绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取纯化及反应原性分析.pdf

-0041-07网络首发时间：2 0 2 3-10-182024,54(01):41-47中国兽医科学2024,54(01)ChineseVeterinaryScienceDOI:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0010中图分类号：S852.62文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96（2 0 2 4)0绵羊肺炎支原体英膜多糖的提取纯化及反应原性分析田彤彤1，葛家振李倩倩3,高鹏程,吴晓妮,宋国栋，刘一健,郑福英2*,储岳峰1,2*（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052;2.中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州730046;3.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)摘要：本研究旨在提取绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae,Mo）G H 3-3的英膜多糖，并验证其反应原性。用无水乙醇沉淀得到粗英膜多糖，再通过苯酚抽提、酶处理去除核酸和蛋白质，进而纯化得到英膜多糖，利用免疫荧光试验证明该英膜多糖的反应原性，利用刚果红试验检测其是否具有三螺旋结构。从1L培养基上清中初步提取得到MoGH3-3粗英膜多糖12.2 4mg，经过纯化得到9.8 mg的精制英膜多糖，其纯化得率约为8 0%。免疫荧光试验结果表明MoGH3-3英膜多糖具有良好的反应原性，刚果红试验首次证明绵羊肺炎支原体英膜多糖具有三螺旋结构。经过乙醇沉淀、苯酚抽提、酶处理、超滤浓缩后，得到高纯度的MoGH3-3英膜多糖。该提取纯化方法简便、成本低，便于生产实践中应用。英膜多糖具有反应原性和三螺旋结构，证明其生物活性良好，为相关诊断试剂、疫苗、佐剂等的研发提供了可参考的多糖制备方法。关键词：绵羊肺炎支原体；英膜多糖；三螺旋结构；反应原性Extraction,purification and reactivity analysis of capsularpolysaccharide of Mycoplasma ovipneumoniaeTIAN Tongtong,CE Jiazhen,LI Qianqian,GAO Pengcheng,WU Xiaoni?,SONG Guodong,LIU Yijian,ZHENG Fuying*,CHU Yuefeng.a(1.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.State Key Laboratory forAnimal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China;3.College of Life Science and Engineering,Northwest Minzu University,Lanzhou 730030,China)Abstract:This study aimed to extract the capsular polysaccharides from GH3-3 strain of Mycoplasmaovipneumoniae and verify its reactivity.Crude capsular polysaccharide was obtained by absoluteethanol precipitation method,then nucleic acid and protein were removed by phenol extraction and en-zyme treatment to obtain purified capsular polysaccharide.Immunofluorescence test was used to provethe reactivity of the capsular polysaccharide,and Congo red test was carried out to verify the triplehelix structure of the capsular polysaccharides.12.24 mg of crude capsular polysaccharides derived收稿日期：2 0 2 3-0 8-15；修回日期：2 0 2 3-10-11基金项目：国家重点研发计划项目（2 0 2 2 YFD1800704，2 0 2 2 YFD 130 2 10 1）；甘肃省科技重大专项（2 2 ZD6NA012）；中国农业科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-2021-LVRI）作者简介：田彤彤（1999-），女，新疆库尔勒市人，硕士生，研究方向为预防兽医学，E-mail：t 112 38 59519 16 3.c o m。*通讯作者：郑福英（197 4-），女，山东济宁人，研究员，博士，主要从事预防兽医学研究，E-mail：z h e n g f u y i n g c a a s.c n；储岳峰（197 8-），男，安徽岳西人，研究员，博士，主要从事草食动物细菌病防控技术及其基础研究,E-mail:chuyue-。42第54卷中国兽医科学from Mo GH3-3 was initially extracted from the supernatant of 1 L medium,and 9.8 mg of refined capsularpolysaccharide was obtained after purification.The purified yield was about 80%.The results of im-munofluorescence experiment showed that Mo GH3-3 capsule polysaccharides had good reactivity.The Con-go red assay confirmed that the capsular polysaccharides of Mo has a triple helical structure.The highpurity capsular polysaccharides of Mo GH3-3 strain were obtained using a combination of technicalmethods,comprising alcohol precipitation,phenol extraction,enzyme hydrolysis,ultrafiltration andconcentration.This extraction and purification assay for Mo capsular polysaccharides is not only sim-ple but also cost-effective,making it is suitable for application in production practice.The capsularpolysaccharides exhibit good reactivity and have a triple helix structure,indicating that its biolo-gical activity is well-preserved.This work provides a reference method for the preparation of polysac-charide for the research and development of relevant diagnostic reagents,vaccines and adjuvants.Key words:Mycoplasma ovipneumoniae;capsular polysaccharide;triple helix structure;reactivity*Corresponding authors:ZHENG Fuying,;CHU Yuefeng,绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)是一种较为常见的可引起绵羊和山羊非典型性肺炎的呼吸道病原体。该病原体最先被Mackay等11分离出来，此后由Carmichael等2 将其命名为绵羊肺炎支原体。感染Mo后，患病羊表现出体温升高、食欲减退、咳嗽流涕、精神萎靡、眼部肿胀和消瘦等症状，且感染后会降低生长速度和生产性能，给畜牧业造成了重大的经济损失3。除绵羊和山羊外，绵羊肺炎支原体还存在于多种野生反台动物中4。目前，Mo在世界多个国家和地区普遍存在5,其危害日益严重。因此，有效防控Mo传播是健康养羊急需解决的问题。荚膜多糖(capsularpolysaccharide,CPS)最早由Dochez和Avery在研究肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae)时发现,有文献报道荚膜多糖是该菌的主要毒力因子6 ,另外有研究表明荚膜多糖也是绵羊肺炎支原体的一个重要毒力因子7 。荚膜多糖具有耐干燥、粘附、抗粘附、抗吞噬以及抵御补体杀伤的生物学功能，通常情况下，荚膜多糖具有反应原性，免疫原性较差，与合适的蛋白质载体结合后可以提高免疫原性8 ,在疾病诊断、疫苗制备和疫苗佐剂中被广泛使用。本试验对绵羊肺炎支原体GH3-3荚膜多糖的提取和纯化进行了探索，并初步建立了提取、纯化的方法，首次成功提取出Mo胞外荚膜多糖并对荚膜多糖的纯度、反应原性、三螺旋结构进行了检测，为今后绵羊肺炎支原体疫苗和诊断试剂的研发奠定了基础1材料与方法1.1菌株与主要试剂绵羊肺炎支原体GH3-3疫苗株由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病团队保存。GMTB糖发酵培养基：PPLOBroth21g、无水葡萄糖4g、丙酮酸钠2 g、酵母浸出液10 0 mL、1%酚红溶液2.5mL定容至8 0 0 mL，高压灭菌后加人马血清2 0 0 mL、青霉素2 0 万IU,并用1mol/LNaOH将培养基的pH值调至7.8 9。PPLOBroth购自BD公司。丙酮酸钠购自Mack-lin公司。酚红购自Sigma公司。马血清购自Gibco公司。RNaseA购自生工生物工程（上海）股份有限公司。DAPI染液、透析袋、DNase I、蛋白酶K均购自北京索莱宝科技有限公司。50 ku超滤管购自Mili-pore公司。BCA试剂盒购自江苏康为世纪公司。小鼠抗山羊FITC荧光二抗试剂盒购自Bioworld公司。其他试剂均是国产分析纯1.2绵羊肺炎支原体英膜结构的观察收集30 mL对数生长中期的绵羊肺炎支原体，1500r/min，离心10 min，弃上清，加人适量3%戊二醛溶液室温固定1h，送电镜室制片，并用透射电子显微镜观察荚膜多糖结构1.3绵羊肺炎支原体GH3-3株的培养将冻存于甘油中的GH3-3株以10%比例接到GMTB培养基中，于37 温箱中培养,待培养基变黄后，连续传代2 3次，待其生长稳定之后，开始扩大培养，取5mL培养液接到1LGMTB培养基中，置于37 温箱中培养1.4英膜多糖的提取Mo GH3-3荚膜多糖的提取参考March101的方法并有所改进。待培养基变黄后，12 0 0 0 r/min,离心25min，收集上清并用冰醋酸将pH值调至5.0 后，煮沸约30 min，12 0 0 0 r/m i n、4,离心15min，上清液用氢氧化钠将pH值调至7.5后用滤纸过滤。将43田彤彤等：绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取纯化及反应原性分析第1期收集的上清与无水乙醇以1：4的比例混合，4过夜。6 0 0 0 r/min、4，离心15min，收集沉淀悬浮于适量的超纯水中，室温混合2 h，6 0 0 0 r/m i n、4，离心30 min，收集上清，热酚法11 除杂蛋白，4过夜30 0 0 r/min、4离心30 min，取水相流水透析48 h，以去除苯酚。110 0 0 r/min、4,离心15min，收集上清液，使用50 ku超滤管超滤、浓缩、置换。超滤管上层液体即为粗提的多糖。1.5英膜多糖的纯化1.5.1用酸性schiff染色观察英膜多糖分子量将粗提的荚膜多糖进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶为5%，分离胶为10%。采用Wambugu12的染色方法将电泳后的凝胶固定在适量的脱色液（甲醇：乙酸：水=40：7：53)中，过夜孵育，弃去脱色液，加人等体积的7%乙酸溶液4平衡1h后弃去，并加人适量的含1%（w/v)高碘酸的7%乙酸溶液，4避光孵育1h，弃去。用水洗涤2 3次之后加人schiff试剂避光孵育10 min，用去离子水洗涤2 3次后完成显色。1.5.2英膜多糖的纯化本研究使用苯酚硫酸法测多糖浓度后进行纯化。加人终浓度为0.1g/L的DNaseI与RNaseA,置于37 水浴锅中孵育12 h，然后加人终浓度为0.1g/L的蛋白酶k置于58 水浴锅中温浴6 h，热酚法除杂蛋白。6 0 0 0 r/min、4离心30 min，将上层液体放人透析袋中透析48 h除去苯酚，使用50 ku超滤管超滤、浓缩、置换。超滤管上层液体即为纯化的多糖。1.6纯化的英膜多糖纯度及浓度的检测1.6.1英膜多糖样品中多糖浓度的测定使用苯酚硫酸法测定所提取的多糖溶液中多糖的浓度。标准曲线的制作：准确称取无水葡萄糖，配置成0.1g/L的葡萄糖标准品溶液。配置显色液：将浓硫酸溶液与5%的苯酚溶液以5：1的比例冰浴中混合。分别取标准葡萄糖溶液0、10、2 0、30、40、50、6 0 L及待测样品10 0 L，不足10 0 L的补充水至10 0 L，加人30 0 L的显色液。10 0 反应2 5min，冷却至室温，测量D49o值。以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算浓度。1.6.2英膜多糖样品中蛋白浓度的测定利用BCA试剂盒测定所提取的多糖溶液中的蛋白浓度。按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤，测量D562值，并绘制以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，吸光光度值为纵坐标的标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。1.6.3英膜多糖样品中核酸浓度的测定使用超微量紫外分光光度计测定所提取的多糖溶液中核酸含量。纯化后的多糖溶液在紫外可见分光光度计上进行全波长扫描（18 590 0 nm）。观察样品在核酸(260nm）和蛋白（2 8 0 nm）吸收波长处的吸收情况，并绘制横坐标为波长、纵坐标为吸光度的图。1.7英膜多糖反应原性分析取Mo GH3-3培养液12 0 0 0 r/min、4离心25min，沉淀用PBS洗3次。加入等体积的8%多聚甲醛溶液，室温固定2 0 min，12 0 0 0 r/m i n、4离心25min，沉淀用PBS洗3次。加入5L一抗（特异性绵羊肺炎支原体抗血清）和5L（0.0 0 2 g/L）的荚膜多糖，设置空白组（加人5LddH,O）和对照组（加人5L浓度为0.0 0 2 g/L酸水解后的荚膜多糖）,4过夜孵育,12 0 0 0 r/min、4离心2 5min，沉淀用PBS洗3次。加人小鼠抗山羊FITC荧光二抗与特异性血清结合,37 湿盒避光孵育90 min，12000r/min、4离心2 5min，沉淀用PBS洗3次。并取适量的DAPI染液对支原体的细胞核进行染色，37室温孵育10 min，12 0 0 0 r/mi n、4离心2 5min，沉淀用PBS洗3次。用10 0 L的PBS重悬，取10L涂于载玻片上，滴加适量荧光淬灭剂，并盖上盖玻片，利用激光共聚焦显微镜观察结果。1.8刚果红试验配置0.2、0.4、0.6、0.8、1mol/L的NaOH溶液分别与8 0 mol/L的刚果红试剂混合，取0.2 g/L精制荚膜多糖样品分别加至上述混合液中，用紫外可见分光光度计测不同NaOH浓度条件下的最大吸收波长，以NaOH浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标作图。2结果分析2.1透射电镜观察通过透射电子显微镜观察MoGH3-3的结构，由图1可以看出MoGH3-3具有荚膜结构2.2荚膜多糖schiff染色图2 A为粗提的MoGH3-3荚膜多糖schiff染色结果。由此初步判断荚膜多糖的分布在6 5ku以上，可使用50 ku超滤管进行UF/DF。图2 B为纯化后稀释至1mg/mL的MoGH3-3荚膜多糖schiff染色结果，可以看出精制荚膜多糖主要分布在90 ku以上。2.3荚膜多糖纯度分析2.3.1英膜多糖含量分析荚膜多糖标准曲线线性方程y=5.2512x十0.0 8 0 9,R=0.9878。经计算，得出粗提的荚膜多糖浓度为6.8 g/L,共得到12.2 4mg，纯化后的荚膜多糖浓度为2 6.5g/L,共得到9.8 mg。44第54卷中国兽医科学500nm图1透射电镜观察MoGH3-3株的英膜Figure 1 Capsules of Mo GH3-3 strain were observed bytransmission electron microscopeBM34AM12200ku200ku140ku140ku1811ku9oku65ku65ku55ku55ku40ku40 ku32ku32ku20ku20ku15ku图2 MoGH3-3英膜多糖超滤浓缩Figure 2Capsular polysaccharides of Mo GH3-3 strain byultrafiltrationandconcentrationA：粗提产物超滤浓缩；M：蛋白maker;1：粗提产物超滤流出液；2：粗提产物超滤浓缩液。B：纯化产物超滤浓缩；M：蛋白maker;3：纯化产物超滤浓缩液；4：纯化产物超滤流出液。A:Crude extraction products of capsular polysaccharides;M:ProteinMarker;1:Effluents of crude extraction products post-ultrafiltration;2:Crude products of capsular polysaccharides by ultrafiltration concen-trate.B:Purification products of capsular polysaccharides;M:ProteinMarker;3:Purification products of capsular polysaccharides by ultrafil-tration concentration;4:Efluents of purification products post-ultrafil-tration.2.3.2英膜多糖中蛋白质浓度分析以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光光度值为纵坐标，得到蛋白含量标准线方程，根据线性回归方程y=0.8983x十0.1534,R=0.9984,粗提的荚膜多糖中蛋白质浓度为3.44g/L，根据线性回归方程y=0.9879x十0.1198，R=0.9943得到纯化后多糖中杂蛋白的浓度为1.12g/L。由此可知,经纯化后的荚膜多糖中蛋白含量较低。2.3.3膜多糖中核酸浓度分析使用超微量紫外分光光度计测定MoGH3-3荚膜多糖中核酸含量。从图4可以看出，经粗提后的荚膜多糖在紫外波长260nm和2 8 0 nm处吸光值较低，而在18 0 2 0 0 nm之间有较高的多糖特征吸收峰。这表明粗提的荚膜多0.450.40y=5.25 12x+0.080 90.35R2=0.98780.300.250.200.150.100.050.000.000.010.020.030.040.050.060.07葡萄糖浓度/(mgmL-)Glucose concentrations图3葡萄糖浓度标准曲线Figure3Standard curve of glucose concentrations0.050.000.000.010.020.030.040.050.060.07葡萄糖浓度/(mgmL-)Clucose concentrations图3葡萄糖浓度标准曲线Figure 3 Standard curve of glucose concentrations5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0200300400500600700800900波长/nmWavelength图4MoGH3-3粗提的英膜多糖紫外扫描Figure4Crude extraction products of capsular polysac-charides of Mo GH3-3 strain by UV scan analysis2.42.22.01.81.61.42.42.22.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20.0200300400500600700800900波长/nmWavelengh图5MoGH3-3纯化后英膜多糖紫外扫描Figure5Purified capsular polysaccharides of Mo GH3-3Strain by UV scan analysis45田彤彤等：绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取纯化及反应原性分析第1期糖中具有一定核酸与蛋白杂质，需进行下一步纯化。从图5可以看出，纯化后的多糖在紫外波长260nm和2 8 0 nm处有微弱吸收峰，而在18 7.6 nm左右有较高的多糖特征吸收峰。这表明纯化后的多糖纯度较高，经过计算可达到95%以上2.4荚膜多糖反应原性分析利用荧光标记和激光共聚焦显微镜观察MoGH3-3荚膜多糖的反应原性。通过一抗、二抗的孵育，DAPI染色后结果如图6 所示，空白组和对照组染色后可在细胞核周围观察到有较强的绿色荧光，而试验组染色后，细胞核附近绿色荧光强度减弱，说明荚膜多糖拮抗了Mo与抗血清的结合，导致Mo与抗血清结合变少。这表明MoGH3-3荚膜多糖具有良好的反应原性2.5三螺旋结构分析刚果红是一种酸性染料，具有三股螺旋链结构的多糖可与其在弱碱存在时形成络合物，络合物的最大吸收波长同刚果红相比会发生红移，且随着NaOH溶液浓度的升高，多糖的三股螺旋结构会出现解旋。MoGH3-3荚膜多糖的刚果红试验结果如图7 所示,NaOH溶液浓度在0 0.5mol/L区间中，多糖与刚果红形成络合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移；在NaOH浓度为0.1mol/L时波长达到最大值。此后,随着NaOH溶液浓度的升高，最大吸收波长下降，说明多糖的三股螺旋结构开始解旋。结果说明MoGH3-3荚膜多糖具有三螺旋结构。3讨论Mo是致使绵羊和山羊患支原体性肺炎的主要病原之一。该病原广泛分布于全世界，在我国各地均有报道，给羊养殖业造成了严重损失。因此，有效监测和防控Mo的传播一直是养羊业的难题。目前，人类医学界广泛使用多种多糖结合疫苗来防治疾DAPIFITCMergeAcid hydrolyzedcapsularpolysaccharideBlank controlMoGH3-3capsularpolysaccharide图6 MoGH3-3英膜多糖的反应原性Figure 6 Reactivity analysis of capsular polysaccharides of Mo GH3-3 strain46第54卷中国兽医科学5207515刚果红congo-red刚果红+多糖 congo-red+polsaccharide510505uu/500XELI4954904854800.00.10.20.30.40.50.6NaOH 浓度/(mol.-1)NaOH concentration图7刚果红试验Figure7Congo-red test病,且取得良好的效果13。与传统疫苗相比,荚膜多糖相关疫苗具有多种优势，例如成分单一，不易引发免疫副反应。此外，荚膜多糖也可用于疾病诊断试剂的研制。March等10 的试验结果表明,荚膜多糖是山羊支原体山羊肺炎亚种乳胶凝集试验中的主要抗原成分。本实验室开发的间接血凝试剂盒利用了山羊支原体山羊肺炎亚种的荚膜多糖，是我国唯一的Mccp鉴别诊断试剂14。Campanero等15 最新开发的肺炎链球菌CPS微阵列具有使用少量CPS和血清即可同时分析多种样本血清抗体的优势。目前，观察抗原和抗体结合常采用免疫荧光的方法。我们的试验通过使用荚膜多糖拮抗特异性血清的思路,确定了Mo GH3-3的荚膜多糖具有良好的反应原性,为利用MoGH3-3荚膜多糖研制多糖结合疫苗或诊断试剂用于绵羊肺炎支原体感染的防控和监测提供了试验数据。疫苗制备中的多糖佐剂备受关注，成为疫苗佐剂发展的新趋势。文献报道显示，多糖作为疫苗佐剂不仅能促进抗原特异性免疫系统,还能增强机体的自然免疫功能16 。研究表明芦蒿多糖作为疫苗佐剂是有效且安全的17 。武增帅等18 也证明了肺炎克雷伯菌的荚膜多糖具有良好的免疫佐剂效果。刚果红试验是常用于鉴定多糖三螺旋结构的方法，具有三螺旋结构的多糖通常具有良好的生物活性，可用作疫苗佐剂。本研究应用刚果红试验验证了MoGH3-3荚膜多糖具有三螺旋结构。但Mo GH3-3的荚膜多糖作为疫苗佐剂还需要进一步具体验证。多糖的提取方法包括水提醇沉法、酸碱提取法、超声波提取法、微波提取法和酶提取法。其中，水提醇沉法是最常用的方法，该方法一般通过乙醇沉淀来纯化多糖，成本控制良好，适合大规模生产需要常用的多糖除蛋白方法包括Sevag法、三氯乙酸法（T CA）、三氟三氯乙烷法、盐析法、热酚法和酶解法等。本研究采用水提醇沉法提取荚膜多糖，利用热酚法和酶解法除去杂蛋白和核酸，最后通过超滤管浓缩置换。这一试验步骤简便、成本低廉，成功开发了一种适合生产实践中制备MoGH3-3荚膜多糖的提取方案。4结论本研究成功从1L培养液中用水提醇沉的方法提取了12.2 4mg粗荚膜多糖，纯化后得到了9.8 mg的荚膜多糖，验证了其具有良好的反应原性，并通过刚果红试验证明了其具有三螺旋结构，为今后绵羊肺炎支原体诊断试剂和疫苗的研发提供了试验室数据。参考文献(References):1MACKAY J,NISBET D,FOGGIE A.Isolation of pleurop-neumonia-like organisms(Genus Mycoplasma)from caseof Sheep Pulmonary adenomatosis(SPA)J.The Vet-erinary Record,1963,75(21):550-551.2CARMICHAEL L E,ST GEORGE T D,SULLIVAN N D,et al.Isolation,propagation,and characterization stud-ies of an Ovine Mycoplasma responsible for prolif-erative interstitial pneumoniaJ.Cornell Veteri-narian,1972,62(4):654-679.3MANLOVE K,BRANAN M,BAKER K,et al.Risk factors andproductivity losses associated with Mycoplasmaovipneumoniae infection in United States domesticsheep operations J.Preventive Veterinary 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