一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究.pdf

93-08网络首发时间：2 0 2 3-10-0 92024,54(01):93-100中国兽医科学2024,54(01)ChineseVeterinaryScienceD0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0007中图分类号：S852.617文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6（2 0 2 4)0 1-0 0株猪丹毒杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究刘武函1.2,胡巧云,董尚坤1,唐小明,王卫国,彭志？，谢怡灵?，张坤,王昌建”，范仲鑫,杨青*（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128;2.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙410014)摘要：为确定湖南省某猪场猪只发病死亡的病原，从送检猪组织中分离纯化获得1株革兰阳性菌，通过生化鉴定及16 SrDNA测序对分离菌进行了鉴定，药敏试验验证分离菌的耐药性，并进一步测序分析了其毒力因子基因的遗传变异；最后通过动物试验研究了分离菌对小鼠的致病性。结果显示，分离菌呈针尖大小、半透明，生化鉴定为猪丹毒杆菌。药敏试验结果显示该分离株对青霉素、苯唑西林、氨苄西林等15种抗生素敏感。分离株16 SrDNA序列与猪丹毒疫苗株G4T10的同源性为10 0%；与G4T10株相比，SpaA基因高突变区存在4个突变位点，分别是A509C、C510 A、A 92 4C和C925T，相对应的氨基酸有3个突变位点，包括P170H、D 30 8 E和F309L，而其他毒力因子基因包括神经氨酸酶基因、英膜多糖A、B和C基因序列则无变化。小鼠攻毒试验显示，当剂量为1.46 6 X103CFU或更高时，小鼠呈全身败血症病理变化，死亡率10 0%，说明该菌株毒力较强；从死亡小鼠各脏器组织中可分离到与分离株形态特征一致的菌株。本研究成功分离鉴定了1株毒力较强的猪丹毒杆菌，为湖南省猪丹毒的流行病学及致病性提供了参考关键词：猪丹毒杆菌；生化特征；spaA基因；致病性Isolation,identification and pathogenicity in mouse of a strain ofErysipelothrix rhusiopathiaeLIU Wuhan2,HU Qiaoyun?,DONG Shangkun,TANG Xiaoming?,WANG Weiguo,PENG Zhi?,XIE Yiling,ZHANG Kun”,WANG Changjian”,FAN Zhongxin*,YANG Qing1*(1.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Center forAnimal Disease Control and Prevention,Changsha 410014,China)Abstract:To determine the cause of pig death in a pig farm in Hunan Province,a strain of Gram-posi-tive bacterium was isolated and purified in the collected tissues.The strain was identified throughbiochemical characteristics and 16S rDNA sequencing,antimicrobial susceptibility test was used toverify drug resistance of the isolated bacteria.Further sequencing analysis was conducted to determinethe genetic variation of virulence factor genes of the isolated strain.In addition,the pathogenicityof the strain in mice was studied.The results showed that the isolated bacterium was characterized byneedlepoint-sized,translucent colonies,and identified as Erysipelothrix rhusiopathiae.The isolatedstrain was sensitive to 15 antibiotics such as penicillin,oxacillin,ampicillin and etc.The 16S rDNAsequence analysis revealed that the isolated strain was 100%homology to the vaccine strain G4T10.Thesequence of the hypervariable region in spaA gene showed four nucleotide mutations in the sites of收稿日期：2 0 2 3-0 7-0 6；修回日期：2 0 2 3-0 9-2 2基金项目：湖南省技术攻关“揭榜挂帅 项目（2 0 2 1NK1030）；湖南省生猪产业技术体系专项作者简介：刘武函（1998-），男，河南商丘人，硕士生，研究方向为动物疫病防治，E-mail：l i u w u h a n s t u.h u n a u.e d u.c n。*通讯作者：范仲鑫，研究方向为动物传染病防控，E-mail:；杨青，研究方向为家畜繁殖管理与繁殖障碍致病机制,E-mail:。94第54卷中国兽医科学A509C,C510A,A924C and C925T compared with the G4T10 strain,with three mutations in its amino acidsincluding P170H,D308E and F309L.However,sequences of other virulence factor genes,including sialidasegene,capsular polysaccharide A,B,and C gene,remained unchanged.The animal experiment showed that allmice exhibited systemic sepsis with 100%of mortality when the mice were challenged with 1.466X103 CFUor higher titers of the isolate,indicating that the isolated strain is highly virulent.Bacteria wereisolated from the tissues of the dead mice which were consistent with the morphological characteristicsof the strain.In this study,a high virulence strain of E.rhusiopathiae was successfully isolated andidentified,the data could provide a reference for the epidemiology and pathogenicity of swine erysipelasin HunanProvince.Key words:Erysipelothrix rhusiopathiae;biochemical characteristic;spaA gene;pathogenicity*Corresponding authors:FAN Zhongxin,E-mail:;YANG Qing,E-mail:qingyanghnhunau.*Corresponding authors:FAN Zhongxin,E-mail:;YANG Qing,E-mail:猪丹毒杆菌又称红斑丹毒丝菌（Erysipelothrixrhusiopathiae),为革兰阳性菌，菌体细长,0.8 2.0 m，单个或成链状存在，目前已发现有50 多种宿主，可从哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类等多种动物体内分离得到1-2 。猪丹毒杆菌感染可引起动物的丹毒病，导致火鸡、鸡和海豚的败血症及其他养殖动物的慢性疾病1.3,也有多起病例报告感染人，引起皮肤和全身疾病4。猪丹毒病在临床上表现为急性或亚急性败血症和慢性增生性疾病,急性型由毒力较强的猪丹毒杆菌引起，感染猪只迅速死亡或出现败血症；亚急性型在感染2 3d后皮肤发生病变；急性或亚急性可发展为慢性，常发生慢性关节炎与病理性增生性内膜炎5。猪丹毒病曾被我国列为猪场三大疫病之一，至今尚未完全控制，给养猪业造成严重的经济损失。近年来，猪丹毒在多个国家和地区均有报道，发病量呈上升趋势，存在较大的局部暴发风险6-7 表面抗原A(surface protective antigen A,SpaA)被鉴定为猪丹毒杆菌的一种主要保护性抗原8 。SpaA蛋白对多种血清型猪丹毒杆菌引起的感染具有较好的免疫保护效果。张一帜等19通过大肠杆菌原核表达，经纯化获得的猪丹毒杆菌重组SpaA蛋白对我国主要流行的1a、1b 及2 型猪丹毒均具有很好的保护作用。spaA也是一种重要的毒力相关基因,在猪丹毒杆菌的致病机制中发挥着重要作用,其蛋白C末端介导丹毒杆菌的黏附、迁移以及摄取营养等,并参与调节菌株的毒力10-11。猪丹毒杆菌菌株如G4T10和SE38的基因组高度相似，但两者spaA基因的差异导致其毒力的差异12 。因此，常通过比对 spaA基因高突变区序列来分析猪丹毒杆菌的遗传变异情况。2022年5月，湖南省益阳市桃江县某猪场出现疑似猪丹毒，收集病死猪组织,通过分离、纯化和生化鉴定获得1株猪丹毒杆菌，并通过16 SrDNA和spaA基因高突变区测序加以验证,进一步通过接种小鼠确定了其致病性1材料与方法1.1主要试剂猪圆环病毒2 型和3型双重实时荧光PCR试剂盒（批号：2 0 2 2 0 52 3P）购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。猪肺炎支原体核酸荧光试剂盒（批号：20210518)与猪胸膜肺炎放线杆菌/猪链球菌II型/副猪嗜血杆菌三通道核酸荧光试剂盒（批号：20211108)均购自广州达安生物科技有限公司。非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒(（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)和伪狂犬病毒（PRV)四通道荧光检测试剂盒（批号：2 0 2 10 0 4），猪细小病毒探针法qPCR试剂盒（批号：TG0220220402）与猪丹毒杆菌实时荧光PCR试剂盒（批号：312 0 2 2 0 0 1）均购自湖南国测生物科技有限公司。琼脂粉购自上海嘉合生物有限公司。胎牛血清(FBS)购自北京政博伟业生物科技有限公司。革兰染色液购自广东环凯微生物科技有限公司。PCR反应所用HiFiPCRSuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。6 X上样缓冲液（loadingbuffer）、D L2 0 0 0 D NA M a r k e r 均购自广州东盛生物科技有限公司。胰酪大豆陈肉汤培养基(TSB）、胰酪大豆陈肉汤琼脂培养基（TSA)和革兰阳性细菌鉴定/药敏板均购自碧迪医疗器械（上海）有限公司。抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司1.2病料来源2022年5月，益阳市桃江县某猪场16 日出现死猪4头、18 日死亡9头、19日至2 4日每天死亡95刘武函等：一株猪丹毒杆菌的分定及其对小鼠的致病性研究第1期13头；部分猪只出现精神萎靡、咳嗽、腹式呼吸、腹泻、颗粒粪与血便等症状；怀孕母猪流产甚至死亡。剖检见腹股沟淋巴结肿大、脾梗死、肺水肿等病理变化。收集样品送检，包括血液9份，猪心内膜积液1份，肺、肝和脾组织共8 份1.3实验动物60只6 周龄昆明小鼠，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号：SCXK湘2019-0004），自由采食和饮水，适应性饲喂5d后开始实验1.4常见病原的检测取8 份病料组织，每份约0.1g,分别放入含1mL生理盐水的离心管中匀浆。取2 0 0 L组织匀浆液，用全自动核酸提取仪（西安天隆，NP968)提取核酸，对猪常见病原及病死猪疑似病原进行实时荧光PCR或者RT-PCR检测，反应程序按照试剂盒说明书进行。1.5细菌的分离培养与纯化无菌条件下采集各组织病料，接种于含10 0 mL/LFBS的TSA平板中,37 培养2 4h。挑取优势菌的单个菌落,采用三区划线接种于TSA平皿中,将纯化后的细菌用于后续鉴定1.6细菌的全自动生化反应鉴定与药敏试验使用全自动微生物鉴定与药敏分析仪（BDPhoenixM50)鉴定纯化后的细菌,用棉签沾取平皿上的细菌接种至培养液中，调整浊度为0.5MCF,倒人细菌鉴定卡内，在分析仪中检测。同时，选取常见的2 0 种抗生素，采用K-B纸片扩散法进行细菌耐药性试验。挑取单菌落接种于TSB（含10 0 mL/LFBS)培养基中,37 振荡培养12 h;取适量菌液均匀涂布于TSA（含10 0 mL/LFBS)平板上,并将药敏纸片等距贴在平板表面，37 培养2 4h后测量抑菌圈直径。参照美国临床和实验室标准协会（CLSI)标准判断分离菌对抗生素的敏感性,并记录结果。1.7分离株16 SrDNA基因和spaA基因高突变区的扩增细菌16 SrDNA通用引物序列信息：F：5-A G A-GTTTGATCCTGGCTCAG-3,R:5-AAGGAGGT-GATCCAGCC-3；s p a A 基因引物序列参照文献13。引物均由生工生物工程（上海)股份有限公司合成。PCR反应体系（2 5L):HiFiPCRSuperMix12.5L，上下游引物各2 L，待测模板1L,ddH,O7.5L。PCR 反应条件：94预变性5min;94变性30 s,55退火40 s,72延伸1min,30个循环；最后7 2 延伸6 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送至北京擎科生物科技股份有限公司（长沙）进行测序1.8分离株生长曲线的绘制将纯化后的猪丹毒杆菌在TSA平板(添加10 0 mL/LFBS)上三区划线，37 培养48 h，挑取单个丹毒杆菌菌落接种于3mLTSB培养基（添加10 0 mL/LFBS)中，置于摇床上培养12 h(37,2 0 0 r/m i n）。取60L菌液加入6 0 mLTSB中，置于摇床上（37,2 0 0r/min）,此时计为h,之后每隔1h取样用分光光度计测定6 0 0 nm处吸光度值（D600m），做3次重复。1.9分离株对小鼠的致病性试验与毒力基因的扩增将分离株稳定期的菌液10 倍梯度稀释，并涂布计数。将试验小鼠随机分为5组，每组12 只，对照组小鼠腹腔注射TSB(0.2mL/只）,攻毒组小鼠分别腹腔注射等量梯度稀释的菌液（10 110 4倍稀释），每日3个时间点（9:0 0、15：0 0 和2 1:0 0）观察记录小鼠临床症状和死亡情况,连续观察7 d。如有死亡，解观察其病理变化，收集典型病变组织进行切片观察、苏木素一伊红(HE)染色镜检，并采集心、肝、脾、肺等脏器进一步分离鉴定细菌。同时采用PCR法扩增分离菌毒力因子包括神经氨酸酶(Sialidase)及荚膜多糖(Capsularpolysaccharide,CPS)A、B和C的基因片段,引物序列与PCR反应条件参照文献14，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送至北京擎科生物科技股份有限公司（长沙）进行测序2丝结果2.1常见病原的检测8份组织样品的检测结果显示，3种病原（包括猪圆环病毒2 型、猪细小病毒与猪丹毒杆菌）呈阳性,而猪圆环病毒3型、猪肺炎支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌II型、副猪嗜血杆菌、非洲猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原呈阴性，提示该猪场存在猪圆环病毒2型、猪细小病毒与猪丹毒杆菌的混合感染2.2细菌的分离培养病料经TSA平板划线接种培养后,从肺组织中分离到针尖大小、透明、突起、露珠样的菌落（图1A）；分离菌呈革兰阳性，小短杆状（图1B），疑似为猪丹毒杆菌2.3分离菌株的生化鉴定与药敏试验采用全自动微生物鉴定与药敏分析仪鉴定了45种生化指标,结果如表1所示，L一苯丙氨酸-甲基香豆素、L-精氨酸-甲基香豆素、L-亮氨酸-甲基香96第54卷中国兽医科学B图1分离菌株菌落形态与革兰染色Figure 1Colony morphology and Gram staining of the iso-lated strainA：菌落形态;B：革兰染色。A:Colony morphology;B:Gram staining.豆素、L-焦谷氨酸-甲基香豆素、4MU-磷酸盐-BD-氨基葡糖苷、L-丙氨酸-甲基香豆素、蛋氨酸-甲基香豆素等7 种为阳性,其余指标均为阴性,所分离菌株鉴定为猪丹毒杆菌，可信值为99%。从药敏试验结果发现，该分离菌株对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮、四环素、多环西素、米诺环素和头孢曲松等15种抗生素敏感，而对丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和红霉素等耐药。表1分离菌株的生化鉴定Table 1 Biochemical identification of these isolated strains检测项目结果检测项目结果检测项目结果ItemResultItemResultItemResult甘氨酸-脯氨酸-甲基香豆素L-苯丙氨酸甲基香豆素-酮戊二酸+Glycine-proline-Methyl-L-Phenylalanine-Methylcoumarin-Ketoglutaric acidcoumarinL-精氨酸-甲基香豆素L-组氨酸-甲基香豆素L-异亮氨酸-甲基香豆素+L-Arginine-MethylcoumarinL-Histidine-MethylcoumarinL-Isoleucine-Methylcoumarin精氨酸-精氨酸-甲基香豆素L-亮氨酸-甲基香豆素L-脯氨酸-甲基香豆素+Arginine-arginine-L-Leucine-MethylcoumarinL-Proline-MethylcoumarinMethylcoumarinL-焦谷氨酸-甲基香豆素L-色氨酸-甲基香豆素D-葡萄酸+L-Pyroglutamic acid-MethylcoumarinL-Tryptophan-MethylcoumarinD-Grape acid4MU-磷酸盐-BD-氨基葡糖苷多黏菌素ED-果糖4MU-Phosphorous+Polymyxin ED-Fructosesalts-BD-glucosaminide蛋氨酸-甲基香豆素D-甘露醇亚氨基二乙酸+Methionine-MethylcoumarinD-MannitolIminodiaceticacidL-丙氨酸-甲基香豆素3-甲基-已二酸多黏菌素B+L-Alanine-Methylcoumarin3-Methyl group-adipic acidPolymyxin B胸苷4MU-葡糖苷4MU-磷酸盐Thymidine4MU-Glucosidase4MU-Phosphoroussalts4MU-BD-半乳糖苷4MU-BD-葡糖苷酸PNP-BD=葡糖苷4MU-BD-galactoside4MU-BD-GlucuronidesPNP-BD=Glucosidase4MU-磷酸盐（有海藻糖）3-甲基戊二酸4MU-BD-纤维二糖糖苷4MU-phosphorous salts3-Methylglutaricacid4MU-BD-Cellodiglycosides(Contains trehalose)缬氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺丙氨酸一丙氨酸-对硝基苯胺L-脯氨酸-硝基苯胺Valine-alanine-p-nitroani-Alanine-alanine-p-nitroanilineL-proline-nitroaniline1ine4MU-AD-葡糖苷PNP-磷酸盐-龙胆二糖4MU-AD-GlucosidasePNP-Phosphoroussalts-Gentiobiose葡萄糖燕糖D-塔格糖GlucoseSucroseD-TagatoseD-海藻糖麦芽糖麦芽丙糖D-Trehalose anhydrousMaltoseMaltotricseN-乙酰-葡糖胺尿素酶七叶酸N-Acetyl-glucosamineUreaseAescinicacid2.4分离株的16 SrDNA鉴定以分离株为模板，采用PCR扩增其16 SrDNA，产物经琼脂糖凝胶电泳分离，在150 0 bp处得到与预期大小一致的目的片段（图2）,将产物测序,通过Blast比对分析，显示该分离菌16 SrDNA序列与猪丹毒疫苗株G4T10的同源性为10 0%（结果未显示）2.5分离株spaA基因高突变区的测序对扩增的spaA基因高突变区产物经琼脂糖凝97刘武函等：一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究第1期M122.000bp1 000bp750bp500bp250bp100bp图2 分离株16 SrDNA基因的PCR扩增Figure 2Amplification of the 16S rDNA of the isolatedstrainbyPCRM:DNA分子质量标准；1：阴性对照；2：分离株。M:DL2000 DNA Marker;1:Negative control;2:Isolates.胶电泳分离，得到与预期大小一致的目的片段（图3A)。测序结果经过Blast比对分析，显示与猪丹毒杆菌G4T10株核苷酸的同源性为99.0 7%。spaA基因高突变区位于该基因的第50 2 至933位，分离株在突变区有4个核苷酸位点发生突变，第50 9位和510位发生碱基互换,相对应的氨基酸由脯氨酸(P)转变为组氨酸(H);第92 4位由A突变为C,氨基酸由天冬氨酸(D)转变为谷氨酸(E);第92 5位由C突变为T,氨基酸由苯丙氨酸(F)转变为亮氨酸(L)(图3B和C)。2.6分离株生长曲线的绘制通过细菌培养对分离株生长曲线进行了测定，生长曲线如图4所示，接种后第0 3小时为细菌的生长迟缓期，第48 小时分离株生长迅速，进人对数生长期，第9小时后细菌生长进人稳定期。AM12B509,510924.,925分离株GTGAAACCACGTATTTTAGTAAAGACTTTCTTGAAIsolate2.000 bpG4T10GTGAAACACCGTATTTTAGTAAAGAACTTCTTGAA1 000bp750 bp500bpCXXXVKHRILVKYEGKIIKDIKQRGKKLQDLLEXXXXXX250bp分离株1701E300310IsolateNYEVKHRILVKYEGKVVIKDIKQRGKKLQELLEIYIQRS100 bpC4T10VKPRILVKYEGKVIKDIKQRGKKLQDFLE图3分离株spaA基因高突变区的PCR扩增及其核苷酸与对应氨基酸的序列比对Figure 3 Amplification of high mutated region of spaA gene by PCR and sequence alignment for nucleotide and the corre-sponding amino acid of the isolated strainA：s p a A 基因高变区的扩增(M:DNA分子质量标准；l:阴性对照;2：分离株）;B：核苷酸序列比对;C：氨基酸序列比对。A:Amplification of high mutated region of the spaA gene(M:DL2000 DNA Marker;l:Negative control;2:The isolated strain);B:Alignment fornucleotide sequences;C:Alignment for amino acid sequences.1.00.80.60.40.201246810时间/h Time图4猪丹毒杆菌分离株的生长曲线Figure 4 Growth curve of the isolated strain of Erysipelothrixrhusiopathiae2.7分离株对小鼠的致病作用与毒力基因的扩增2.7.1分离株对小鼠的致病作用稳定期菌液经计数为1.46 6 10 8 CFU。用1.46 6 10 4CFU攻毒后第2 天时，小鼠出现食欲不佳、活动减少等轻微临床症状；第3天时临床症状明显，表现为精神不振、被毛凌乱、喜闭眼、嗜睡等，死亡10 只；第4天时全部死亡。攻毒数为1.46 6 X103CFU时，第3天出现临床症状，死亡3只，第4天和第5天时分别死亡5只和4只。攻毒数为1.46 6 X102CFU和1.46 6 10 1CFU时,与对照组类似,均无小鼠死亡。各组小鼠存活率见图5。对死亡小鼠进行解剖，发现腹腔内有积液、全身呈败血症病理变化、肺严重充血、肝肿大有98第54卷中国兽医科学坏死点，而对照组小鼠无眼观病理变化（图6）。病理组织学观察，对照组小鼠肺组织未观察到明显病理损伤，肺泡壁结构正常、间质未见炎症细胞浸润、肺泡腔内未见明显的渗出物；攻毒组小鼠肝组织血管中度充血，肝窦可见大量红细胞渗出；对照组肝细胞索排列有序,肝细胞未见变性、坏死,肝窦未见淤血（图6）。取心、肝、脾、肺等脏器，通过无菌操作接种TSA培养基时，获得的菌落呈小短杆状、革兰染色阳性，与分离菌株形态一致（结果未显示）。100rTSB-1.466X10CFU75-1.466X10CFU-1.466X103CFU50+1.466X10*CFU25001234567时间/dTime图5分离株攻毒后小鼠存活率Figure5Survival rate of mouse after challenge to isolate小鼠肺肝肺肝micelungliverlungliver对照组Control group试验组Experimental group图6 分离株攻毒后小鼠肺和肝的组织病理学变化Figure 6Histopathological changes in lung and liver of mice after challenge with the isolated strain小鼠剖检及肺与肝组织病理变化。Mouse autopsy and pathological changes in lung and liver tissues.2.7.2分离株毒力基因的序列分析采用PCR法扩增了分离株毒力因子荚膜多糖A、B和C以及神经氨酸酶的基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，得到与预期大小一致的目的片段（图7)；进一步测序,结果经Blast比对，发现其荚膜多糖A、B和C基因片段与猪丹毒杆菌G4T10株核苷酸的同源性为10 0%;神经氨酸酶基因片段与猪丹毒杆菌SE38株核苷酸的同源性为10 0%，与猪丹毒杆菌G4T10株核苷酸的同源性为99.97%，其中有1个核苷酸位点（C3295T)不同，但相对应的氨基酸未发生变化（结果未显示）。3讨论猪感染猪丹毒杆菌后出现皮炎、败血症等，感染急性型时通常会导致猪的急性死亡。本病例中,猪只出现精神萎靡、腹泻、血便、母猪流产等临床症状并有部分猪只死亡,结合剖检所观察的病理变化，疑似为猪丹毒杆菌感染。对送检组织病料进行猪常见病原与病死猪疑似病原荧光定量PCR检测，发现该猪场存在猪圆环病毒2 型、猪细小病毒与猪丹毒杆M12342 000 bp一1000bp750bp500bp250bp100bp图7 分离株毒力因子基因的PCR扩增Figure 7 Amplification of virulence factor genes of the iso-lated strainbyPCRM:DNA分子质量标准；1：英膜多糖B基因（110 6 bp）;2：英膜多糖A基因（1156 bp);3:英膜多糖C基因（12 56 bp);4:神经氨酸酶基因(3 50 0 bp)。M:DL2000 DNA Marker;l:CPS(capsular polysaccharide)A gene;2:CPSBgene;3:CPS Cgene;4:Sialidase gene.菌的混合感染。通过病原菌的分离，结合菌落形态特征与生化指标分析，鉴定所分离菌为猪丹毒杆菌。99刘武函等：一株猪丹毒杆菌的分定及其对小鼠的致病性研究第1期通过比对16 SrDNA序列,发现分离菌株与猪丹毒疫苗株G4T10基因序列一致，进一步从基因水平确定分离株为猪丹毒杆菌。因毒力因子如神经氨酸酶、透明质酸酶、荚膜多糖、黏附表面蛋白等的编码基因与spaA等的差异，致使不同猪丹毒杆菌的毒力不同，但致病机制尚不明确15。SpaA作为猪丹毒杆菌的主要保护抗原，对控制疾病和新型疫苗开发具有重要作用16 。Borrathybay等10 通过构建猪丹毒杆菌spaA基因缺失株攻毒小鼠,对小鼠的致病力下降了7 6%，证明了spaA基因在猪丹毒杆菌的致病性中具有重要作用。卢琴等17 和林琳等18 对所分离的猪丹毒杆菌spaA基因进行了生物信息学分析,预测了其B细胞抗原表位区域，其中有5处（17 518 3、1942 0 0、2232 2 8、2 442 48、2 6 7 2 7 2)位于spaA基因高突变区。本研究获得的分离株spaA基因氨基酸突变位点不在上述所预测的区域，主要发生在第17 0、308和30 9位。王力波等14 比较了8 株来源不同时期的猪丹毒杆菌7 个毒力基因片段，发现仅荚膜多糖A和C基因发生了变异,而 spaA、神经氨酸酶、黏附素蛋白A和B、荚膜多糖B的同源性接近10 0%。本研究扩增了分离株毒力因子基因spaA和神经氨酸酶、荚膜多糖A、B和C的基因序列,与G4T10株比对荚膜多糖基因无变化,神经氨酸酶基因在第32 95位点出现变化，但对应的氨基酸位点无差异；与SE38株比对,神经氨酸酶基因的同源性为10 0%。spaA作为相对保守的毒力基因,扩增序列中出现了4个核苷酸位点变化，可能是影响该毒株毒力的重要因素之一。小鼠攻毒试验结果显示该分离菌的致病性较强，当用10 310 4CFU分离株腹腔接种小鼠时，5d内小鼠全部死亡，并出现全身性的败血症病理变化。此外，药敏试验显示该分离株对青霉素、苯唑西林、氨西林等多种抗生素敏感，对丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素与红霉素等耐药，可为猪丹毒杆菌感染临床用药提供参考。近几年，猪丹毒杆菌在各地均有零星病例报道，主要集中在我国中南部地区，夏季多发，提示高温湿热对猪丹毒的流行有积极作用19。猪丹毒杆菌宿主广，传播能力强，容易形成地方流行病，对该病的防控力度需加强参考文献(References)1STRAW B E,ZIMMERMAN J J,DALLAIRE S,et al.Diseasesof SwineM.Ames:Blackwell Publishing Professional,2006:629-638.2WANG Q,CHANG B J,RILEY T.Erysipelothrix rhusiopa-thiaeJ.Veterinary 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