利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒.pdf

中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e s ,()D O I:/j i s s n 论著利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组S A 轮状病毒柴萨萨,蔡昊,刘夏飞,赵静,宋敬东,李金松,裴银辉,李利利,段招军国家重点研发计划(N o Y F C )通讯作者:李利利,E m a i l:l i l i l i c o m;O R C I D:作者单位:华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室,唐山 ;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,国家卫生健康 委 员 会 医 学 病 毒 和 病 毒 病 重 点 实 验 室,北 京 ;甘肃中医药大学公共卫生学院,兰州 摘要:目的利用反向遗传技术产生N S P 基因插入和表达外源基因的重组S A 轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体.方法本研究将轮状病毒S A 株的N S P 基因片段的 位(端)至 位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止再启动元件(P A)的增强绿色荧光蛋白(E G F P)基因,采用已建立的“质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救N S P 基因插入和表达E G F P的重组S A 轮状病毒.通过观察细胞病变效应和插入基因(E G F P)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、R T P C R的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增.利用T C I D 法和q R T P C R法,测定了r S A 和r S A /N S P E G F P的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线.结果基于“质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒r S A /N S P E G F P,证明N S P 片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株.结论基于N S P 基因插入和表达E G F P的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础.关键词:A组轮状病毒;反向遗传;外源基因;N S P 基因中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()P r o d u c t i o no f r e c o m b i n a n tS A r o t a v i r u s e x p r e s s i n ge x o g e n o u s g e n e st h r o u g hr e v e r s eg e n e t i c t e c h n o l o g yCHA IS a s a,C A IH a o,L I UX i a f e i,Z HAOJ i n g,S ONGJ i n g d o n g,L I J i n s o n g,P E IY i n h u i,L IL i l i,DUANZ h a o j u n(C o l l e g eo fE l e m e n t a r yM e d i c i n e,N o r t hC h i n aU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,H e b e iK e yL a b o r a t o r yf o rC h r o n i cD i s e a s e s,T a n g s h a n ,C h i n a;K e yL a b o r a t o r yo fM e d i c a lV i r u s e sa n dV i r a lD i s e a s e s,N a t i o n a lH e a l t hC o mm i s s i o n,N a t i o n a lI n s t i t u t e f o rV i r a lD i s e a s eC o n t r o la n dP r e v e n t i o n,C h i n e s eC e n t e r f o rD i s e a s e sC o n t r o la n dP r e v e n t i o n,B e i j i n g ,C h i n a;S c h o o l o fP u b l i cH e a l t h,G a n s uU n i v e r s i t yo fC h i n e s eM e d i c i n e,L a n z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:I nr e c e n t y e a r s,a ne n t i r e l yp l a s m i d b a s e dr e v e r s eg e n e t i c s y s t e mf o r r o t a v i r u sh a sb e e ne s t a b l i s h e d T h e a d v a n t a g e so fu s i n gr e v e r s eg e n e t i c t e c h n o l o g yt om a n i p u l a t eg e n es e q u e n c e se n a b l e r o t a v i r u sg e n e s t ob ec a r r i e d i nv e c t o r s f o r e x p r e s s i o no f f o r e i g ng e n e s I nt h i s s t u d y,t h en u c l e o t i d e s f r o mp o s i t i o n s (e n d s)t o o f t h eN S P g e n e f r a g m e n t o f t h e r o t a v i r u sS A s t r a i nw e r ed e l e t e d,a n da ne n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n(E G F P)g e n ec o n n e c t e dt oas t o pr e s t a r te l e m e n t(P A)w a sd i r e c t l y i n s e r t e d T h e e s t a b l i s h e d p l a s m i dr o t a v i r u s r e v e r s e t r a n s m i s s i o ns y s t e mw a su s e d t or e s c u e t h e r e c o m b i n a n t v i r u sw h o s eN S P f r a g m e n tw a s r e p l a c e db y t h eN S P r e c o m b i n a n t f r a g m e n t T h e s u c c e s s f u l r e s c u e o f t h e r e c o m b i n a n t v i r u sw a sd e t e r m i n e dp r e l i m i n a r i l yb yo b s e r v a t i o no fc y t o p a t h i ce f f e c t sa n dt h ef l u o r e s c e n c ee x p r e s s i o no ft h ei n s e r t e dE G F Pg e n e M o r p h o l o g i c a le l e c t r o n m i c r o s c o p y o b s e r v a t i o n,R T P C Rs e q u e n c i n gr e s u l t sa n dv i r a lg e n o m ed e t e c t i o nr e s u l t st o g e t h e rv a l i d a t e d t h e s u c c e s s f u l r e s c u e a n dp a s s a g e a m p l i f i c a t i o no ft h er e c o m b i n a n tr o t a v i r u s(r S A a n dr S A /N S P E G F P)T h ev i r a l t i t e r so fr S A a n dr S A /N S P E G F Pw e r em e a s u r e dw i t ht h eT C I D a n dq R T P C R m e t h o d s,a n dg e n o m er e p l i c a t i o nd y n a m i c sc u r v e sw e r ep l o t t e d T h ev i r a l t i t e ro f t h e t r u n c a t e dN S P f r a g m e n tw a s l o w e r t h a n t h a t o f i t sp a r e n t s t r a i n,b u tv i r a l r e p l i c a t i o nw a sn o ta f f e c t e d G e n o m ed e t e c t i o nr e s u l t s i n d i c a t e dt h a t t h e r e c o m b i n a n t v i r u s r S A /N S P E G F Ph a dg o o dg e n e t i cs t a b i l i t y T h i ss t u d yp r o v i d e sa f o u n d a t i o nf o r t h e i n d e p t he x p l o r a t i o no f t h e c o n s t r u c t i o no f r o t a v i r u sv e c t o r s f o r e x p r e s s i n g f o r e i g ng e n e s t h r o u g hr e v e r s eg e n e t i c s K e y w o r d s:G r o u pAR o t a v i r u s;r e v e r s eg e n e t i c s;f o r e i g ng e n e;N S P g e n eS u p p o r t e db yt h eN a t i o n a lK e yR e s e a r c ha n dD e v e l o p m e n tP r o g r a mo fC h i n a(N o Y F C )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:L iL i l i,Em a i l:l i l i l i c o mA组轮状病毒(r o t a v i r u sA,R VA)是引起全世界婴幼儿急性重症胃肠炎和腹泻的主要病原体,每年相关的死亡病例达 多万例,其中多数发生在发展中国家,造成了巨大的社会经济负担 .R VA属于呼肠病毒目(R e o v i r a l e s)平滑呼肠病毒科(S e d o r e o v i r i d e a)轮状病毒属,是一种双链R NA病毒,其基因组包含 个节段,编码种结构蛋白(V P ,V P 和V P)和种非结构蛋白(N S P ).随着“反向遗传学”系统(r e v e r s eg e n e t i c ss y s t e m,R G S)的发展,研究者可在体外改造和拯救病毒,为基因功能研究和病毒拯救提供了强大的平台.轮状病毒的反向遗传学系统最初于 年建立,其依靠辅助病毒的帮助,基于部分质粒实现了R VA基因片段的替换.之后经历 多年的不断探索,完全基于质粒的轮状病毒反向遗传系统在 年建立.近几年,利用反向遗传技术美国和日本报道多篇以轮状病毒作为载体表达外源蛋白的研究,这些研究主要以轮状病毒N S P 和N S P 片段为改造对象并插入外源基因.N S P 被认为是非必需病毒蛋白,具有拮抗干扰素的作用.且有研究发现,牛轮状病毒A 株的N S P 片段(b p)O R F区缺失 b p,只表达N端 个氨基酸,接种小鼠后仍能诱导腹泻.这为基于轮状病毒N S P 截短片段作为载体表达外源基因提供思路.本研究将A组轮状病毒S A 株的N S P 片段 N端 至 的核苷酸截短(模拟牛A 株的缺失位点),并插入了终止再启动元件(P A)连接 的E G F P基 因,构 建 质 粒p T/S A N S P E G F P.采用已建立的“质粒”轮状病毒反向遗传系统成功拯救 具有良好 遗传稳 定 性 的 重 组 病 毒r S A /N S P E G F P.旨在为进一步开发基于轮状病毒载体的联合疫苗研究提供理论依据.材料与方法主要试剂DMEM培养基(G i b c o),胎牛血清(F B S)(G i b c o),胰蛋白示磷酸肉汤(T P B)(S i g m a),非必需氨基酸溶液(N E AA)(G i b c o),L 谷氨酰胺(L G l u t a m i n e)(S i g m a),青链霉素(P S)(G i b c o),胰蛋白酶(含E D T A)(G i b c o),潮霉素(I n v i v o G e n),质粒D NA大 提 试 剂 盒(Q I AG E N),O p t i MEM(G i b c o),转染试剂T r a n sI TR L T(M i r u s b i o),猪九型胰蛋白酶(无E D T A)(S i g m a),核酸提取试剂盒(G e n e a i d),S D S P AG E凝胶制备试剂盒(S o l a r b i o),快速银染试剂盒(碧云天生物技术),一步法R T P C R试剂盒(T h e r m oF i s h e r).细胞培养本研究使用的稳定表达T R NA聚合酶(T R NA P)的幼仓鼠肾细胞(B HK/T )由中国疾病预防控制中心腹泻室刘夏飞博士赠送,培养条件为 DMEM F B S T P BN E AAP SL G l u t a m i n e,每隔一代传代加潮霉素 g/m L以去除未表达T R NA P的细胞.非洲绿猴肾细胞(MA )由本实验室保存,培养条件为 DMEM F B SP S.培养环境均为,C O的细胞培养箱.质粒构建本研究使用的编码S A L 基因组的 个T 拯救质粒和p C MV/N P R辅助质粒由中国疾病预防控制中心腹泻室刘夏飞博士赠送.根据文献报道构建截短N S P 片段中插入E G F P基因的质粒p T/N S P E G F P S A :将S A 毒株N S P 片段 端开始的第 位核苷酸删除,插入终止再启动元件(P A)连接的E G F P基因(b p),由苏州金唯智生物科技公司合成c D NA序列.合 成 的c D NA序 列 替 换 到 原p T/N S P S A 表达质粒的R s rI I和N c oI位点来构建p T/N S P E G F P S A 质粒.构建质粒的核苷酸序列经直接测序证实.转染所需的 个质粒按照质粒大提试剂盒Q I AG E N E n d o F r e eP l a s m i d M a x iK i t说 明 书 提取,提取的质粒均经琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小符合超螺旋结构,并通过分光光度计测定其纯度和浓度,吸光度 /,每个质粒浓度均调整至m g/m L.B HK/T 细胞转染及病毒拯救采用“质粒系统”进行病毒拯救,具体步骤如下:期柴萨萨,等:利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组S A 轮状病毒B HK/T 细胞以/孔的密度铺于六孔板,培养 h至细胞汇合度达到 左右进行质粒转染.转染时,首先将 个质粒混合,包括g的p T/N S P S A 、p T/N S P S A 、p T/N S P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p CMV/N P R,和 g的p T/N S P S A 、p T/N S P S A ,当拯救重组病毒r S A /N S P E G F P时,将 质 粒p T/N S P S A 替 换 成p T/N S P E G F P S A .质粒混合物中加 L的O p t i MEM,用移液枪轻轻混匀,再加入 L的T r a n s I T L T 转染试剂,短暂涡旋混匀,置于室温下孵 育 m i n.孵 育 结 束 后,均 匀 滴 入 六 孔 板B HK/T 细胞中,轻晃摇匀,置于C O培养箱继续培养.培养 h后,换不含胎牛血清的培养基,加重悬的MA 细胞/孔,h后每孔加胰蛋白酶至终浓度为g/m L,混合培养d将细胞冻融次后,g离心 m i n,上清保存于,传代接毒备用.拯救病毒传代培养将MA 细胞以/孔的密度接种于孔板,培养d.细胞汇合成单层 后,P B S清 洗 细 胞次,每 孔 加 m L的DMEM,放培养箱继续培养.随后取离心后的病毒上清 L,加胰蛋白酶(g/m L)、C a C l(g/m L)于 水浴锅活化病毒h,然后弃去孔板中DMEM,均匀滴入活化后的上清液.放入培养箱吸附h,期间每 m i n轻晃板子次.吸附结束,弃去上清液,用P B S清洗次,每孔加m L的DMEM(含胰蛋白酶g/m L),继续培养,并每天观察细胞病变.按同样方法盲传代来扩增病毒.T C I D 法测定病毒滴度将MA 细胞以/孔的密度铺于 孔板,培养d至细胞汇合成单层.取活化后的 L病毒上清做 倍稀释(),以 L/孔 分 别 接 种 至 长 满MA 细胞的 孔板中,对照采用活化处理的DMEM,每个稀释度和对照均做个重复,放回培养箱吸附h.将病毒稀释液弃掉,用P B S清洗次,每孔加 L含g/m L胰蛋白酶的DMEM维持液,置于、C O的培养箱中培养d.每天观察并记录各稀释度出现C P E的孔数,然后使用K a b e r法计算各病毒的T C I D 值.电 镜 观 察依 照 上 述 方 法,将r S A 和r S A /N S P E G F P接种于MA 细胞,MO I值为,接种 h后,吸取细胞培养液,g离心 m i n,取上清,磷钨酸负染;细胞刮下收集,低速离心,去上清,加入等戊二醛固定,然后用四氧化锇固定,水洗次,乙醇梯度脱水,用环氧树脂浸透,聚合 h.使用超薄切片机半手动获得超薄切片(n m),用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色.最后,使用T e c n a i 透射电子显微镜(F E I,荷兰)观察.P AG E电泳分析使用V i r u sN u c l e i cA c i dE x t r a c t i o nK i t I I(G e n e a i d,中国台湾)试剂盒提取病毒核酸.取核酸样品 L加 LR NA上样缓冲液混匀后,在预制的mm的聚丙烯酰胺凝胶上(P AG E)电泳(浓缩胶和 下层胶),V跑 m i n以浓缩样品后,V电泳h以分离条带.电泳结束后,采用银染试剂盒进行银染色,观察R VA的 条基因组并采用凝胶成像仪拍照.R T P C R鉴定为进行重组病毒N S P 片段的鉴定,本研究设计了S A 病毒株的N S P 片段的 特 异 性 引 物,S A N S P F:T G GAT G C C AG T T C C T GAT G C 和S A N S P R:T G C C AG C T AG G C G C T A C T C T .首 先 按 上 述 方 法提取 病 毒 核 酸,经S u p e r S c r i p tI IR e v e r s e T r a n s c r i p t a s e试剂盒(I n v i t r o g e n,美国)进行逆转录后,采用T AKA R A的P r e m i xT a q扩增r S A /N S P E G F P(b p)与r S A (b p)片段.反应条件:s,s,m i n,个循环.扩增产物送至北京天一辉远公司测序,比对分析r S A 和r S A /N S P E G F P的N S P 基因片段序列.生长动力学曲线将拯救病毒按前述方法以MO I值为 接种于MA 细胞孔板中,重组病毒(r S A /N S P E G F P与r S A )均 做个重复.在感染MA 细胞后h、h、h、h和 h的时候分别收取培养液上清,g离心 m i n,上清 保存.与此同时,取各时相培养液 L提取病毒核酸,参照毛彤瑶等人 建立的方法合成R o t a A N S P 的引物和探针,采用A g P a t h I D TM O n e s t e pR T P C R K i t试剂盒根据说明书进行T a q m a nR e a l t i m eP C R对上清中病毒进行定量,反应条件为 m i n,循环;m i n,循环;s,m i n,循环.计算各时相病毒的基因组拷贝数,绘制细胞内病毒R NA生长动力学曲线.结果r S A 和r S A /N S P E G F P的拯救按照“质粒”的轮状反向遗传系统,转染了 质粒的B HK/T 细胞与MA 细胞混合培养,在培养中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()d后,取培养物上清首先采用轮状病毒胶体金初步检测,r S A 和r S A /N S P E G F P上清均显示为轮状病毒阳性.将冻融离心后的培养物上清接种至MA 细胞进行病毒扩增,在显微镜下均观察到明显的细胞病变效应,具有典型的A组轮状病毒病变特征(图 A、B),即细胞变圆,胞质暗沉,细胞脱落.在对照组细胞中未观察到细胞病变效应(图 C).注:A、D r S A 感染后细胞病变及荧光观察;B、E r S A /N S P E G F P感染后细胞病变及荧光观察;C、F对照MA 细胞的细胞形态及荧光观察.图r S A 和r S A /N S P E G F P感染MA 的细胞形态及荧光成像()F i g C e l lm o r p h o l o g ya n d f l u o r e s c e n c e i m a g i n go fMA i n f e c t e dw i t hr S A a n dr S A /N S P E G F P()r S A 和r S A /N S P E G F P的鉴定r S A 和r S A /N S P E G F P的荧光观察将r S A 和r S A /N S P E G F P的第代培养物接种至MA 细胞.在荧光显微镜下观察,只在r S A /N S P E G F P感染的MA 细胞中观察到明显的绿色荧光(图 E),在r S A 感染MA 细胞和对照孔细胞中并未观察到荧光(图 D、F).r S A 和r S A /N S P E G F P的电镜观察收集接种r S A 和r S A /N S P E G F P的细胞培养上清,处理后,在透射电子显微镜下观察,均可观察到直径 n m左右的球形轮状病毒粒子,包括实心和空心两种形态(图).r S A 和r S A /N S P E G F P的基因组鉴定提取病毒核酸,进行了d s R NA基因组P AG E和R T P C R鉴定.结果显示,r S A /N S P E G F P与r S A 的 条基因节段有 条是一一对应的,而其中一条N S P E G F P迁移速度快于亲本株的N S P 片段(图 B).R T P C R的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 鉴定,条带大 小符 合 预 期 结 果(图 A).测序结果也显示,r S A 的N S P 片段与参考序 列 一 致(b p),r S A /N S P E G F P的注:A接种r S A 的细胞培养上清;B接种r S A /N S P E G F P的细胞培养上清.图电镜下观察到的重组轮状病毒F i g R e c o m b i n a n tr o t a v i r u so b s e r v e du n d e re l e c t r o nt r a n s m i s s i o nm i c r o s c o p yN S P 片段包括完整的E G F P基因序列(b p).这些结果表明我们成功拯救出了r S A 和插入外源基因的r S A /N S P E G F P.重组病毒的滴度及生长动力学为了确定N S P 截短的O R F区插入E G F P基因是否会影响重组病毒的感染力,取P 代病毒r S A 和r S A /N S P E G F P以MO I为 感染MA 细胞,每隔 h收取细胞培养液,定量不同时间点的R NA期柴萨萨,等:利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组S A 轮状病毒图r S A 和r S A /N S P E G F P基因组的R T P C R(A)和P A G E(B)鉴定F i g R T P C R(A)a n dP A G E(B)i d e n t i f i c a t i o no fr S A a n dr S A /N S P E G F Pg e n o m e s载量,绘制生长曲线.测定了 h收取病毒液的T C I D.定 量 结 果 显 示,r S A 和r S A /N S P E G F P在MA 细胞中复制良好,并产生明显的C P E.r S A 和r S A /N S P E G F P均在 h已开始复制,在 h到达复制平台期,h与 h的病毒拷贝数无差异,两个毒株的复制动力学趋势一致(图 B).R e a l t i m eP C R和T C I D 结果显示,r S A /N S P E G F P的病毒R NA水平和病毒滴度略低于r S A ,P,差异具有统计学意义(图 A和 B).图r S A 和r S A /N S P E G F P的病毒滴度(A)和基因组生长动力学曲线(B)F i g V i r a l t i t e r s(A)a n dg e n o m i c g r o w t hk i n e t i c s c u r v e s(B)o f r S A a n dr S A /N S P E G F P重组病毒的遗传稳定性为验证重组病毒是否可以稳定传代,取P 和P 代重组病毒r S A /N S P E G F P进 行d s R NA基 因 组P AG E分 析,r S A 作 为 对 照.结 果 显 示P 和P 代 病 毒r S A /N S P E G F P的N S P E G F P片段条带位置一致,均出现正确迁移(图).结果表明,将N S P 片段O R F区截短并插入 b p的E G F P基因,获得重组病毒的遗传稳定性在连续传代 次后依旧保持基因稳定性.图 r S A /N S P E G F P的d s R N A遗传稳定性F i g G e n e t i c s t a b i l i t yo fd s R N Ai nr S A /N S P E G F P讨论A组轮状病毒仍是全世界婴幼儿严重急性胃肠炎的最重要原因.针对轮状病毒感染目前尚无特异性药物,主要采取对症治疗,疫苗接种是预防R V感染的有效措施.虽然十多年前开始在全球引入了轮状病 毒 疫 苗 接 种,如:R o t a r i x、R o t a T e q、R o t a v a c、R OT A S I I L、R o t a v i n M、L L R,但轮状病毒感染每年仍导致全球 万人以上死亡,主要是在低收入国家.人用商品化R V疫苗在发达国家有较高免疫效率,而在低收入国家免疫效率较低,且存在一定的潜在安全问题.因此,对于新生儿、老年人和免疫缺陷的成年人来说开发安全并高效的抗R V的药物和疫苗都是十分迫切的.反向遗传学是研究宿主病原体相互作用、病毒蛋白质功能和病毒感染生物学的有力工具,且在新型疫苗设计方面有很大潜力 .轮状病毒反向遗传学系统的建立较为滞后,于 年建立完全基于质粒的 质粒R VA反向遗传系统.之后不久,P h i l i pAA等人通过修改其程序为 质粒系统,进一步提高了病毒拯救效率.该系统通过将 个T 驱动的编码R VA基因组的质粒和个编码非洲猪瘟病毒加帽酶的辅助质粒(p CMV/N P R)借脂质体转染到表达T R NA聚合酶的B HK/T 细胞,重组轮状病毒可以高效获得.最新研究表明,仅转染 个编码R VA基因组的拯救质粒,仍可高效拯救重组病毒.基于这种轮状病毒反向遗传系统,研究人员成功的产生了多种重配以及表达报告基因的具有感染性的重组轮状病毒 .我们在拯救r S A 病毒株时对拯救过程进行了一些改进,经验如下:最关键的是状态良好的中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()B HK/T 细 胞,使 用 添 加 胎 牛 血 清、N E AA、T P B的高糖DMEM完全培养基,额外的营养成分补充有助于B HK/T 细胞在质粒转染后延长活力,此外细胞每周次传代,隔代使用潮霉素补充培养基,用于筛选稳定表达T R NA聚合酶的B HK/T 细胞;最佳的细胞密度,即只在细胞汇合度达到 时进行转染;转染试剂和培养基在使用前要平衡至室温;转染时可适当增加 个T 拯救质粒的用量倍;转染前要确保质粒和转染试剂充分混合;加入MA 细胞混合培养期间按需添加碳酸氢钠控制细胞培养的p H值.另外,支原体污染B HK/T 和MA 细胞可能是轮状病毒反向遗传系统出现重组病毒失败的重要因素.在细胞的培养过程中,我们同时使用基于P C R和荧光染色法的支原体检测试剂盒定期来检查B HK/T 细胞和MA 细胞,确保用到的细胞无支原体污染,如若检测到,重新复苏新的细胞系,丢弃之前使用过的培养基和培养基补充剂,并彻底清洗细胞培养箱,生物安全柜,实验室工作台和移液器.本研究将轮状病毒S A 株的N S P 片段 端 至 的核苷酸截短,并插入了P A终止再启动元件连接的E G F P基因,构建质粒p T/S A N S P E G F P.采用已建立的R V反向遗传 质粒系统,以p T/S A N S P E G F P质粒替换掉原来系统的p T/S A N S P 质粒,成功拯救出了表达荧光报告基因(E G F P)的具有感染性的重组轮状病毒,并通过R T P C R、S D S P AG E电泳、电镜观察及间接免疫荧光等方法,进行了一系列的结果验证,证明了R VA s除了其原始基因组d s R NA外,还可以携带外源核苷酸作为遗传物质,而且连续 次传代后重组病毒基因组依然保持稳定.当我们按相同MO I值接种病毒时,重组病毒的复制效率略低于亲本株,且拯救效率也要低于亲本株.下一步的工作重点将提高重组病毒的拯救效率.在重组R VA具有感染性的情况下,荧光报告基因的表达使得R VA在体内和体外复制实现可视化.H a t a z a w aR等人已报告基于该系统可以生成表达多种外源基因的重组R V,插入片段的长度可达 b p,这使其成为一种有潜力的灵活病毒载体.事实上,可以将编码其他病原体中和抗原的序列插入R VA基因组,从而产生基于R VA的多价载体疫苗 ,不仅可以诱导对R VA的免疫保护,还可以诱导对插入其他病原体的免疫保护.因此,基于R VA的载体将在广泛的基础研究和临床应用中具有吸引力.利益冲突:无引用本文格式:柴萨萨,蔡昊,刘夏飞,等利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组S A 轮状病毒J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n 参考文献T r o e g e rC,K h a l i l I A,R a oP C,e t a l R o t a v i r u s v a c c i n a t i o na n dt h eg l o b a l b u r d e no f r o t a v i r u sd i a r r h e aa m o n gc h i l d r e ny o u n g e rt h a ny e a r sJ J AMA P e d i a t r,():D O I:/j a m a p e d i a t r i c s T a t eJ E,B u r t o nAH,B o s c h i P i n t oC,e t a l G l o b a l,r e g i o n a l,a n dn a t i o n a le s t i m a t e so fr o t a v i r u sm o r t a l i t yi nc h i l d r e n Y e a r so fA g e,J C l i n I n f e c tD i s,(S u p p l):S S D O I:/c i d/c i v K o m o t oS,T a n i g u c h iK R o t a v i r u s e sJ V i r u s,():D O I:/j s v P a p aG,B u r r o n eO R R o t a v i r u sr e v e r s eg e n e t i c s:At o o l f o ru n d e r s t a n d i n gv i r u s b i o l o g yJV i r u s R e s,:D O I:/j v i r u s r e s K o m o t oS,S a s a k i J,T a n i g u c h iK R e v e r s eg e n e t i c s s y s t e mf o ri n t r o d u c t i o no f s i t e s p e c i f i cm u t a t i o n s i n t ot h ed o u b l e s t r a n d e dR NAg e n o m eo f i n f e c t i o u s r o t a v i r u sJ P r o cN a t lA c a dS c iUS A,():D O I:/p n a s K a n a iY,K o m o t oS,K a w a g i s h iT,e ta l E n t i r e l yp l a s m i d b a s e dr e v e r s eg e n e t i c ss y s t e mf o rr o t a v i r u s e sJ P r o cN a t lA c a dS c iU S A,():D O I:/p n a s B a r r o M,P a t t o nJ T R o t a v i r u sn o n s t r u c t u r a lp r o t e i ns u b v e r t s i n n a t e i mm u n er e s p o n s eb yi n d u c i n gd e g r a d a t i o no f I F Nr e g u l a t o r yf a c t o rJ P r o cN a t lA c a dS c iUSA,():