一株宽宿主谱多重耐药铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性与基因组特征分析.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45，No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303018一株宽宿主谱多重耐药铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性与基因组特征分析曾君1,2，王雪2，王猛2,3，左君豪1,2，郭志良1,2，赵佳男2，季芳2，邵建立4，张立敏5，徐莉莉6，赵瑞利1*，王承民2*(1.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2.广东省科学院动物研究所 广东省动物保护与资源利用重点试验室，广东省野生动物保护与利用公共试验室，广东 广州 510260；3.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071000；4.暨南大学附属第一医院，广东 广州 510260；5.联勤保障部队北戴河康复疗养中心，河北 秦皇岛 066100；6.优宜邦生物科技(上海)有限公司，上海 201103)摘要：为探究针对多重耐药铜绿假单胞菌(，PA)裂解性噬菌体生物学特性及其基因组结构特征，本研究以一株人源多重耐药PA 3099-2aT株为宿主菌，从养殖场污水中分离纯化到一株噬菌体，命名为pPA-3099-2aT.2。噬菌体经磷钨酸染色后采用透射电镜观察形态，经双层平板法测定其对温度和酸碱的稳定性、绘制一步生长曲线，通过双层平板法测定该噬菌体对各试验菌株的裂解情况确定其宿主谱，通过测定不同感染复数(MOI)细菌和噬菌体混合液的OD595nm分析该噬菌体体外抑菌效果，通过不同浓度的PA 3099-2aT对大蜡螟幼虫致病性及攻毒保护率试验检测噬菌体体内抑菌效果。结果显示，噬菌体pPA-3099-2aT.2头部直径约为76.69 nm，有尾鞘，尾长123.89 nm，形态学分类为肌尾噬菌体；在-20 60 和pH值为410的环境中稳定性良好，最适pH值为6，最适温度为37，潜伏期小于10 min，裂解期持续至100 min，裂解量约为178 pfu/cell；能裂解ST198型、ST274型、ST3683型、ST3875型、ST3216型等8株不同来源的PA；体外抑菌效果良好，其中MOI 0.01抑菌效果最好，能在015 h内有效抑制细菌生长；在体内也具有良好的抑菌效果，该噬菌体对大蜡螟幼虫的保护率与其MOI呈正相关，24 h内该噬菌体的MOI为100时对大蜡螟幼虫的保护率为100%，MOI 1时对大蜡螟幼虫的保护率为60%，MOI 0.01时对其的保护率为40%。采用高通量测序技术对pPA-3099-2aT.2进行全基因组测序，并于GenBank数据库下载32条噬菌体N-乙酰胞壁酰胺酶氨基酸序列，分析其遗传演化规律，采用DNAMAN v6对pPA3099-2aT.2、噬菌体JG004 lysozyme(Pae87)和vB_PaeM_C2-10_Ab1的N-乙酰胞壁酰胺酶的氨基酸序列进行比对分析。全基因组测序结果显示，pPA-3099-2aT.2基因组为dsDNA，长度为93 031 bp，GC含量49.4%，含有穿孔素、N-乙酰胞壁酰胺酶、细胞壁水解酶等裂解相关蛋白；N-乙酰胞壁酰胺酶进化分析结果显示，该蛋白在噬菌体帕克普纳属和宿主菌铜绿假单胞菌种具有较高的保守性，与噬菌体JG004 lysozyme(Pae87)该蛋白氨基酸序列同源性为98.39%，但存在3个氨基酸突变。上述结果表明，噬菌体pA-3099-2aT.2具有生物学稳定性、潜伏期较短、裂解能力强、识别多种ST型宿主菌和抑菌效果良好等特性，能够显著提高感染多重耐药PA大蜡螟幼虫的存活率，为噬菌体治疗多重耐药PA感染提供参考依据。关键词：多重耐药铜绿假单胞菌；噬菌体；生物学特性；基因组；N-乙酰胞壁酰胺酶中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)10-1008-11Biological and genomic characterization of a wide host spectrummultidrug resistantphage收稿日期：2023-03-13基金项目：优宜邦生物科技(上海)有限公司资助产业化项目：微生物资源与产业化利用(UYB20220001)作者简介：曾君(1996-)，女，四川巴中人，硕士研究生，主要从事分子病原学细菌学方向研究.*通信作者：E-mail：Z；*Corresponding authorZENG Jun1,2,WANG Xue2,WANG Meng2,3,ZUO Jun-hao1,2,GUO Zhi-liang1,2,ZHAO Jia-nan2,JI Fang2,SHAO Jian-li4,ZHANG Li-min5,XU Li-li6,ZHAO Rui-li1*,WANG Cheng-min2*(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.Guangdong Provincial KeyLaboratory of Animal Protection and Resource Utilization,Guangdong Provincial Public Laboratory of Wildlife Protection and Utilization,Institute of Zoology,Guangdong Academy of Sciences,Guangzhou 510260,China;3.College of Veterinary Medicine,Agricultural Universityof Hebei,Baoding 071000,China;4.The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510260,China;5.Beidaihe RehabilitationCenter of Joint Logistic Support Force,Qinhuangdao 066100,China;6.Union Biotechnology(Shanghai)Co.,LTD.,Shanghai 201103,China)Abstract:In order to explore the biological characteristics and genome structure of multidrug-resistantlytic phage,a multidrug-resistantfrom human was used as host bacteria and a bacteriophagenamed pPA-3099-2aT.2 was isolated and purified from aquaculture wastewater samples.The morphology of pPA-3099-2aT.2 wasobserved by transmission electron microscopy after phosphotungstic acid staining;the stability of temperature and acid base wasmeasured by double-layer plate method;the one-step growth curve was drawn,and the host spectrum was determined by whetherthe phage can lyse the test strains.The antibacterial effect of bacteria and bacteriophage mixture at different MOIwasmeasured.The results showed that the head diameter of pPA-3099-2aT.2 was about 76.69nm,with a tail sheath and a tail length of123.89nm,and pPA-3099-2aT.2 was morphologically classified asphage.It had good stability in the environmentof-20-60and pH value of 4.0-10.0.The optimum pH value was 6.0,and the optimum temperature was 37.The incubationperiod was less than 10min,and the lytic period could continue to 100min.It could lyse 8 strains offromdifferent sources,including ST198,ST274,ST3683,ST3875 and ST3216.The lytic capacity was about 178pfu/cell.It had a goodantibacterial effect within 0-15 hours,of which MOI 0.01 had the best antibacterial effect.There was a positive correlationbetween the protection rate of MOI and MOI larvae.The protection rates of MOI 100,MOI 1 and MOI 0.01 within 24 hours were100%,60%and 40%,respectively.The whole genome sequencing of pPA-3099-2aT.2 was performed by high-throughputsequencing technology,and 32 amino acid sequences of N-acetylmuraminase were downloaded from GenBank database to analyzeits genetic evolution,the amino acid sequences of N-acetylmuramidase from pPA3099-2aT.2,phage JG004 lysozyme(Pae87)andvB_PaeM_C2-10_Ab1 were analyzed by DNAMAN v6.The whole genome sequencing results showed that the pPA-3099-2aT.2genome was dsDNA,with a length of 93031bp and GC content of 49.4%,and contained lyse related proteins such as perforinn,N-acetylmuramidase,and cell wall hydrolase.Evolutionary analysis of N-acetylmuramidase showed that this protein was highconserved in.Pakpunavirus and the host bacterium,and had a 98.39%homology withphage JG004 lysozyme(Pae87),but with 3 amino acid mutations.These results indicated that phage pPA-3099-2aT.2 had stablebiological characteristics,short incubation period,strong lytic ability,recognition of multiple ST-type host bacteria and goodantibacterial effect,which could significantly improve the survival rate of larvae infected with multidrug-resistant.This study provides a reference for the treatment of multidrug resistantinfection bybacteriophage.Key words:multidrug-resistant;phage;biological characteristics;genome;N-acetylmuramidase铜 绿 假 单 胞 菌(，PA)，是假单胞菌科非发酵、需氧革兰阴性杆菌1，在自然界中广泛存在并能耐受恶劣环境，其致病性较强，可引起肺炎、尿路感染、外耳炎、伤口感染、骨和关节感染、菌血症和全身性感染等严重疾病2。2018年世界卫生组织将耐碳青霉烯类PA列为亟需研发新型抗菌方案的类极为重要病原体3，2020年全国细菌耐药监测报告显示，PA的临床分离率排名第三(12.2%)，由此可见，PA的临床感染不容忽视。近年来，不断出现多重耐药和广泛耐药PA，由于其超强的天然耐药和获得性耐药特性，治疗十分困难，给全球公共卫生安全带来极大风险4。1915 年，据文献报道dHerelle 和Twort首次发现噬菌体5，随后在20世纪20年代早期成功应用于治疗动物和人类的细菌感染6。但由于抗生素的出现和广泛应用，噬菌体治疗策略发展逐渐放缓乃至几曾君，等.一株宽宿主谱多重耐药铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性与基因组特征分析第 10 期1009乎停滞，随着细菌抗生素耐药性的增加，噬菌体的治疗潜力再次被研究者重视7。噬菌体能够特异性感染并裂解其细菌宿主，且不感染人类或动物细胞，作为一种专一性和安全性极强的病毒，具有替代抗生素，治疗细菌感染的潜力8。Racenis等通过噬菌体鸡尾酒联合抗生素治愈多重耐药PA引起的骨髓炎，令患者免于截肢手术9。Ferry等用噬菌体疗法避免了类似抗生素治疗菌血症所致的急性肾损伤，且未出现相关不良反应10。此外，噬菌体是微生态环境中的重要成员，在人体、动物、土壤和水体等环境中均存在，并涉及噬菌体的微生态稳态系统，其在调节微生态系统的功能上也起到重要作用11。因此，合理利用噬菌体在遏制耐药细菌传播和治疗细菌感染方面具有十分广阔的应用前景。本研究从养殖场污水中分离到一株多重耐药PA的裂解性噬菌体pPA-3099-2aT.2，并系统解析其生物学特性、基因组构成和N-乙酰胞壁酰胺酶进化特征，为合理利用噬菌体治疗多重耐药PA提供参考依据。1材料与方法1.1宿主菌株来源及主要试剂实验菌株分离自秦皇岛某疗养院重症监护室痰液样品，命名为3099-2aT(本文简写为3099-2aT)，并于50%甘油水中-20冻存于本实验室；18株不同来源的PA由本实验室保存；前期实验采用改良K-B纸片法检测并参考多重耐药(Multi drug resistant，MDR)、广泛耐 药(Extensive drgu resistant，XDR)和 全 耐 药(Pandrug resistant，PDR)暂行标准判定3099-2aT为MDR菌株12；MH肉汤(MHB)、MH琼脂(MHA)、琼脂均购自青岛海博生物技术有限公司。1.2噬菌体的分离与纯化将3099-2aT菌液在MHA培养基表面划线培养，挑取单个菌落振荡培养后获得增菌液。噬菌体样品分离自天津某畜牧养殖场污水处理池，利用双层平板法分离纯化噬菌体。取污水1 mL与3099-2aT菌液100 滋L，在5 mL MHB培养基中充分混匀，连续培养12h后8000r/min离心10min，取上清液经0.22 滋m滤膜过滤后待用。取100 滋L3099-2aT菌液与8 mL预热的半固体培养基(MHB+0.7%琼脂)混匀，倾倒于底层固体MHA平板并在表面滴加10 滋L滤液，37 培养，观察并挑取噬菌斑。将单个噬菌斑10倍倍比稀释至合适浓度，取100 滋L噬菌体稀释液与宿主菌液等体积混匀，37 孵育10 min，加8 mL MH半固体培养基迅速混匀后倒入MHA固体培养基，待上层凝固后37 培养6 h，再次挑单个噬菌斑重复操作35次，至噬菌斑大小、形态一致，即得到单一噬菌体分离株。1.3噬菌体形态的电镜观察将浓缩的噬菌体采用磷 钨 酸 负 染 法 染 色 后，使 用 透 射 电 子 显 微 镜JEM-1400 flash在120 kV下观察并拍摄噬菌体的形态特征。通过透射电子显微镜JEM-1400 flash在120 kV下观察并拍摄噬菌体的形态特征。1.4噬菌体稳定性的测定将1 mL噬菌体悬液分别置于-20、4、25、37、50、60、70 中孵育60 min，10倍倍比稀释至合适浓度，采用双层平板法测定噬菌体效价，以评估噬菌体的温度稳定性13。利用HCl和NaOH调节MHB液体培养基pH值分别至2、4、6、7、8、10、12，将100 滋L噬菌体液与900 滋L调整pH值后的MHB培养基分别充分混匀，37 培养60 min，采用双层平板法测定噬菌体效价。将温度稳定性和酸碱稳定性效价最高的组定义为100%，其余组别与之相比，计算百分比评估噬菌体的温度稳定性和酸碱稳定性14。上述试验每组重复3次。1.5噬菌体一步生长曲线的测定将噬菌体与宿主菌按感染复数(MOI)0.001混匀，37 孵育10 min后，10 000 r/min 离心 1 min并弃去上清。使用MHB液体培养基反复洗沉淀3次，最后溶于10 mL MHB中，37、180 r/min振荡培养。在0、5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min、110 min分别取样400 滋L，10 000 r/min离心1 min，取上清100 滋L经双层平板法测定噬菌体效价，并根据效价绘制噬菌体一步生长曲线13。以裂解量=爆发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度，计算裂解量。1.6噬菌体宿主谱的测定参考Kutter的方法15，将18株不同来源的PA培养至对数生长期，取菌液100 滋L与8 mL半固体培养基充分混匀，平铺于MHA固体培养基平板表面。待上层琼脂凝固后，取10 滋L噬菌体增菌液，点于半固体培养基(MHB+0.7%琼脂)上，倒置培养8 h后观察各实验菌株裂解结果，出现清晰透明的噬菌斑表明噬菌体可裂解该菌株，反之则不能，以此确定噬菌体的宿主范围。中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年10101.7噬菌体的体外抑菌试验调整3099-2aT菌液的OD595nm至0.1(活菌数约：3.8伊108cfu/mL)，以MOI100、MOI 1、MOI 0.01加入噬菌体，以3099-2aT作为阳性对照组，并加入等量MHB液体培养基，置于37 恒温摇床180 r/min震荡培养24 h，每3 h测定OD595nm值，每组设3个重复，根据OD595nm值绘制噬菌体体外抑菌曲线。利用SPSS 21.0软件对试验结果进行统计分析，通过方差分析和 检验进行数据分析，以评估试验组间的差异显著性。1.83099-2aT对大蜡螟幼虫致病性及噬菌体攻毒保护率试 验将3099-2aT菌液 以8 000 r/min离心10 min，弃上清收集菌体，利用1 mL生理盐水洗2次后分别10倍倍比稀释至4伊104cfu/mL4伊108cfu/mL16。将体质量250 mg300 mg，体长250 mm270 mm，通体米黄色，采食、活动、吐丝正常的大蜡螟幼虫60只，随机分为6组，每组10只，15组为实验组，第6组为阴性对照组。饥饿处理24 h，利用70%的酒精对大蜡螟幼虫体表消毒后立即用无菌滤纸将体表擦干。15组自尾部第一左足处分别注射10 滋L上述5个浓度3099-2aT菌液，第6组阴性对照组注射相同体积生理盐水，置于37 黑暗培养箱，禁食处理，每3 h记录死亡数量，连续记录24 h。选取致死率约70%80%的菌量为后续试验感染量。将60只大蜡螟幼虫，随机分为6组，A组为阴性对照，注射生理盐水，B组为噬菌体安全性对照组，注射生理盐水和噬菌体，C组为阳性对照，注射菌液和生理盐水，DF组为噬菌体治疗组，注射菌液和不同MOI噬菌体，每组10只，饥饿处理24 h后，于最后一对尾足分别注射对应菌液和噬菌体液(表1)，两次注射间隔30 min，注射后幼虫置于37 黑暗环境禁食处理。每1.5 h观察一次，连续观察24 h并记录大蜡螟幼虫存活率(当大蜡螟幼虫在触碰刺激下不表现任何运动行为时，即认为已经死亡16)。1.9噬菌体的全基因组特征分析利用illumina Novaseq 6000测序平台对噬菌体进行全基因组测序(广东美格基因科技有限公司，广州)。DNA样品检测合格后构建文库，采用软件Soapnuke对测序的数据质量进行评估，去除低质量数据，确保结果可信度。利用Megahit软件对clean data进行de novo组装。利用checkv软件，将组装出来的contig与checkv病毒数据库比对，获取病毒序列，并采用samtools depth计算这些序列的测序深度。采用Prokka预测contigs上的基因序列，统计预测出来的噬菌体基因数目、长度等。采用NCBI在线工具BLAST(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进 行 噬 菌体全基因组序列比对，利用MetaGeneMark(v3.38)预测噬菌体基因组基因，利用Blast(e0.05)；60 时效价为6.4伊106pfu/mL，与37 时效价相比，约占77.51%，差异极显著(0.05)，pH2和pH12时则完全失活(图2B)。表明，pPA-3099-2aT.2具有良好的稳定性，可应用于多种温度和酸碱环境中。2.3噬菌体一步生长曲线的测定结果在噬菌体与细菌共培养0、5min、10min、20min、30min、40min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min、110 min时，分别取混合液400 滋L，10 000 r/min离心1 min后，取上清100 滋L采用双层平板法测定噬菌体效价，根据效价绘制噬菌体一步生长曲线。结果显示，pPA-3099-2aT.2潜伏期小于10 min，裂解期持续至100 min，100 min后进入平台期(图3)，裂解量为178 pfu/cell。表明pPA-3099-2aT.2具有较强裂解活性。2.4噬菌体宿主谱测定结果通过观察受试18株PA双层平板上是否出现噬菌斑，测定pPA-3099-2aT.2宿主谱。结果显示，pPA-3099-2aT.2除裂解原宿主菌MDR 3099-2aT(ST198型)外，还可裂解其他7株受图1pPA-3099-2aT.2噬菌斑(A)和形态(B)观察结果ABA：温度稳定性；B：酸碱稳定性A:Temperature stability;B:Acid-base stability图2pPA-3099-2aT.2稳定性检测结果B120100806040200120100806040200ATemperature/70605037254-20pH121087642图3pPA-3099-2aT.2一步生长曲线测定结果Time/min110201510501009080706050403020100中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1012试菌，包括人类来源分离株3180-3aT(ST3683型)、3102-3aT(ST274型)、3111-1At(ST3683型)以及2株未知分型的3094-2At和3103-3aT、水环境来源分离株1308-2Dr(ST3875 型)和 蚊 子 来 源 分 离 株 1803-4At(ST3216型)(表2)。表明pPA-3099-2aT.2可识别多种ST分型PA，宿主谱较宽。2.5噬菌体的体外抑菌试验结果采用酶标仪每3 h时测定阳性对照、MOI 100、MOI 1、MOI 0.01组噬菌体与细菌混合液的OD595nm值，检测pPA-3099-2aT.2体外抑菌活性。结果显示，与阳性对照组相比，pPA-3099-2aT.2在9 h内各MOI组抑菌效果(OD595nm值)均良好，且组间无显著性差异(0.05)，9 h18 h时不同MOI组抑菌效果不同，其中MOI 0.01组抑菌效果最好，MOI 100组抑菌效果最差，抑菌效果与MOI呈负相关(图4)。不同浓度MOI噬菌体对细菌均有抑制效果，且MOI 0.01的噬菌体能够有效延缓抗性菌出现时间，但在24 h后各组MOI的噬菌体均无法抑制细菌生长，这可能与抗性菌的过多增殖有关。表明pPA-3099-2aT.2具有良好体外抑菌能力。2.63099-2aT对大蜡螟幼虫致病性及噬菌体攻毒保护率试验效果各组分别感染4伊104cfu/mL4伊108cfu/mL 3099-2aT菌液10 滋L，检测3099-2aT对大蜡螟幼虫的致病性。结果显示，3099-2aT的感染量分别为4伊106cfu/mL、4伊107cfu/mL、4伊108cfu/mL(10 滋L)时，12 h后大蜡螟幼虫致死率达到80%、90%和100%(表3)，24 h后其死亡率高达90%及以上。注射量为4伊104cfu/mL(10 滋L)在12 h内大蜡螟幼虫未见死亡，24 h后死亡率为80%，因此本研究选取4伊104cfu/mL(10 滋L)为后续试验的感染量。除阴性对照和噬菌体安全组大蜡螟幼虫不注射细菌外，阳性对照和噬菌体治疗组均感染10 滋L浓度为4伊104cfu/mL的3099-2aT，30 min后分别注射10 滋L生理盐水、MOI 100、MOI 1、MOI 0.01 pPA-3099-2aT.2，每1.5 h观察一次，记录大蜡螟幼虫的死亡数表 2pPA-3099-2aT.2 宿主谱测定结果细菌名称Bacterialname1308-2Dr1482-1At1803-4At2072-5at2510-1aT2510-2AT2512-1at2509-1aT2509-2aT3180-3AT3099-2aT1705-2At2066-2at2520-4dT3094-2At3102-3aT3103-3aT3111-1At防空洞水样Sewage of bomb shelter颊锥尾鹦鹉粪便Green-cheeked parakeet droppings蚊子体内In mosquito防空洞土壤Soil from the bomb shelter高冠变色龙口腔Mouth of a veiled chameleon高冠变色龙口腔Mouth of a veiled chameleon犀牛鬣蜥皮肤伤口Cyclura cornuta skin wound犀牛鬣蜥皮肤伤口Cyclura cornuta skin wound犀牛鬣蜥皮肤伤口Cyclura cornuta skin wound人类粪便Human feces重症痰样Human sputum人类粪便Human feces防空洞土壤Soil from the bomb shelter黄喉拟水龟皮肤Mauremys mutica skin重症痰样Human sputum重症痰样Human sputum重症痰样Human sputum重症痰样Human sputum裂解性Lytic+-+-+-+宿主菌ST分型ST typing ofhost bacteria387532163683198未知Unknown274未知Unknown3683注：+：可裂解；-：不可裂解。Note:+:lytic;-:no lytic表 33099-2aT 对大蜡螟幼虫致病性的试验结果感染量Amount of infection4伊108cfu/mL(10滋L)4伊107cfu/mL(10滋L)4伊106cfu/mL(10滋L)4伊105cfu/mL(10滋L)4伊104cfu/mL(10滋L)生理盐水Physiological saline12 h 死亡率Mortality at 12 hours100%(10/10)90%(9/10)80%(8/10)20%(2/10)0(0/10)0(0/10)24 h 死亡率Mortality at 24 hours100%(10/10)100%(10/10)90%(9/10)100%(10/10)80%(8/10)0(0/10)曾君，等.一株宽宿主谱多重耐药铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性与基因组特征分析第 10 期1013图4pPA-3099-2aT.2体外抑菌活性检测结果0.90.80.70.60.50.40.30.20.10Positive controlMOI 100MOI 0.01MOI 1Time/h24211815129630拉丁学名Latin scientific name细菌来源Bacterial source和状 态，检 测 pPA-3099-2aT.2对大 蜡螟幼 虫感染3099-2aT的保护效果。结果显示，24 h内阴性对照组和噬菌体安全组大蜡螟幼虫全部存活且状态良好，阳性组大蜡螟幼虫死亡9只，不同MOI的噬菌体对感染3099-2aT的大蜡螟幼虫保护效率存在差异。感染18 h内，各治疗组噬菌体对大蜡螟幼虫均保护良好。感染21 h后，D组(MOI 100)大蜡螟幼虫存活率为100%，E组(MOI 1)存活率为60%，F组(MOI 0.01)存活率为50%。感染24 h后，与阳性对照组大蜡螟幼虫存活率相比，D组大蜡螟幼虫存活率100%，两者存在极显著差异(0.01)，E组存活率60%，与阳性对照组存在显著差异(0.05)。基于大蜡螟幼虫 存 活 率 的 Kaplan-Meier 曲 线 分 析，结 果 显 示，pPA-3099-2aT.2体内抑菌效果与其MOI呈正相关(图5)。表明pPA-3099-2aT.2对感染3099-2aT的大蜡螟幼虫具有良好保护效果。2.7噬菌体全基因组特征分析结果高通量测序结果显示，pPA3099-2aT.2的基因组是双链DNA，全长93 031 bp，GC含量49.4%。全基因组序列BLAST结果显示，该噬菌体为纲，帕克普纳属()成员，与PA噬菌体vB_PaeM_C2-10_Ab02高度同源(Query Cover=85%,Per.Ident=98.3%)。根据功能基因预测，基因组包括4个已知的基因簇模块：(1)裂解模块，包括穿孔素超家族III的穿孔素-X、N-乙酰胞壁酰胺酶、细胞壁水解酶等编码基因；(2)DNA包装模块，包括末端酶大亚基等基因；(3)结构组装模块，包括噬菌体尾部组合伴侣蛋白、基板J-like蛋白、主要衣壳蛋白E、噬菌体姿头部装饰蛋白D、卷尺蛋白、结构蛋白ORF10等编码基因；(4)核酸复制与调控模块，包括DNA聚合酶、DNA解旋酶和RNA聚合酶、RNA还原酶、HNH 核酸内切酶等编码基因；(5)未知功能基因模块，其编码蛋白功能未知(图6A)。N-乙酰胞壁酰胺酶蛋白氨基酸序列BLAST结果显示，pPA3099-2aT.2与 PA噬 菌 体 vB_PaeM_C2-10_Ab1 同 源 性 最 高(Query Cover=100%，Per.Ident=100%)。进一步检索GenBank数据库，得到32个假单胞菌属噬菌体内溶素基因编码的N-乙酰胞壁酰胺酶氨基酸序列构建系统发育树。发现pPA3099-2aT.2与11个噬菌体处于同一进化分支，且同属于帕克普纳属 成 员，宿 主 均 为 PA(图 6B)。因 此，噬 菌 体pPA3099-2aT.2基因组中N-乙酰胞壁酰胺酶在噬菌体帕克普纳属和宿主细菌PA种中显示较高的保守性。图5pPA-3099-2aT.2对大蜡螟幼虫攻毒保护率试验结果Negative controlPhage safety controlPositive controlMOI 100MOI 1MOI 0.01Time/h24.022.521.019.518.016.515.013.512.010.59.07.56.04.53.01.501.00.80.60.40.20图6pPA-3099-2aT.2基因组结构(A)及其N-乙酰胞壁酰胺酶氨基酸序列系统发育树的绘制(B)火黄病毒属AB帕克普纳属奥塔哥属柠檬属南国属分离地区Isolated from the region中国China宿主菌Host bacteria英国UK美国USA比利时Belgium新西兰New Zealand意大利Italy德国Germany俄罗斯Russia丁香假单胞菌荧光假单胞菌铜绿假单胞菌种属SpeciesvB PaeMC2-10 Ab02phiPsa374Zigelbrucke-1Zigelbrucke-2phiMKPA10K8K5C11PaP1PaoP5pPA3099-2aT.2vB PaeMC2-10 Ab1vB PaeMLCK69vB Pae KatvB PaeMMAG1ITTPLJG004KPP10-2vB PaeMG1KPP10Epa26PAP-JPEpa18vB PsyMKIL3bvB PsyMKIL4vB PsyMKIL1DobbyvB Pae BR319aphiPsa397PN09NoxiferK4核酸复制与调控Nucleic acid replication and regulation噬菌体结构蛋白Phage structural protein裂解酶Lytic enzyme核酸包装Nucleic acid packaging未知蛋白Proteins with unknown function采用SWISS MODEL在线工具，以7q4t.1.A En-dolysin为模板同源建模，结果显示，pPA3099-2aT.2基因组编码的内溶素N-乙酰胞壁酰胺酶基因与PA噬菌体JG004 lysozyme(Pae87)中Pae87和肽聚糖结合片中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1014曾君，等.一株宽宿主谱多重耐药铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性与基因组特征分析第 10 期1015段编码基因的同源性达98.39%；采用Alpha Fold Co-lab对N-乙酰胞壁酰胺酶进行蛋白三维结构预测，结果如图7A；采用DNAMAN v6多序列比对pPA3099-2aT.2、噬菌体JG004 lysozyme(Pae87)和vB_PaeM_C2-10_Ab1的内溶素N-乙酰胞壁酰胺酶的氨基酸序列，结果显示，pPA3099-2aT.2的N-乙酰胞壁酰胺酶存在3处氨基酸突变，分别是：H60R、K162R和Q183K(图7B)。3讨论噬菌体在自然界广泛存在，具有丰度高，分布广和种类众多等特点，其特异、专一裂解宿主细菌，具备应对后抗生素时代研发新型替代药物的潜力17-18。本研究以宽宿主谱裂解性噬菌体pPA-3099-2aT.2为研究对象，基于其生物学特性，利用全基因组测序对其基因组深入分析。根据2022年国际病毒分类学委员会批准的新分类标准，结合透射电镜和测序结果表明，pPA-3099-2aT.2归类于纲，帕克普纳属19。其在温度-20 50，pH610时均保持活性稳定，其中温度37 和pH6时该噬菌体效价最高，当其处于70 和pH2、pH12时失去活性。噬菌体对温度、pH值的耐受能力与噬菌体所处环境条件密切相关，温度对噬菌体感染能力的影响取决于噬菌体的结构组分对温度变化做出的分子响应