因并解析其分子功能，可为作物高产育种提供更多有用的基因资源。【方法】利用 EMS 诱变水稻日本晴获得的矮化突变体 d1-11 为材料，进行表型和细胞学观察，通过图位克隆的方法鉴定 d1-11 基因并对基因表达、激素含量和抗旱性进行了分析。【结果】d1-11突变体表现出植株矮化、叶片变短变宽和籽粒形态变圆表型；d1-11 突变体叶片中脉萎缩，大脉和小脉数量和面积减少，导致叶片形态变异。d1-11 基因被定位到水稻 5 号染色体 R5M15.2 和 R5M15.8 两个分子标记之间；图位克隆结果表明 d1-11 突变体中 D1 基因第 11 外显子和内含子交界处单碱基替换导致基因功能缺失。D1 基因在苗期各组织中表达量较高，从分蘖期开始表达量降低；外源脱落酸(ABA)处理 24 h 后诱导 D1 基因表达，外源赤霉素(GA)处理抑制 D1 基因表达，盐胁迫处理 24 h 诱导 D1 基因剧烈上调表达。d1-11 突变体植株 GA、油菜素内酯(BR)和生长素(IAA)等激素含量均上升，叶片相对含水量上升、叶片失水速率降低，植株对干旱胁迫抗性显著增强。【结论】鉴定到水稻 D1 基因新等位突变 d1-11，发现 d1-11 突变体多种内源激素水平上升、叶片含水量增加、植株对干旱胁迫抗性增强。本研究进一步丰富了水稻矮化基因资源并揭示 D1 基因新的生物学功能。关键词：株高；矮化；D1 基因；d1-11 突变体；植物激素；干旱胁迫 收稿日期：2023-05-06；修改稿收到日期：2023-06-18。基金项目：国家自然科学基金资助项目（32070197）；国家级大学生创新创业训练计划资助项目（S202110712667）。高郡茹等：水稻 D1 基因新等位突变体的鉴定与功能分析 141 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，2050 年全球人口将达到 100 亿，为满足人口增长对粮食的需求，将对水稻产量提出更高要求1。第一次农业“绿色革命”是在水稻和小麦等主要农作物中广泛利用株高降低的矮化植株来培育抗倒伏新品种，从而大幅度提高了粮食产量，缓解了饥饿问题2。株高作为农作物抗倒伏和高产育种的重要农艺性状，是影响水稻产量的重要因素之一，株高适当降低尤其是半矮化可以大幅增强水稻抗倒伏从而提高产量2。SD1（Semi-Dwarf 1）在水稻育种中的成功运用使全世界水稻单产提高了 20%30%。株高的降低可归咎于不同原因，但主要是由于赤霉素（gibberellin，GA）、油菜素内酯（brassinosteroid，BR）、独脚金内酯（strigolactone，SL）和细胞分裂素（cytokinin，CTK）等植物内源性激素生物合成或代谢异常，以及信号传导途径改变造成的3-8。此外，植物细胞壁发育异常、细胞延伸异常以及受到生物或非生物胁迫均会导致株高的改变9。目前，水稻中已报道的与株高相关的矮化和半矮化突变体基因超过 80 个（https:/ D1（Dwarf 1），编码异三聚体 G 蛋白 亚基10。D1 基因隐性突变导致水稻矮化，主要是由于茎秆节间的细胞分裂受到抑制11,12。研究表明，D1 基因突变导致植株对GA 和 BR 的敏感性均降低，说明 D1 同时参与 GA和 BR 信号通路13-15。另外，D1 基因突变可以提高水稻植株对干旱胁迫的抗性16，进一步说明 D1 基因在调控水稻生长发育过程中具有多个重要功能。在水稻中，最著名的株高调控基因是半矮化突变基因 sd1(semi-dwarf 1)2。然而，在过去的几十年里，单一的 SD1 等位基因在水稻育种中的广泛应用也给水稻生产带来了一些潜在的威胁17。因此，育种家和遗传学家们一直在努力探寻新的矮化基因资源并解析遗传和分子基础，从而为水稻遗传育种和生产实践提供更多可供利用的优良基因资源。本研究从水稻日本晴甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体中筛选到一个矮化突变体，因基因图位克隆表明其矮化性状由 D1 基因第 11 外显子/内含子交界处发生点突变导致，命名为 d1-11。对水稻 d1-11突变体进行了表型和细胞学分析，通过构建 F2群体进行分子标记和突变体基因图位克隆，明确 d1-11是 D1 基因位点的一个新等位突变；对 D1 基因组织表达和非生物胁迫处理应答进行了分析，并对d1-11 突变体内源激素含量和抗旱性进行了分析。本研究相关结果为丰富水稻矮化基因资源并探索 其新的生物学功能奠定了理论基础。1 材料与方法 1.1 材料 野生型为粳稻日本晴，矮化突变体 d1-11 来源于野生型种子的 EMS 诱变 M2群体；基因定位群体为 d1-11 突变体与籼稻 Kasalath 杂交 F1，然后自交获得 F2群体。在 F2群体中通过表型鉴定筛选出具有 d1-11 突变表型单株用于 DNA 提取和基因定位分析。野生型、突变体和基因定位群体于 20202022 年作为单季稻种植于陕西省汉中市的水稻试验田，4 月 10 日到 15 日播种，5 月下旬插秧（单本插），9 月初收获。1.2 方法 1.2.1 表型观察与石蜡切片 对野生型和突变体生长 15 d 的秧苗和抽穗期植株进行表型观察，统计株高、叶长和叶宽以及粒长、粒宽等农艺性状。剪取野生型和突变体分蘖期第二叶中部，用 FAA 固定液固定、乙醇脱水、石蜡包埋等步骤制备石蜡切片，用显微镜观察拍照。1.2.2 内源激素和叶片含水量测定 内源植物激素含量测定采用酶联免疫法18，每组样品包括 3 次生物学重复和 3 次技术重复。叶片相对含水量（RWC）的测定参考 Du 等19已报道的方法；离体叶片失水速率（RWL）的测定参考 Mao等20的方法。1.2.3 干旱胁迫处理及抗旱性分析 将野生型和突变体催芽后播种到装有营养土的塑料盆中，正常光照、温度和水分条件下培养 25 d，然后进行干旱胁迫，待野生型和突变体植株叶片干旱至半枯萎状态时进行复水，复水 10 d 后统计植株存活率。每个处理至少 3 次重复。1.2.4 DNA 提取、分子标记和基因定位方法 水稻基因组 DNA 的提取采用 CTAB 法21。首先根据日本晴和 Kasalath 基因组序列差异开发覆盖全基因组的 InDel 标记进行 PCR 扩增，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物多态性。基因初定位采用 Michelmore 等22提出的近等基因池（BSA）分析法，从 F2 群体中随机选取 12 株正常株和 12株突变株 DNA 等量混合，利用 InDel 标记对正常池和突变池进行分析，用两个基因池之间表现出扩增差异的 InDel 标记对 F2群体中突变体单株进行基因分型并构建连锁图谱。目的基因连锁的 InDel 分子标记引物序列见表 1。分子标记连锁图谱的构建142 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第38卷第2期(2024年3月)参考张敏娟等23。根据基因定位结果，参照RAP-DB数据库(https:/rapdb.dna.affrc.go.jp)和 MSU-RGAP数据库（http:/rice.uga.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/）水稻基因组的注解信息，在定位区间寻找候选基因并进行测序，从而确定目的基因。1.2.5 基因表达分析 取正常生长条件下野生型不同生长时期的不同组织，液氮速冻后80下保存备用，用于目的基因组织表达分析；对水稻培养液中生长两周的野生型植株进行高温（40）、低温（4）、GA(Gibberellin,50 mol/L）、ABA(Abscisic Acid,100 mol/L）、MeJA(Methyl Jasmonate,100 mol/L）、盐胁迫（NaCl,200 mmol/L）、PEG 模拟干旱胁迫（20%PEG）等处理不同时间并取叶片液氮速冻后80下保存备用，用于目的基因胁迫诱导表达谱分析；利用 Trizol 试剂盒（TaKaRa 公司）提取总RNA；利用反转录试剂盒（北京迪宁生物公司）将各组织样品 RNA 反转录成 cDNA，然后利用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）进行目的基因表达分析，操作步骤参考 Li 等24。RT-qPCR 引物序列见表 1。启动子序列原件分析利用 PlantCARE 在线软件(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/）按照默认参数进行操作。2 结果与分析 2.1 水稻矮化突变体 d1-11 表型分析 突变体在幼苗期已呈现出极度矮化表型。生长15 d 的 d1-11 突变体地上部和地下部都明显比野生型短（图 1-A）。在抽穗期，突变体表现为明显的矮化表型（图 1-B）。同野生型相比，突变体叶片变宽、变短（图 1-C），突变体成熟的籽粒变宽、变短（图 1-D、E）。2.2 d1-11 突变体叶片的细胞学形态观察 对野生型和 d1-11 突变体叶片进行石蜡切片和显微观察（图 2）。同野生型相比（图 2-A），突变体叶片的中央叶脉缺少气腔和中央维管束细胞，且没有形成明显的中脉结构（图 2-D），突变体中脉的面积显著缩小（图 2-G）。此外，同野生型的大叶脉（图 2-B）和小叶脉（图 2-C）相比，突变体的大叶脉和小叶脉面积显著变小（图 2-E、F）。2.3 d1-11 突变体内源性激素水平分析 由于植物株高的剧烈改变常常与植物激素相关，因此对野生型和 d1-11 突变体中的 GA、BR、IAA、ABA 等多种内源性激素含量进行测定。同野生型相比，突变体植株内 GA3、GA4、BR、IAA、ZR 和 DHZR 水平均显著升高，ABA、MeJA 和 IPA 表 1 本研究所用引物序列 Table 1.Primer sequences used in this study.标记名称 Marker name 正向引物序列 Forward primer sequence(5-3)反向引物序列 Reverse primer sequence(5-3)用途 Use R5M8 CGAGATGGAGGGATTTGAC CCCGATGACTAGGGATTAGAG 基因定位 Gene mapping R5M10 TACAAAATATGCCCGTGTCG GATCGTTCCGCAAACAGAG 基因定位 Gene mapping R5M12 GGTAGGAGGTGGAAGAAGG TTTAGAGGGTCGGGCGATT 基因定位 Gene mapping R5M14 CGTCAACAGGCTTGAAAGA TTGCCAGTCCCAAAGAGTA 基因定位 Gene mapping R5M14.5 AACGCAGTTGTGCTAATCAG AGATCTTGTTGCCAAAAAAT 基因定位 Gene mapping R5M15 GACATTTCGTGTGAATTGTT TTCACAACTTCACTCGAGAC 基因定位 Gene mapping R5M15.2 ATTAAGGTAGGGGCATGAAT ATCACAAAGCAGTTTCCAGA 基因定位 Gene mapping R5M15.6 ACAAAAATATGATGTGGCAA CAACCCAGAAACCATCTAGT 基因定位 Gene mapping R5M15.8 CTGAGAATGACTGCTCCGAA CTTAGCGCATGAGTGGTTTT 基因定位 Gene mapping R5M16 CCCACTGTATTGGATTCTGC CCACCAGGTCCCACGTTAT 基因定位 Gene mapping R5M18 AATGCCCTTCTCATCCGTGTG GTCTATGCGTGCTGTGGGCTA 基因定位 Gene mapping D1-1 AAGAGAGAGGCTCAGGCATG GGAACTCAAAAGCTCAAGGT 突变位点检测 Mutation site detection D1-2 GGTGCAAAACTGCTGTGAAT GTGGGCTATGCAAATTAACA 突变位点检测 Mutation site detection CDS-9F/13R AAACAAAAGAGGTGGAGAGG TCTCATGCTCTCATCAATCA cDNA 测序 cDNA sequencing CDS-10F/12R GAATGATGGAGACCAAGGAA CTGTTTCCCAGGTGCAATAG cDNA 测序 cDNA sequencing UBQ-qPCR GGACTGGTTAAATCAATCGTCA CCATATACCACGACCGTCAAAA qRT-PCR D1-qPCR CAGGAGGTTGAACATGCATATG CCTGTGTGACTTACAACCTAGT qRT-PCR 高郡茹等：水稻 D1 基因新等位突变体的鉴定与功能分析 143 水平有所升高（图 3），表明 d1-11 突变体中多种内源性激素含量发生改变。2.4 d1-11 突变体基因精细定位与图位克隆 突变体与籼稻 Kasalath 杂交 F1代株高正常，F2植株出现株高正常和矮化两种表型。在 1161 株 F2植株中，有 287 株表现为突变体表型，正常表型与突变表型经卡方检验（2=0.04920.05,1=3.84）符合31 的隐性单基因的分离比，表明 d1-11 突变体为细胞核单基因隐性突变导致。基因初步定位结果显示 d1-11 基因与水稻 5 号染色体上 R5M12、R5M1、R5M16 和 R5M18 等 4个 InDel 标记连锁（图 4-A）。利用上述 InDel 分子标记对 F2群体中 144 个突变体单株进行连锁分析（图 4-A），结果发现 R5M12、R5M14、R5M16和 R5M18 标记在 144 个单株中分别检测到 7、6、2和27次交换，表明这些分子标记与d1-11基因连锁。而且 R5M14 与 R5M16 标记处检测到发生重组的单株完全不同，表明 d1-11 基因位于分子标记 R5M14和 R5M16 之间。进一步在 R5M14 与 R5M16 之间开发出 5 个新的 InDel 标记（图 4-B），分子标记 R5M14.5、R5M15、R5M15.2、R5M15.6、R5M15.8 分别在 144 个突变单株检测到 4、2、1、0 和 1 次交换；由于 R5M15.2和 R5M15.8 所检测到的交换单株不同，表明 d1-11基因位于分子标记 R5M15.2 和 R5M15.8 之间，且与 R5M15.6 共分离（图 4-B），从而将目标基因 A：生长 15 d 的野生型和突变体幼苗；B：抽穗期的野生型和突变体植株；C：抽穗期叶片，从左向右依次为剑叶、倒 2 叶、倒 3 叶；D、E分别为野生型和突变体籽粒表型；FL 分别为生长 15 d 的野生型和突变体幼苗的根长（F）、株高（G），抽穗期株高（H）、叶长（I）、叶宽（J）、粒长（K）和粒宽（L）比较。误差线表示平均值标准差（n=20）。*P0.01（t 检验）。A,Seedlings of 15-day-old WT and d1-11;B,Morphology of WT and d1-11 at the heading stage;C,Phenotypes of WT and d1-11 leaves at the heading stage.From left to right,three leaves represent flag leaf,the second leaf and the third leaf;D and E,Seed morphology;F-L,Agronomic comparison between WT and mutant.Bars represent mean SD(n=20).*P0.01（the Students t-test）.图 1 野生型与突变体 d1-11 的表型特征 Fig.1.Phenotypic characterization of WT and d1-11 mutant 144 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第38卷第2期(2024年3月)定位到 R5M15.2 和 R5M15.8 所框定的 600kb 的物理区间内。通过对 R5M15.2 和 R5M15.8 所在区间的基因注释进行分析，发现该区间内有已报道的株高矮化控制基因 D1（Dwarf 1,Os05g0333200），编码三聚体 G 蛋白亚基。d1-11 突变体与先前已报道的 D1 基因功能缺失突变体表型非常相似，初步表明 d1-11 基因是由于 D1 基因突变导致。进一步对野生型和 d1-11 突变体中 D1/Os05g0333200 基因的DNA 序列进行测定，结果表明在 d1-11 突变体中D1 基因第 11 外显子和内含子交界处发生了 1 个碱基替换（图 4-C、D），很可能导致突变体中该基因 mRNA 剪切发生错误。进一步对野生型和 d1-11突变体的D1基因进行RT-qPCR扩增和cDNA序列测定，结果显示 d1-11 突变体中该碱基突变导致mRNA 剪切错误，第 11 内含子没有发生剪切。与野生型相比，突变体在 CDS 区增加了 77 个碱基，造成蛋白移码突变，蛋白合成提前终止（图 4-E、F）。2.5 D1 基因的组织表达模式分析 对不同发育时期和不同组织中 D1 基因（Os05g0333200）的表达进行 RT-qPCR 分析（图 5），表明 D1 基因在生长 6 d 幼苗的根中表达量相对最高，6 d 的芽中表达量次之；在分蘖期的根，抽穗AC:野生型叶片中脉、大脉和小脉的横切面；DF:突变体叶片中脉、大脉和小脉的横切面；GI:野生型和突变体叶片中脉、大脉和小脉的面积统计；JK:野生型和突变体每叶大脉和小脉数目统计。LV:大脉；SV:小脉；As:气腔。图中误差线表示平均数标准差(n=9)。*P0.01（t 检验）。A-C,Leaf midrib,large vein and small vein in WT;D-F,Leaf midrib,large vein and small vein in mutant;G-I,Area of leaf midrib,large vein and small vein in WT and mutant;J-K,Number of large and small veins per leaf in WT and mutant.LV,large vein;SV,small vein;As,Air space.Bars represent mean SD(n=9).*P0.01（the Students t-test）图 2 野生型和突变体叶片横切面石蜡切片观察 Fig.2.Cross section of leaves of the wild type and the mutant 图中误差线表示平均数标准差（n=9）。*P0.05;*P0.01（t 检验）。Bars represent mean SD(n=9).*P0.05;*P0.01(t-test).图 3 野生型和 d1-11 突变体内源性激素水平比较 Fig.3.Comparison of hormone levels in the wild type and the d1-11 mutant 高郡茹等：水稻 D1 基因新等位突变体的鉴定与功能分析 145 期的根、倒 2 叶和穗中表达量较低。总体而言，D1在苗期的表达水平较后期高（图 5）。2.6 D1 基因启动子功能元件及诱导表达分析 为了揭示 D1 基因对环境胁迫的响应状况，利用在线软件 PlantCARE 对其启动子序列进行分析。分析结果显示，D1 基因含有脱落酸响应元件 ABRE，生长素响应元件 TGA，MeJA 响应元件 TGACG-motif，低温响应元件 LTR 和光响应元件 GATA-motif 等。为进一步分析 D1 基因在非生物胁迫和外源激素处理下的应答，对 D1 基因进行了诱导表达分析。结果显示，ABA 处理 24 h 能够诱导 D1 基因表达，而 GA 在处理 3 h 开始抑制 D1 基因表达；干旱胁迫处理 1 h 开始抑制 D1 表达，但 24 h 恢复正常水平；盐胁迫处理 24 h 能够剧烈诱导 D1 基因表达（图 6）。A、B：d1-11 的分子标记定位；C：D1 基因结构及突变位点分析；D：野生型和 d1-11 突变体测序结果；E：野生型和 d1-11 的 RT-PCR 扩增结果,M 为标记,从上至下依次为 1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp；F：野生型和 d1-11 突变体中 D1 基因 CDS 区 cDNA 序列比对。A and B,Genetic mapping of d1-11;C,Gene structure of D1;D,Sequence comparison between WT and d1-11;E,RT-PCR analysis of D1 gene in WT and the d1-11 mutant.M,DNA marker;F,Alignments of D1 gene cDNA sequence in WT and d1-11.图 4 d1-11 基因的遗传定位与图位克隆 Fig.4.Genetic mapping and map-based cloning of the d1-11 gene 图 5 D1 基因的组织表达模式分析 Fig.5.Temporal and spatial expression pattern of the D1 gene in wild type plants 146 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第38卷第2期(2024年3月)2.7 d1 突变体对干旱胁迫抗性增强 对生长 25 d 的野生型和突变体进行了干旱胁迫处理，结果表明干旱胁迫 8 d 后野生型叶片已经发黄变枯、植株萎蔫，而 d1-11 突变体才刚刚开始表现发黄迹象，在干旱胁迫下生长状态明显较野生型耐旱(图 7-A)；胁迫后复水 5 d，野生型植株仍旧萎蔫未复活，但 d1-11 突变体叶片变绿并开始正常生长，并且在干旱胁迫后存活率明显高于野生型，表明突变体对干旱的抗性增强(图 7-C)。进一步对正常生长条件下的植株叶片相对含水量和离体叶片失水速率进行分析（图 7-C、D），结果显示野生型叶片的相对含水量显著低于突变体（图 7-D）；与之相对应的是突变体叶片失水速率显著慢于野生型（图 7-E）。A:野生型和突变体干旱胁迫前、胁迫后和复水 5 d 后的表型特征；B:野生型和突变体干旱胁迫后存活率比较；干旱胁迫数据来源于 3 次独立实验；C、D:正常条件下野生型和突变体的叶片相对含水量（C）和失水速率（D）比较。图中误差线表示平均数标准差(n=9)。*表示P0.05，显著差异，*表示 P0.01，极显著差异（t 检验）。A,Phenotypes of WT and mutant under drought stress;B,Survival rate of WT and the mutant after recovery for 5 days;C and D,Relative watercontent(RWC)and rate of water loss(RWL)in WT and the mutant under non-stressed conditions.Bars represent mean SD（n=9）.*and*indicatesignificant difference between WT and the d1-11 mutant by the Students t-test(P0.05,P0.01),respectively.图 7 d1-11 突变体对干旱胁迫的抗性分析 Fig.7.Analysis of drought resistance in the d1-11 mutant 图 6 D1 基因在外源激素和非生物胁迫处理下的表达分析 Fig.6.Expression analyses of D1 gene under applications of plant hormones and abiotic stresses conditions 高郡茹等：水稻 D1 基因新等位突变体的鉴定与功能分析 147 3 讨论 本研究鉴定到 D1 基因的一个新等位突变体d1-11，由于其第 11 外显子与内含子交接处 1 个碱基发生突变导致内含子不能剪切，从而导致 CDS区移码突变，植株矮化、叶色深绿、叶片变宽、籽粒变圆变小。除了株高，d1-11 最显著表型是叶片形态变异，主要由于叶中脉萎缩，大脉和小脉变小、变少。另外，d1-11 突变体植株抗旱性显著增强。株高是水稻遗传育种中最受关注的农艺性状之一，适当降低株高尤其是植株半矮化可以大幅增强抗倒伏从而提高产量2。SD1 编码赤霉素代谢途径关键酶 GA20ox2，基因突变导致植株半矮化从而抗倒伏，且 sd1 突变体育性和结实率都没有显著降低，因而使水稻产量大幅提升，进而在全世界被广泛利用4,25-26。多蘖矮化基因 D3 编码富含亮氨酸重复序列的 F-box 蛋白，对独脚金内酯信号转导是必需的，d3 突变体表现为株高变矮，分蘖增多27-29。此外，水稻 D1、D6、D10、D11、D18、D27、D35、D53、SD8、DLT 和 D88 等矮化或半矮化基因已先后 被 鉴 定 并 深 入 研 究30-31。先 前 研 究 表 明D1/RGA1/D89 基因编码异三聚体 G 蛋白亚基，控制水稻的株高；D1 隐性突变导致植株矮化，并伴有其他表型，如茎秆增粗、叶片短且宽、叶色暗绿、穗形直立、着粒紧密、谷粒小而圆等。d1 矮秆突变表型不能被外源 GA 诱导而恢复正常，说明造成 d1突变体矮秆的原因是节间的细胞分裂受到抑制，而不是 GA 等代谢改变11-12,32。本研究从水稻日本晴EMS 诱变群体中筛选到一个极矮化突变体 d1-11，图位克隆表明其矮化性状由 D1 基因第 11 外显子/内含子交界处发生点突变导致。我们研究发现d1-11 突变体中 GA、BR 和 IAA 等多种植物激素含量发生改变。由于三聚体 G 蛋白作为动、植物细胞内 G 蛋白偶联受体介导的信号转导途径中的关键因子，G 蛋白 亚基常常受到受体的激活进而去激活效应蛋白从而传导信号。d1 突变体矮秆的原因主要归咎于节间细胞分裂受到抑制，突变体内包括GA 等多种植物激素的改变可能是由于细胞分裂受到抑制从而对激素的合成产生反馈调节。先前研究证实 D1 编码由 380 个氨基酸组成的异三聚体 G 蛋白 亚基，包括 13 个外显子和 12 个内含子，在水稻株高及根系发育过程中都起着重要作用14,33。先前研究已鉴定的几个 d1 突变体均表现出矮化、叶短而宽且籽粒变小等表型11-12,16，与本研究所获得的 d1-11 突变体的表型相似，但 D1基因突变方式或位点不一样。Ashikari 等11发现 fl2 突变体发生 D1 基因 833 bp 碱基的缺失，导致 G 蛋白亚基功能缺失。Fujisawa等12报道了cm1361-1、dk22、id-1、dkt-1 和 dkt-2 五个 D1 基因位点的等位突变体，均由于编码区发生不同程度的突变造成，导致蛋白结构发生改变。Epi-d1 突变体在启动子区内存在两个 SNP，即起始密码子上游 335 bp 位点 C突变成 T，775 bp 处 G 突变成 A，因而该突变体在同一植株上会出现正常分蘖和矮化分蘖两种分蘖类型，大多数正常分蘖具有与野生型相似的表型特征，大多数矮化分蘖具有深绿色的叶子、紧密的圆锥花序和小而圆的种粒，但在一些穗中也出现正常种粒与圆小种粒嵌合的表型34。RGA1ko-1 突变体是在中花 11 中敲除了 D1/RGA1 得到的，突变体中有 1269 bp 碱基缺失35。d-ss 突变体中 D1 基因在编码区中 928938 位和 10701074 位发生了两处碱基突变，导致翻译提前终止，D1 基因功能缺失，赤霉素信号转导过程受阻，导致突变体植株矮化36。本研究发现 d1-11 突变体是在 D1 基因第 11 外显子与内含子交接处发生 1 个碱基替换（突变发生在内含子），从而使第 11 内含子在成熟 mRNA 中不能正常剪接，导致 d1-11 突变体中发生了蛋白移码突变，翻译提前终止，从而造成植株矮化、种粒变小等异常表型，但突变体的育性或结实率不受影响。由此可见，本研究鉴定到 D1 基因位点上一个新的功能缺失突变体。本研究也表明 D1 基因外显子和内含子选择性剪切对于调控转录后表达以及蛋白三维结构的形成均起着至关重要的作用。因此，d1-11 突变体对研究水稻基因选择性剪接的发生机制具有一定的参考价值37。表型分析显示 d1-11 突变体叶片变短变宽，叶色深绿；细胞学切片分析表明突变体叶片中脉萎缩、气腔缺失，大叶脉和小叶脉均显著变小且数目变少，这是导致 d1-11 突变体叶形态发生异常的重要原因。先前研究表明叶中脉缺失突变体多为 DL 基因突变导致，例如 dl-sup1、dl-1、dl-2、dl-14 和 dl-6 等突变体中脉均发生萎缩38-40。d1-11 突变体气腔缺失可能是导致突变体叶片颜色更深的重要原因。先前研究认为气腔缺失导致该部分细胞没有发生程序性细胞死亡，叶肉细胞填充，从而使得叶片有更强的光合能力，导致叶片颜色更深40。本研究中，组织表