基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试方法研究.doc

CHANGCHUN INSTITUTEOF TECHNOLOGY基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试方法研究Porphyrin fluorescence enhancement of micro-organisms in the water toxicity testing论文题目：基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试方法研究学生姓名：学院名称：理学院专业名称：应用化学班级名称：学 号：指导教师：教师职称：完成时间：摘要本论文研究的是基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试方法，其总毒性的检测原理是对比健康的微生物代谢物和受损的微生物代谢物分别与卟啉作用后荧光所增强的程度。通过改变微生物的浓度、反应时间和毒性物DCP的浓度来进一步优化实验条件，以便后期的实验操作更加简便易行。从而得到了预期的实验现象，有毒性物质的微生物代谢物与卟啉的荧光作用比无毒性物质的微生物代谢物与卟啉的荧光作用增强的程度大些。这样的实验结果证明了该方法可以用于检测微生物水体总毒性。关键词卟啉 毒性物质 微生物代谢物 AbstractIn this work,the thesis is based on the porphyrin fluorescence enhancement of the total microbial water toxicity testing methods.And the principle of the total toxicity detection is to compare the health of microbial metabolites and microbial metabolites which were damaged and the role of porphyrin fluorescence after the enhancement level. By changing the concentration of microorganisms, reaction time and the concentration of toxicant DCP, we can further optimize the experimental conditions in order to more easyof experimental operation in the future. To obtain the desired experimental phenomena, toxic substances and microbial metabolites of porphyrin fluorescence effects more eminent than non-toxic substances microbial metabolites and the enhanced role of porphyrin fluorescence bigger extent. Such experimental results show that the method can be used to detect total microbiological water toxicity.Keyword：Porphyrin Toxicants Microbial metabolites1 前言11.1水环境污染的介绍11.2 水污染的检测意义11.3 水污染的评价指标21.3.1理化指标21.3.2生物毒性指标21.4 水体总毒性的评价方法31.4.1 毒性在化学方面的评价方法31.4.2 毒性在生物方面的评价方法31.5 微生物毒性检测方法31.6 本论文的研究内容和意义42 实验部分52.1 化学物质52.2 仪器62.3 实验内容72.3.1 微生物培养72.3.2 卟啉的荧光增强比较测定有毒化学物质72.4 结果和讨论82.4.1 原理82.4.2 DNA的选用对毒性测试的影响92.4.3 卟啉自身性质对毒性测试的影响142.4.4 对实验条件进行优化172.4.5 毒性物质DCP的浓度对实验的影响18参考文献18致谢211前言1.1水环境污染的介绍我们所生存的环境中最重要的组成物质是水，它也是自然界中最活跃的要素，它参与自然界中一系列生物的、物理的和化学的反应过程。在这个庞大的自然水资源系统中，我们不断地开采水资源，在利用之后通过大气降水对其进行补给。在不断地开采、利用、补给和消耗、恢复的循环中，水可以供给人类的利用和满足生态平衡的需要。曾经在某种意义上，人们认为水资源是取之不尽，用之不竭的，但实际上我们全球的淡水资源的储蓄是非常有限的。尽管地球表面71%是呗水覆盖着的，但其中有3/5是集中在海洋里，是非直接可利用的资源。此外，随着人们肆意的使用仅有的可直接利用的水资源，水正遭受着质量不断下降的厄运，譬如化工厂中排放出的化学物质对水造成的污染，使得水资源短缺的情况更加的严重。水环境污染是指水体中的污染物在数量上大幅度的增加，超过了水体的自净能力，破坏了水体中各种成分之间的平衡关系，从而导致水体发生了物理的、化学的不良变化，且此时的水体使用价值已经被迫降低1。这些污染物质绝大多数来自生活中的污水和造纸、煤矿、印染等工业废水，其成份主要包括多环芳烃、多氯联苯(PCB)等有机物和重金属污染物。当污染很严重时，则会破坏水体的生态系统的平衡2。水体污染达到一定程度后，除了直接影响水生生物的正常生活外，也直接或间接地威胁人类的健康和生产活动。目前，我国有1/3的河段，75%的主要湖泊，25%的沿海水域目前正遭受严重污染，我国七大水系中有26%是五类和劣五类水，9 大湖泊中有7 个是五类和劣五类水，主要湖泊、近岸海域及部分地区的地下水受到不同程度的污染4。我国每天有多达3亿人饮用遭到污染的水，每年有1.9亿人受到与水有关的疾病的折磨，水污染导致每年近3万名儿童死于腹泻。可见，目前我国的水环境污染已经很严重了。1.2 水污染的检测意义近几年来，我国有些地区接二连三的发生了很多次重大的突发性水污染事件，这样的事件不仅给人们带来了巨大的经济损失，还给社会带来了很多不安定因素来源以及给生态环境带来了严重性的破坏。然而这些问题已经引起了科研工作者和水资源及环境专业的高度重视，并且这样的问题也成了人们最关心的。在水资源保护领域中，水体检测作为判断和预测水污染发展的重要技术方法，也是分析和评价水环境质量的重要指标。而这种水污染的检测的重要意义在于不仅可以了解到水体中污染物质的原始来源以及其会分布的绝大多数范围等，还可以评估出这些污染物质在未来的污染变化趋势。此外，这种检测还能够作为环境保护措施的性能评价标准，为今后的防御工作提供了有效的参考数据。众所周知，越来越复杂的环境问题成了困扰我们健康生活的难题之一，并且危害我们健康的化学物质有上万种。除了水体中某些单一的毒性物质，很多物质在相互作用之后会产生巨大的毒性，因而，对水体总毒性的检测技术以及相应的措施已经成为科研工作者及环境保护专家重点研究的项目。1.3水污染的评价指标1.3.1理化指标水体评价的理化指标主要是指反映水体中难降解有机物含量的指标，包括生物需氧量(BOD)、化学需氧量(COD)、总有机碳(TOC)、色度等，以及对水体中痕量有机污染物的测定。前者是传统的水处理工艺常规评价指标，后者对仪器及检测方法要求较高，要求仪器必须具有高灵敏度和低检测限，高的专一性和精确度。目前在对有机污染物的分析方面主要是采用高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)以及色质联用技术(GC/MS，LC/MS)进行分析和分离3,4。特别需要强调的是：传统的理化指标虽然能准确定量水体中主要污染物的含量，但是由于大多数微量有毒污染物没有环境标准，同时可能存在更大的毒性或毒性特征不同的中间体，所以传统的理化指标不能直接和全面的反映各种有毒物质对环境的综合影响5,6。1.3.2生物毒性指标为了弥补传统理化指标在评价水体污染方面的不足，近年来，研究者们采用不同的生物作为指示生物来评价水体的生物毒性，从而反映水体毒性的大小，并定为水体生物毒性指标。水体生物毒性指标反映的是复杂水体体系中所有有毒组分的综合作用，包括各组分之间可能存在的加合作用、拮抗作用或协同作用7。在评价水体生物毒性指标方面，我们应该选择合适的生物测试方法或者结合使用化学分析方法，这样才能够合理和有效的预测水体复杂体系对生态系统的毒理效应8。多年的研究与实践证明水体生态系统的变化能够准确反映水质的变化，生态系统的变化包括：种群的改变，生物体个体的变化，生物体体内器官的病变，生物体内细胞的变化9-11，因此对水体生物毒性指标的评价十分适合污染物含量低、成分复杂、化学稳定性差的天然水体。生物毒性指标的评价属于广谱分析方法，它忽略了受污水体的具体成分组成，但却可以对复杂水体中污染物成分和浓度的变化及交互影响做出综合性评价，并且可以直观的反应甚至预测污染物对生物体的影响，弥补了传统的理化学分析方法及仪器分析方法的不足。1.4水体总毒性的评价方法1.4.1 毒性在化学方面的评价方法通常，水体总毒性在化学方面的评价也可以说成是用分析仪器检测水体中的毒性。依据毒性物质浓度的控制标准，我们主要是对水体中毒性物质的种类，浓度以及其他数据进行分析。经常用到的方法可以归为三类：光学分析法、电化学分析法和色谱分析法。但是，由于化学分析方法在水体总毒性的检测中有很多的不足之处12,13且毒性物质的种类比较多，检测到的有毒物只能代表水体被污染的性质，不能预测不同毒性物质之间的相互作用，从而很难分析水体总毒性对我们的危害程度。此外，由于环境条件比较复杂，与有毒污染物共存的其他物质以及环境条件的变化在很大程度上影响了其毒性有效性。因此需要其他方法对其进行分析，包括生物、生态、和毒理学方法等来评价水质。1.4.2 毒性在生物方面的评价方法生物评价基准（Biocriteria）就是利用敏感生物来测试化学污染物的毒性影响。最早很多学者利用鱼类来评价有毒污染物的毒性影响，例如 Hart 利用淡水鱼评价工业废水、化学物质和其它物质的毒性14，Doudoroff 进行了工业废水对鱼的急性毒性生物评价15。而鱼类作为环境原有生物对诸如微囊藻素和贝类毒素等毒物的毒性也较为敏感的性质使其在环境毒素的毒理学研究和监测方面有着巨大的应用潜力16-18。到了 70 年代，生物评价越来越普遍，不但采用鱼，也采用无脊椎动物和藻类等19-22。近年来对生物毒性的研究更加趋向于微观。越来越多的科学家致力于能反映持久性污染物作用本质，并能对污染物早期影响进行检测的指标，试图从分子水平基因调控的深度上去阐明毒物中毒机理，并在此基础上提供相应的防范措施。由此而发展形成了分子毒理学，遗传毒理学等新的监测手段，以对污染物的生物毒性进行快速、早期的预测。1.5微生物毒性检测方法近些年来，以发光菌为代表的微生物毒性试验在国内外得到了广泛的应用。近年来，基于微生物的毒性检测方法受到了广泛的关注。微生物种群数量大、生长周期短、对环境变化的敏感性高，具有与高等动物类似的物理化学特性以及酶作用过程等特点，因而适合开发省时、低耗、无道德争议的生物学毒性测试方法，尤其适合开发小型便携式水体毒性检测设备。在微生物毒性检测方法中，基于微生物发光的检测技术应用最为广泛。目前市场上已经有多种微生物发光毒性检测系统，比如美国AzurEnviromental公司Microtox、Beckman公司的LUMIStox、Merck公司的TOX-Alert、HACH公司的Eclox等。虽然此类毒性检测系统能够快速的对水体毒性进行综合的评价，但是其固有的缺点也十分明显：（1）检测信号易受水体浊度影响；（2）国际标准ISO11348-3使用深海发光细菌V.fischeri 作为受试生物，为了平衡渗透压，测试必须在高盐度条件下进行，可能会引起样品中某些化学品性质的改变。例如，对于低浓度金属样品，盐度校正会导致假阴性的结果；而对于一些溶解度低的样品，如苯酚，则会由于毒物的析出而导致假阳性结果；（3）单一发光细菌的使用难以做到适用于所有毒物。因此，其应用范围受到了很大限制。此外，许多微生物受到毒性物质侵害后，会表现为活性下降、呼吸活性变弱，生理状态发生变化等。基于这个原理，研究者将硝化细菌、硝化细菌富集培养物用于有毒物质的毒性检测，通过测定硝化细菌的呼吸速率的变化来检测废水毒性，测得毒物的EC50值与发光菌法具有较好的相关性，该方法适用于测试城市污水和工业废水的毒害作用，也适用于河道底泥的毒性检测，应用该方法已经成功开发出毒性测试仪23,24,25。1.6本论文的研究内容和意义我们在前期的工作中提出了使用亚甲基蓝和中性红染料为指示剂的水体总毒性微生物光学检测方法26。当有毒性物质存在时，细胞膜的结构被破坏，从而允许更多的染料进入细胞内，通过光学检测剩余染料的浓度即可实现对毒性的检测。毒性物质对细胞膜造成伤害，一方面允许细胞外的物质进入细胞，另一方面也会允许细胞内的物质流出。因此细胞内的流出物可以作为细胞膜破损的标志。钾离子是细胞内普遍存在的无机离子，微生物通过位于原生质膜上的离子通道蛋白Na+，K+-ATP酶的作用将钾离子运输进入细胞内，在细胞内形成高浓度的钾离子27。当细胞膜被毒性物质破坏时，细胞内的钾离子就会流出细胞，导致细胞外的钾离子浓度升高。通过检测钾离子浓度的变化，就可以实现对毒性的检测。到目前为止，还没有人报道过这种毒性测试方法。此外，某些蛋白质，酶等胞内物质也可以在细胞膜破损后流出细胞，因而原则上这些物质都可以作为毒性物质的指示剂。但是，与钾离子相比，它们所需要的细胞膜上的孔洞相对较大28，因而不适合用于低浓度毒性物质或者低毒性物质的检测 29。1998年Periasamy等人系统的研究了卟啉分子与表面活性剂分子之间的相互作用，指出了表面活性剂分子对卟啉荧光的增强机理30。同时，我们也知道微生物的代谢过程会释放出大量的类似表面活性剂的分子，因此可以预见微生物的代谢物溶液可以有效的增强卟啉的荧光。而荧光的增强程度与微生物的代谢物浓度，即微生物的活性有直接的联系。基于这个机理，我们就可以开发出一种新颖的微生物水体总毒性检测方法。2 实验部分2.1 化学物质试剂公司备注氯化钠北京化学试剂公司用来配制培养基蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司用来配制培养基YEAST EXTRACTOXOID有限公司用来配制培养基大肠杆菌中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）4冰箱中保藏KH2PO4北京化学试剂公司用来配制磷酸盐缓冲溶液Na2HPO4北京化学试剂公司用来配制磷酸盐缓冲溶液HCl北京化学试剂公司用来配制磷酸盐缓冲溶液NaOH北京化学试剂公司4冰箱中保藏卟啉（1mmol/L）北京化学试剂公司4冰箱中保藏DCP（10g/L）阿拉丁试剂公司4冰箱中保藏0.2M磷酸盐缓冲溶液（PBS）是自制的。制备方法：将10.88gKH2PO4和42.98gNa2HPO412H2O溶于1000ml的二次水中，添加1MHCl和1MNaOH把PBS的pH值调至7.2.2.2 仪器仪器型号厂家多振幅轨道摇床ZHWY-200B上海智城分析仪器制造有限公司超声波清洗器MW5-065昆山市超声仪器有限公司台式冷冻离心机Centrifuge 5804 REPPENDORF荧光光谱仪FLUOROMAX-4紫外可见分光光度计Cary 500美国瓦里安公司2.3实验内容2.3.1 微生物培养大肠杆菌（DH 5）的最适培养基和培养温度均是参照CGMCC和上海智城分析仪器制造有限公司说明书设定的。所用的微生物均在转速为190rpm的摇床中培养。15下离心5分钟，转速5000rpm，用1%NaCl洗涤两次。然后用1%NaCl将微生物制备成悬浮液保存于常温的环境中，所用的微生物都是当天使用，不能过夜。2.3.2 卟啉的荧光增强比较测定有毒化学物质把微生物用磷酸缓冲溶液（PBS）稀释到所需的OD值，再用紫外可见近红外扫描分光光度计测量微生物OD值，其波长选在600nm。所用的有毒物质（10ppmDCP）都是在实验初期事先配制好的，使用时用二次水将其稀释至实验所需的浓度值。在实验中，样品包含400ul微生物悬浮液，100ul有毒化学物质和500ul PBS。同时，空白样和实验样品添加的其他物质都用PBS来补充，所有的填补都是相同的。样品在有铝箔包裹下放入多振幅轨道摇床摇晃60分钟，然后取出离心得到上层清液。这时的样品中包含500ul上层清液，400ul PBS和100ul卟啉，测定各个试样的荧光光谱图并进行对比。而毒性检测的原理是对比健康的微生物细胞和受到毒性物质损害的细胞对卟啉荧光增强的峰值的差异。这样的分析方法是测定上层清液中微生物代谢物的浓度与卟啉的荧光作用，使得实验操作起来比较简便，同时也简化了实验过程。依据这个原理，毒性的大小是可以通过毒性物质对微生物释放的钾离子的抑制率来进行检测，计算公式为Inhibition Ratio（%）（1）100%A 是在有毒性物质的环境中培养的微生物后，上层清液的微生物代谢物与卟啉在621nm处的荧光峰值与在636nm处的荧光峰值的比值；B是在没有有毒性物质的环境中培养的微生物后，上层清液的微生物代谢物与卟啉在621nm处的荧光峰值与在636nm处的荧光峰值的比值；C是空白样（没有摇床的微生物代谢物与卟啉）在621nm处的荧光峰值与在636nm处的荧光峰值的比值。注：每个样品都做两个平行样，故计算时要取其平均值。2.4结果和讨论2.4.1 原理图1是本论文基于微生物的代谢物对卟啉荧光的增强作用原理进行检测。当有毒性物质存在的时候，微生物的细胞膜受到抑制，使其释放出来的钾离子减少，从而测得的荧光现象逐渐减弱。通过对比荧光现象的峰高，就可以实现对毒性物质的检测。由于3，5-二氯苯酚（DCP）的毒性较小、价格便宜、容易用荧光仪检测，所以本实验选用DCP。此外，实验最终现象是无毒性物质的荧光增强作用要比有毒性物质的高。 : 0.2M PBS ：microorganisms图1 基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试原理图1的实验过程如下：（1）EColi/ulDCP/PBS/ulPBS/ul总量/ml4001005001（2）上层清液/ulPBS/ul卟啉/ul总量/ml5004001001注：在步骤（1）完成后要在摇床中培养60分钟后取出离心得到上层清液。 在步骤（2）中，没有加卟啉之前要静置60分钟，使得样品中的各种反应进行完全，以便得到更加稳定的作用。2.4.2 DNA的选用对毒性测试的影响由于卟啉与DNA的相互作用会导致荧光光谱性质发生变化，为了使得实验的测试结果荧光增强比较显著，则实验初期要考虑是否使用DNA。图2-A 和图4-B是两种不同的DNA，图2-B中的DNA是实验初期一直使用的。在实验操作和其他条件都相信的情况下，只改变DNA的种类，但出现的荧光增强现象是不同的。很明显，图2-A中的荧光增强现象比较混乱，没有一定的规律；而图2-B中的荧光增强现象与实验最终结果一致，表明：DCP会抑制微生物释放钾离子，从而荧光现象会降低。因此，依据图2-B的荧光增强现象，则选用Add 280ulH2ODNA可以稳定实验现象。在实验过程设计完成后，我们需要改变实验过程中的单一变化条件（改变微生物的浓度和反应时间），以便得到优化的实验条件，如图2-C、D、E、F和G。由图2-C和2-D我们可以看出，证实了选用DNA得到的荧光现象要比没有选用DNA得到的荧光现象稳定些。并且由图2-D的实验数据显示，OD24的灵敏度是最高的，这也使得我们的实验中微生物的浓度得到了优化。然而反应时间的改变使得实验现象与我们得到的结论是完全不一致的，如图2-E、F和G。此外，值得一提的是，选用DNA是因为其可以增强卟啉的荧光作用。但是在实验过程中我们发现，有无微生物代谢物都可以增强卟啉的荧光作用，如图2-H。因而，我们考虑选用DNA是多余的，并且是否选用DNA都会出现紊乱的实验现象，稳定性不想理想中的，故最后我们没有选用DNA。A图2-A DNA（Add 200ul H2O）/卟啉复合物的荧光光谱图B图2-B DNA（Add 200ul H2O）/卟啉复合物的荧光光谱图C图2-C 不加DNA时不同浓度微生物代谢物与卟啉复合物的荧光光谱图D图2-D 加入DNA时不同浓度微生物代谢物与卟啉复合物的荧光光谱图 OD值波长81624630nm38.69%64.85%70.87%680nm49.86%53.45%47.45%图2-D 加入DNA时不同浓度微生物代谢物与卟啉复合物的荧光毒性灵敏度E图2-E 摇床时间为30min时DNA/卟啉复合物的荧光光谱图F图2-F 摇床时间为60min时DNA/卟啉复合物的荧光光谱图G图2-G 摇床时间为120min时DNA/卟啉复合物的荧光光谱图H图2-H 有无微生物代谢物与卟啉复合物的荧光光谱图2.4.3 卟啉自身性质对毒性测试的影响据相关文献显示，氧气会对卟啉产生影响。从而在实验的过程中，我们应该考虑用吹氮气的方法来考察卟啉自身的性质对实验的影响。如图3-A是新稀释的已经配置好的卟啉，用荧光仪检测其每隔4分钟的荧光光谱现象。然而，随着时间的增长，新稀释的卟啉的荧光性质表现为，先快速下降而后趋于稳定。图3-B是图3-A的对照组，在把新稀释的卟啉吹氮20分钟之后，每隔4分钟检测一次此时卟啉的荧光光谱图。然而，如图3-B所示，随着时间的增长，吹氮后的卟啉荧光性质表现得极为稳定。从而，对比图3-A和3-B，则可以排除氧气对卟啉的影响。如图2-E，F和G为不同摇床时间加入新稀释的卟啉的荧光光谱图，然而实验的结果则是紊乱的；而图3-C，D和E 是在不同摇床时间加入放置一段时间后的卟啉的荧光光谱图，显然实验结果与之前的（无毒的微生物代谢物与卟啉的荧光增强现象要比有毒的高）是一致的。从而说明，卟啉的使用必须是在放置一段时间之后才可以使用，否则会影响实验结果。A图3-A 新稀释的卟啉随放置时间的变化B图3-B 吹氮后的新稀释卟啉随时间的变化C图3-C 摇床时间为30min时放置一夜的卟啉复合物荧光光谱图D图3-D 摇床时间为60min时放置一夜的卟啉复合物的荧光光谱图E图3-E 摇床时间为120min时放置一夜的卟啉复合物的荧光光谱图2.4.4 对实验条件进行优化由2.4.2和2.4.3分别对实验过程进行了优化和排除可能干扰实验结果的因素后，我们通过改变微生物的浓度和反应时间来进一步优化实验条件。而微生物的浓度，我们选用的是OD值分别为8，16和24的微生物；对于反应时间，我们选用的是摇床时间分别为30分钟，60分钟和120分钟，实验结果如图4。 OD值时间/min 81624300.16440.14250.0733600.24250.08170.05891200.13500.09620.0591图4 不同微生物浓度和反应时间下测得毒性物质对微生物代谢物的抑制率由图4可得，最为理想的实验条件是OD值为8和反应时间为60分钟。2.4.5 毒性物质DCP的浓度对实验的影响加入毒性物质DCP可以破坏微生物的细胞，但会抑制细胞释放钾离子的数量。然而，不同浓度的DCP对微生物细胞的抑制作用是不同的，因而我们需要考察100ppm，50ppm，25ppm,12.5ppm,6.25ppm,3.125ppm,1.56ppm和0.78ppm八组不同浓度的DCP对微生物代谢物和卟啉作用所产生的影响。参考文献1. 赵桂廷, 赵倩, 杨欣. 我国水污染概况及解决措施J. 现代农业科技, 2011, 12: 273-2792. 王金梅, 丁颖. 环境保护概论M. 北京: 高等教育出版社, 20063. 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