山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212029山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析谷尚品1，侯晓璇1，王彪1，王小娟2，王孟月2，谭菲菲2*，田克恭1,2*(1.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州450046；2.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳471000)摘要：为了解目前我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株基因组特征，本实验室于2020年从山东某养殖集团不同场区采集7份疑似感染PRRSV的组织样品，进行RT-PCR检测，将阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离病毒，利用间接免疫荧光试验(IFA)对分离病毒进行鉴定，经PCR对分离株全基因组序列分段扩增，采用生物信息学软件对分离株的ORF5基因及全基因组序列的同源性、NSP2氨基酸序列缺失特征和ORF5氨基酸变异位点及糖基化位点、ORF5基因与全因因组遗传演化关系分析以及全基因组的重组分析。结果显示：7份组织样品均呈PRRSV阳性，其中有6份阳性样品接种猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)后产生细胞病变，且通过荧光显微镜可观察到特异性绿色荧光，表明分离到6株PRRSV；对6株PRRSV的全基因组序列扩增、测序、拼接，通过全基因组序列同源性对比发现6株PRRSV全基因序列之间的同源性约99.4%100%，表明6株PRRSV是同一来源，选择其中1株(SDlz0720株)进行后续分析。序列分析结果显示：SDlz0720株NSP2氨基酸序列均具有“111+1+19aa”的缺失特征，与NADC30-like PRRSV NSP2氨基酸序列缺失特征一致；ORF5氨基酸序列同其他谱系对比在诱骗表位区域、高变区均发生了氨基酸的突变。ORF5基因进化树结果显示，SDlz0720株位于类NADC34-like PRRSV分支，而全基因组进化树结果显示SDlz0720株位于NADC30-like PRRSV分支，属于Sublineage1.8。重组分析结果显示，该株病毒是由NADC30-like PRRSV与HP-PRRSV和NADC34-like PRRSV重组产生。上述结果表明目前我国PRRSV流行株类型多样，美国输入性病毒株与我国本土病毒株发生了复杂的重组现象。本研究通过对PRRSV的分离鉴定与遗传进化分析为PRRSV分子流行病学研究提供了数据支持。关键词：流行病学；序列比对；分离和鉴定；进化树中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0682-08Isolation identification and genome sequence analysis of porcinereproductive and respiratory syndrome virusGU Shang-pin1,HOU Xiao-xuan1,WANG Biao1,WANG Xiao-juan2,WANG Meng-yue2,TAN Fei-fei2*,TIAN Ke-gong1,2*(1.College of Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,China;2.National Research Center for Veterinary Medicine,Luoyang 471000,China)Abstract:To investigate the genomic characterization of the circulating porcine reproductive and respiratory syndrome virus收稿日期：2022-12-29基金项目：郑洛新自创区创新引领型产业集群专项项目(201200211200)作者简介：谷尚品(1997-)，女，河南濮阳人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究.*通信作者：E-mail：;*Corresponding author(PRRSV)strains,seven lung tissue samples of pigs with suspected PRRSV infection from different farms in Shandong Province in2020 were collected.RT-PCR was performed,and the positive samples were inoculated into porcine alveolar macrophages(PAMs)for virus isolation.An indirect immunofluorescence assay was used to identify the isolated virus.PCR amplification was done forwhole genome sequencing of the isolates.The isolates nucleotide homology,NSP2 amino acid sequence deletion,ORF5 aminoacid variation sites,and genetic evolution were analyzed by biological software.The results showed that seven tissue samples werePRRSV positive,six samples induced cytopathic effect after inoculation with PAM,and specific fluorescence could be observed byindirect immunofluorescence,indicating that six strains of PRRSV were successfully isolated.The nucleotide homology of the sixisolates was 99.4%-100%,indicating that PRRSV in different fields of the group could be from the same source.One of theisolates(SDlz0720)was selected for subsequent analysis,and NSP2 of the SDlz0720 strain had the deletion feature of111+1+19aa,which was consistent with the deletion pattern of NADC30-like PRRSV.Amino acid mutations occurred in thedecoy epitope and hypervariable regions in the ORF5 amino acid sequence compared to other lineages.The results of the ORF5gene phylogenetic tree showed that SDlz0720 was clustered to the NADC34-like PRRSV branch,while the phylogenetic tree basedon the whole genome showed that SDlz0720 was clustered to the NADC30-like PRRSV branch,belonging to sublineage1.8.Therecombinant analysis showed that the virus was generated from recombination of NADC34-like PRRSV with HP-PRRSV andNad34-like PRRSV,indicating that Nad34-like PRRSV with HP-PRRSV was recombined,which made the epidemic situation ofPRRSV in China more diversified.The virus isolation and genetic evolution analysis provide data to support the evolution ofPRRSV and epidemiological investigation,which has important guiding significance for PRRS prevention and control.Key words:epidemiology;sequence alignment;phylogenetic tree;virus isolation and identification猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是 由PRRS病 毒(PRRSvirus，PRRSV)引起的一种猪繁殖和呼吸系统障碍的传染病，其病原多样化、具有易变异易重组且毒株间交叉保护差的特点1。PRRSV属于动脉炎病毒科()、茁-动 脉 炎 病 毒 属()，2021年国际病毒分类委员会(The International Com-mittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将其分为两个种：分别是代表株为LV(Lelystad virus)的PRRSV-1和代表株为VR2332(ATCC VR2332)的PRRSV-22。1996年，郭宝清等分离到国内首株PRRSV CH-1a株，该病毒主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病，是我国养猪场早期PRRSV的流行株3。2006年，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在我国出现，对猪有较高的发病率和较强的致死性，且该类病毒传播力很强，在我国短时间内大范围流行4。2013年，周峰等首次发现国内PRRS新流行的病毒株与美国参考株NADC30高度同源，且在NSP2有着相同的氨基酸缺失特征，因此将新流行病毒称为类NADC30株(NADC30-like PRRSV)，该类病毒特点是易与其他类型的PRRSV发生重组，并且产生的重组病毒致病力有所改变5。近年来，类NADC34株(NADC34-likePRRSV)开始在国内流行，有学者对NADC34-likePRRSV引起猪的临床症状调查发现，该类病毒对仔猪多为低致病力，但在该病毒分离地均伴随大规模的母猪流产现象，且该类病毒与我国早期NADC30-like PRRSV流行特点基本相同，具有成为流行株的潜力6。PRRSV是一个基因组全长约15 kb的RNA病毒，至 少 包 含10个 开 放 阅 读 框(Openreading frame，ORF)，其中编码RNA复制酶多聚蛋白的ORF1(分为ORF1a和ORF1b)约占基因组全长的80%。编码非结构蛋白(Non-structural protein，NSP)：NSP1琢，NSP1茁和NSP2NSP12，其中非结构蛋白NSP2的编码基因变异程度最高7。与经典株VR2332 NSP2的氨基酸序列 相 比，HP-PRRSV的NSP2氨 基 酸 序 列 存 在“1+29aa”不连续缺失，NADC30-like PRRSV的NSP2存 在“111+19+1aa”不 连 续 缺 失，NADC34-likePRRSV的NSP2存在“100aa”的连续缺失，NSP2不同数量氨基酸的缺失可以作为探究PRRSV变异的特殊标记8-9。PRRSV基因组的ORF2ORF7编码病毒8种结构蛋白，PRRSV中突变率最高的结构蛋白是由ORF5基因编码的GP5蛋白，其有许多糖基化位点，大多数PRRSV的分子流行病学监测均集中在ORF5基因，所以在分析PRRSV基因序列时不仅是NSP2氨基酸序列突变和缺失特征关注度较高，同时ORF5基因谷尚品，等.山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析第7期683表1扩增分离株全基因组的引物序列引物名称PrimerPRRSV-1FPRRSV-1RPRRSV-2FPRRSV-2RPRRSV-3FPRRSV-3RPRRSV-4FPRRSV-4RPRRSV-5FPRRSV-5RPRRSV-6FPRRSV-6RPRRSV-7FPRRSV-7RPRRSV-8FPRRSV-8RPRRSV-9FPRRSV-9RPRRSV-10FPRRSV-10RPRRSV-11FPRRSV-11RPRRSV-12FPRRSV-12R序列(5-3)Primer sequence(5-3)TATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGCCATATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGCCACAGGGTGTTTTGGCGAGGCAGTCAAGGCAGCAGGTCGGGCGACTGATGAAGATCTTGACCAACGGTAAGGTCGCTCTCAAGCGCCTTTCACCTTGGCTGACAAGTTCCACCGAGGTCACATAAATTCCGGCGATTGAAAATCAGGCAGATCTCCAAGTCCAAGGAGAAAACACTCCGGACCAGGATTCCTCCTGTGGAGAATGATGGTCTTTACCGCTGTCTCAGTAACAACCAGGGCCTGACTAAGGAGCAGCTGCGAGAATCCTGTCACGGTTTCAGACAGACCCAAAGAAGACACCAGGTTGACAGGGTGCGGGCAAGACATGCCATCTTTGTGTATGACCGCACAGGGGAAGGAAAACCTCATAGGATCTGCATCAGATTGGTTTGCTCCACGATACGCCAATCTGTGCCATTCAGCTCACATATCGTGTGGTGTATCGTGCCGTTGCATGGTTCTCGCCAATTAAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGAATTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAAT产物大小/bpProduct size18871617159816531691150017371501161417321565473的遗传多样性也成为了PRRSV研究的热点10。本研究从山东地区某规模化养猪集团的不同场区采集疑似感染PRRSV的7份临床样品，经PCR鉴定均为PRRSV阳性后，将6份阳性样品接种至PAM分离PRRSV，利用PCR分段扩增病毒全基因组序列，对分离株全基因组序列的同源性、NSP2和ORF5氨基酸序列缺失变异特征、遗传演化关系及全基因组重组事件分析，以期了解我国PRRSV的流行情况并制定更科学的防控策略。1材料与方法1.1主要实验材料PRRSV阳性对照样品为已鉴定的PRRSV阳性的肺组织样品研磨液上清；PAM由本实验室分离保存。7份肺脏组织样品为2020年7月采自山东省某养殖集团不同场区疑似感染PRRSV的猪。QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司；M-MLVReverseTranscriptase、RNaseInhibitor、dNTP购 自Promega公 司；pEASY-Blunt克 隆 载 体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Poly-merase dNTP Mixture、DNA Marker、琼脂糖均购自TaKaRa公司；2伊PCR Master Mix购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；RPMI-1640培养基干粉购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；鼠源PRRSV N蛋白单克隆抗体(MAb)购自VMRD公司；FITC标记的羊抗鼠IgG购自赛默飞世尔科技公司。1.2引物设计采用文献11中引物436-F/R，用于PRRSV的RT-PCR检测，扩增片段为436 bp。参考GenBank登录的PRRSVIA/2014/NADC34株(MF326985)和NADC30株(JN654459)的 全 基 因 组 序 列，采 用Primer Premier 5.0软件设计12对引物(表1)，用于PCR分段扩增PRRSV的基因组，引物均由天津金唯智生物科技有限公司合成。1.3临床样品的RT-PCR检测取适量临床样品研磨后，取研磨液上清和PRRSV阳性对照样品研磨液上清分别过滤除菌，阴性对照为ddH2O，利用QIAampViral RNA Mini Kit提取病毒RNA，采用M-MLV Re-verse Transcriptase反转录得到cDNA，以其为模板，采用引物436-F/R进行PCR鉴定。1.4病毒分离及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定将1.3中PCR检测 为PRRSV阳性 的 病 料 上 清 液 接 种PAM，盲传3代至细胞出现细胞病变(CPE)达80%时收获。将获得的每代培养物上清按照1.3的PCR方法鉴定。同时将收获的P3代上清接种PAM培养，无论细胞是否出现明显CPE，均以PRRSV N蛋白MAb(1颐1 000)为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG(1颐500)为二抗，经IFA鉴定。1.5分离株全基因组序列的扩增提取P3代病毒液RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PrimeSTARHS DNA Polymerase聚合酶，利用表1中引物，PCR分段扩增病毒基因组，回收纯化目的片段并克隆至pEASY-Blunt载体，转化感受态细胞，挑菌经PCR鉴定后由天津金唯智生物科技有限公司测序。利用Seq-Man软件对全基因组各片段序列拼接，得到PRRSV全基因组序列。1.6分离株全基因组序列、NSP2、ORF5氨基酸序列分析，及ORF5基因与全基因组遗传进化分析为了解分离株与其他谱系PRRSV参考株的遗传关系，利用MegAlign软件中Clustal W法分析分离株与参考株全基因组序列的同源性、NSP2氨基酸序列的缺失特征和ORF5氨基酸变异位点，通过NetNGlyc l.0中 国 预 防 兽 医 学 报2023年684Sever在 线 软 件(https:/services.healthtech.dtu.dk/ser-vice.php?NetNGlyc-1.0)对ORF5序列糖基化位点进行预测。利用MEGA X软件中NJ(Neighbor-joining)邻近法对分离株与参考株的ORF5基因和全基因组构建遗传进化树。1.7分离株全基因组重组分析采用SimPlot(v3.5.1)和RDP4(v4.97)软件将分离株与各谱系PRRSV参考株(VR2332、JXA1、QYYZ、NADC30和NADC34)进行全基因组重组事件检测和重组分析。2结果2.1临床样品的RT-PCR检测结果利用表1中436-F/R引物，以7份样品的cDNA为模板进行PCR检测，结果显示，7份样品均能扩增出436 bp的目的片段，与预期一致，同时阴性对照和阳性对照均成立。7份样品分别命名为SDlz0720、SDlz0721、SDlz0722、SDlz0723、SDlz0724、SDlz0725、SDlz0726。表明采样猪场存在PRRSV感染。2.2病毒分离及IFA鉴定结果将PCR检测为阳性的7份PRRSV样品研磨液上清液接种PAM盲传3代分离 病 毒。结 果 显 示，其 中SDlz0720、SDlz0722、SDlz0723、SDlz0724、SDlz0725、SDlz0726样品上清液 接 种PAM连 续 传 代 可 观 察 到 明 显 的CPE(以SDlz0720样品为例，图1)，而SDlz0721样品在连续传代过程中，每代PAM均未观察到CPE。将7份PRRSV阳性样品P3代细胞培养物上清液接种PAM，经IFA检测，结果显示，除接种SDlz0721 P3代上清的PAM外，其他均可观察到特异性绿色荧光，且阴性对照组细胞未观察到绿色荧光(图2)。以上鉴定结果表明，SDlz0720、SDlz0722、SDlz0723、SDlz0724、SDlz0725、SDlz0726 6份样品分离到病毒。2.3分离株SDlz0720全基因组序列同源性分析利用PCR分段扩增后测序结果显示各片段均与预期一致。采用DNAStar软件拼接分离株全基因组序列，将分离株之间，以及与各谱系PRRSV参考株的全基因组序列进行同源性比对。结果显示，6株分离株之间全基因组序列同源性为99.4%100%，同源性极高，可能是来源于相同的病毒，因此选择1株(SDlz0720株)进行后续序列分析。同PRRSV-1参考株对比，SDlz0720株与参考株LV全基因组序列同源性为60.1%；同PRRSV-2参考株对比，分离株与经典株VR2332(Lineage 5)和我国经典株CH-1a(Lineage 8)全基因序列同源性分别为84.6%和84.7%；与HP-PRRSV JXA1株(Lineage 8)的全基因组序列同源性为84.6%；与QYYZ株(Lineage 3)全基因组序列同源性为82.1%；与NADC34株(Sublineage 1.5)全基因组同源性为85.4%；与NADC30株(Sublineage 1.8)全基因组序列同源性较高，为90.7%。以上结果表明，SDlz0720株 属于PRRSV-2，全基 因 核 苷酸 序 列 与NADC30株(Sublineage1.8)同源性最高。2.4分离株SDlz0720 NSP2氨基酸序列的分析利用MegAlign软件将SDlz0720株与PRRSV参考株NSP2氨基酸序列比对分析，结果显示，与经典株VR2332比 较，SDlz0720株NSP2在aa322aa432、aa483和aa504aa522处存在131个不连续氨基酸缺失，具有与美国分离的NADC30株和我国分离的NADC30-likePRRSV相同的缺失特征，缺失模式均为“111+1+19aa”，且无其它氨基酸序列的插入和缺失。表明SDlz0720株属于NADC30-like PRRSV。2.5分离株SDlz0720 ORF5氨基酸变异及糖基化位点分析采用MegAlign软件对SDlz0720株ORF5氨基酸序列进行对比分析，结果显示，不同类型病毒株的ORF5氨基酸序列差异主要集中在信号肽区(aa1aa26)、诱骗表位(aa27aa30)和2个高变区(aa32aa35、aa57aa61)。根据2.3和2.4结果可知分离株谷尚品，等.山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析第7期685A：正常PAM；B：SDlz0720接种48 h后的PAM；C：SDlz0720接种72 h后的PAMA:Normal PAM cells;B:PAM cells infected with SDlz0720 for 48hours;C:PAM cells infected with SDlz0720 for 72 hours图1PRRSV接种PAM细胞病变(100伊)ABCA：阴性对照；B：分离株SDlz0720A:Negative control;B:SDlz0720 isolates图2分离株SDlz0720的IFA鉴定结果(100伊)AB荫：分离株SDlz0720荫:SDlz0720 isolates图3基于ORF5基因(A)和全基因组(B)的系统进化树SDlz0720属 于Lineage 1、与 经 典 株VR2332相 比，SDlz0720株和Lineage 1参考株在V27A、A29V、L47I、V94I、R191K均发生一致的突变；与其他谱系参考株相比，分离株在诱骗表位(Decoy epitope)的aa28和高变区(HVR1和HVR2)的aa32、aa57、aa58以及aa95均发 生 了 突 变。此 外，与Lineage 1参 考 株 相 比，SDlz0720株在L25F、I161V、V189I发生了与Lineage 8参考株相同的突变。SDlz0720株GP5蛋白氨基酸序列的N-糖基化位点预测结果显示：SDlz0720株GP5蛋白有4个潜在N-糖基化位点，分别是N33、N34和2个保守N-糖基化位点(N44和N51)。因为SDlz0720株属于Lineage 1，与参考株NADC30(糖基化位点为N34、N44、N51)相比在aa33处由S33突变为N33，增加了1个糖基化位点，与参考株NADC34(糖基化位点为N32、N33、N44、N51、N57)相比发生了N32D、N57A、S34N的突变，减少了1个糖基化位点。以上结果表明分离病毒株的毒力可能与上述糖基化位点的改变有关。2.6分离株SDlz0720 ORF5基因及全基因组的遗传进化分析采用Mega6.0软件将SDlz0720株ORF5基因和全基因组分别与参考株相应基因构建遗传进化树。ORF5基因遗传进化树显示，SDlz0720株位于NADC34-like PRRSV的分支上，属于Sublineage1.5(图3A)，与中国早期NADC34-like PRRSV亲缘关系较近。全基因组遗传进化树显示，SDlz0720株位于NADC30-like PRRSV的分支上，属于Sublineage 1.8，与参考株YC-2020和SCcd2020的亲缘关系较近，这两个参考株均是由NADC34-like PRRSV与Sublineage1.8和Sublineage 8.7重组形成12-13(图3B)。以上结果表明，基于ORF5基因和全基因组遗传演化结果的差异推测SDlz0720为1株重组PRRSV。2.7分离株 SDlz0720全 基因 组的 重组分 析将SDlz0720株作为比对株，与各谱系参考株一起采用Simplot软件q和RDP4软件对SDlz0720株进行重组分析。结果显示，SDlz0720株是以NADC30株为骨架，JXA1株和IA/2014/NADC34株提供重组片段的重组病毒(表2)。SCcd2020株基因组有3个重组区域6个重组断点，这些断点将其分为7个基因区域，A(nt1nt5422)、B(nt5423nt8180)、C(nt8181nt12187)、D(nt12188nt13454)、E(nt13455nt13749)、F(nt13750nt14720)和G(nt14721nt15203)。根据以上不同的区域构建遗传进化树，结果显示，A、C、E、G基因区域位于NADC30-like PRRSV分支、B基因区域位于HP-PRRSV分支，D、F基因区域位于NADC34-like PRRSV分 支(图4)。以 上 结 果 表 明，SDlz0720株 是NADC30-like PRRSV、HP-PRRSV和NADC34-like PRRSV之间重组形成的。中 国 预 防 兽 医 学 报2023年686ABNCV-23 KX192116 GP5NCV-16 KX192113 GP5IA-2015-ISU-9 MF326996 GP5NCV-26 KX192119 GP5CH-1R EU807840 ORF5CH-2018-NCV-Anheal-1 MH370474 GP5IA-2015-ISU-10 MF326997 GP5IA-2015-NADC35 MF326986 GP5IA-2014-NADC34 MF326985 GP5HLHDZD32-1901 MN648449 GP5HLJZD30-1902 MN648055 GP5SDlz0720 GP5LNWK130 MG913987 GP5FJ0908 MK202794 GP5JL580 KR706343 GP5HLJZD22-1812 MN648450 GP5HENAN-XINX KF611905 GP5HENAN-HEB KJ143621 GP5HNjz15 KT945017 GP5ISU30 KT257977 GP5WUH5 KU523366 GP5CHsx1401 KP861625 GP5NADC30 JX654459 GP5LNWK96 MG860516 GP5FJY04 KP860910 GP5RespPRRS MLV AF066183 GP5BJ-4 AF331831 GP5VR2332 U87392 GP5Lineage 3(QYYZ-like)CH-1 AY032626 GP5JXA1 P80 FJ548853 GP5TJ EU860248 GP5JXwn06 EF641008 GP5HUN4 EF635006 GP5JXA1 EF112445 GP5HEB1 EF112447 GP5GM2 JN662424 GP5QYYZ JQ308798 GP5QY2010 JQ743666 GP5Lineage 8(HP-PRRSV-like)Lineage 5(VR2332-like)Sublineage 1.8(NADC30-like)Sublineage 1.5(NADC34-like)739750586310099997157989961556094100100100100NCV-23 KX192116NCV-16 KX192113NCV-26 KX192119IA-2015-ISU-10 MF326997CH-2018-NCV-Anheal-1 MH370474IA-2015-ISU-9 MF326996IA-2014-NADC34 MF326985HLHDZD32-1901 MN648449HLJZD30-1902 MN648055SDlz0720LNWK130 MG913987FJ0908 MK202794JL580 KR706343HLJZD22-1812 MN648450HENAN-XINX KF611905HENAN-HEB KJ143621HNjz15 KT945017ISU 30 KT257977WUH5 KU523366CHsx1401 KP861625NADC35 MF326986NADC30 JN654459.1CH-1R EU807840RespPRRSMLV AF066183BJ-4 AF331831VR2332 U87392CH-1a AY032626JXA1 EF112445TJ EU860248JXwn06 EF641008HUN4 EF635006HEB1 EF112447GM2 JN662424QYYZ JQ308798QY2010 JQ743666YC-2020 ON180781SCcd2020 MW803134Lineage 3(QYYZ-like)Lineage 8(HP-PRRSV-like)Lineage 5(VR2332-like)Sublineage 1.8(NADC30-like)Sublineage 1.5(NADC34-like)10010096986384651001001001001001001001007969526564100100100100999990100100100100780.0200.020图4分离株SDlz0720不同基因区域构建的进化树谷尚品，等.山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析第7期6873讨论我国是生猪养殖大国，养猪规模位居世界前列，由于频繁跨国、跨省的生猪交易、运输、引种导致一个猪场中有多个病毒株并存，甚至同一猪体同时存在两种差异较大的病毒，这些原因使得我国PRRSV流行株相对于其他养猪国家更为复杂多样14-16。有 研 究 在2010年 2019年 从 我 国 部 分 地 区 感 染PRRSV的临床样品中获得了877株PRRSV ORF5基因序列，对这些基因序列进行重组分析发现，河南省检出的重组病毒数量最多，山东次之17。本实验室从山东某养殖集团不同场区采集疑似PRRS感染的7份组织样品，其中有6份样品分离到PRRSV，扩增6株PRRSV全基因组序列并通过对全基因组序列同源性分析发现，6株分离株属于Lineage 1，且可能是同一来源病毒，推测可能是通过引种途径将病毒带到各个养殖场，并且在不同场区内传播，最终致使不同场区的猪发病。近年来，随着养殖大环境的变化，有学者分析发现，ASF暴发后我国PRRSV在大部分地区的流行更加严重，流行亚型更加多元化，且具有地域性18。因此有必要加强引种检验检疫、优化流通控制模式、加强国内猪群的流行病学监测防控病毒的传播。PRRSV NSP2和ORF5基因常作为PRRSV研究的靶基因19-22。通过对本实验SDlz0720株NSP2和GP5氨基酸序列分析发现，分离株NSP2氨基酸序列与参考株NADC30相比有相同的缺失模式，未发现额外氨基酸的插入和缺失。SDlz0720株GP5蛋白氨基酸序表2分离株SDlz0720重组事件信息重组病毒毒株Recombinantvirus strainSDlz0720主要亲本病毒名称/相似性Names/Similaritiesof major parentvirusesNADC30NADC30NADC30次要亲本病毒名称/相似性Name/Similarityof secondaryparent virusJXA1NADC34NADC34重组位点(nt)Recombina-tion site5423-818012188-1345413750-147202.860伊10-922.860伊10-922.860伊10-921.510伊10-321.510伊10-321.510伊10-323.921伊10-932.880伊10-922.880伊10-921.860伊10-312.880伊10-922.880伊10-921.468伊10-312.880伊10-922.880伊10-92valueRNPGENECONVBootscanMaxChiChimeraRegion ARegion BRegion CRegion DRegion ERegion FRegion GHUN4 EF635006CH-1R EU807840TJ EU860248JXA1 P80NADC30 JN654459.1CH-1a AY032626QYYZ JQ308798GM2 JN662424VR2332 U87392BJ-4 AF331831HENAN-XINX KF611905IA-2014-NADC34 MF326985SDlz0720HLJZD30-1902 MN648055CHsx1401 KP861625TJ EU860248HUN4 EF635006SDlz0720CH-1R EU807840CH-1a AY032626JXA1 P80QYYZ JQ308798GM2 JN662424VR2332 U87392BJ-4 AF331831IA-2014-NADC34 MF326985HLJZD30-1902 MN648055HENAN-XINX KF611905NADC30 JN654459.1CHsx1401 KP861625rJXA1-R MT163314SDA3 JX878380TJ EU860248HUN4 EF635006CH-1R EU807840JXA1 P80NADC30 JN654459.1CH-1a AY032626QYYZ JQ308798GM2 JN662424VR2332 U87392BJ-4 AF331831HENAN-XINX KF611905IA-2014-NADC34 MF326985SDlz0720HLJZD30-1902 MN648055CHsx1401 KP86