牛溶血性曼氏杆菌对BT细胞炎症因子及其TLR4_NF-κB信号通路影响的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45，No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303026牛溶血性曼氏杆菌对BT细胞炎症因子及其TLR4/NF-资B信号通路影响的研究谢艺萌1,2，刘珊珊1,2，苏思雨1,2，蒋鹏轩1，张年洁1，张泽财1,2，王新1,2*，朱战波1,2*(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省牛病防控工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319)摘要：为探究牛溶血性曼氏杆菌(Mh)感染新生牛鼻甲(BT)细胞是否发生炎症反应及其涉及的信号通路，本研究将不同浓度的Mh分别感染BT细胞后经MTT法检测Mh对BT细胞的毒性作用，确定合适的感染浓度。结果显示，与空白对照细胞相比，以终浓度1伊104cfu/mL、1伊105cfu/mL的Mh感染后BT细胞的存活率均在80%以上；以浓度1伊106cfu/mL的Mh感染BT细胞后的细胞存活率在60%70%，以终浓度1伊107cfu/mL的Mh感染BT细胞后的细胞存活率在50%以下；因此确定终浓度1伊106cfu/mL为Mh的最适感染浓度。将Mh以终浓度1伊106cfu/mL感染BT细胞后，采用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中细胞因子(IL-1茁、IL-6及TNF-琢)mRNA的转录水平；采用间接ELISA检测细胞上清中上述各细胞因子的分泌水平；通过western blot检测BT细胞中TLR4/NF-资B通路中Toll样受体4(TLR4)、p-P65、磷酸化NF-资B抑制蛋白(p-I资B琢)的表达水平。qPCR和间接ELISA结果显示，Mh感染的BT细胞中促炎因子IL-6、IL-1茁、TNF-琢 mRNA转录水平及蛋白分泌水平均极显著高于空白对照细胞(0.001)。Western blot结果显示，与空白对照组相比，Mh感染的BT细胞中TLR4、p-P65蛋白的表达水平显著升高(0.05)，p-I资B琢蛋白的表达水平极显著降低(0.01)。本研究首次表明，Mh感染诱导BT细胞发生了炎症反应，并且该炎症反应是通过激活TLR4/NF-资B信号通路及其相关蛋白的表达实现的。本研究为Mh发病机制的研究及其所致疾病的防治提供参考依据。关键词：牛溶血性曼氏杆菌；NF-资B信号通路；炎症细胞因子；新生牛鼻甲细胞中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)10-1061-05Effects of bovineon cytokines and itsTLR4/NF-资B signaling pathway in BT cellsXIE Yi-meng1,2,LIU Shan-shan1,2,SU Si-yu1,2,JIANG Peng-xuan1,ZHANG Nian-jie1,ZHANG Ze-cai1,2,WANG Xin1,2*,ZHU Zhan-bo1,2*(1.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.Heilongjiang Engineering Research Center of Bovine Disease Prevention and Control,Daqing 163319,China)Abstract:To investigate whether there is an inflammatory response and the signaling pathways involved in the infection ofneonatal bovine nasal turbinate(BT)cells with bovine(Mh),the toxic effects of Mh on BT cells weredetected by MTT assay after BT cells were infected with different concentrations of Mh,and the appropriate infection收稿日期：2023-03-21基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD13B03-1)；黑龙江省农垦总局“十三五”重点科技计划项目(HNK135-04-03)作者简介：谢艺萌(1996-)，女，黑龙江黑河人，硕士，主要从事兽医药理与毒理学研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorconcentration was determined.The results showed that compared to the blank control BT cells,the survival rate of BT cells wasmore than 80%after infection with Mh at 1伊104cfu/mL and 1伊105cfu/mL,the survival rate of BT cells after infection with Mh at1伊106cfu/mL was 60%-70%,and the survival rate of BT cells infected with Mh at 1伊107cfu/mL was less than 50%.So 1伊106cfu/mLwas determined as the optimal infection concentration of Mh.After infected with Mh at 1伊106cfu/mL,the transcription levels ofcytokine(IL-1茁,IL-6 and TNF-琢)mRNA in BT cells were detected by fluorescence quantitative PCR(qPCR),the secretion levelsof cytokines in cell supernatants were measured by indirect ELISA,and the expression levels of Toll-like receptor 4(TLR4),p-P65,and phosphorylated NF-资B inhibitory protein(p-I资B琢)in TLR4/NF-资B pathway of BT cells were examined by westernblot.The results of qPCR and indirect ELISA showed that the mRNA transcription and protein secretion levels of pro-inflammatorycytokines IL-6,IL-1茁 and TNF-琢 in Mh-infected BT cells were extremely significantly higher than those in the blank control cells(0.001).Western blot results showed that,compared with the blank control group,the expression levels of TLR4 and p-P65protein significantly increased(0.05)and the level of p-I资B琢 protein extremely significantly decreased(0.01)in Mh-infectedBT cells.This research indicated for the first time that Mh infection induces an inflammatory response in BT cells and thisresponse is achieved by activating TLR4/NF-资B signaling pathway and its associated proteins expression.This study provides areference basis for the study of the pathogenesis of Mh and the prevention and treatment of related diseases.Key words:;NF-资B pathway;inflammatory cytokine;neonatal bovine turbinate cell牛溶血性曼氏杆菌(，Mh)是引发犊牛呼吸道感染的重要病原菌之一。2006年周玉龙等在我国内蒙古地区的奶牛病料样品中分离出该菌，这是国内首次发现这一病原菌1。其感染过程中常伴有炎症因子的持续产生，该病原菌的感染率、发病率及死亡率均较高，并且随着频繁的奶牛交易，为病原菌的传播创造了条件，给全球养牛业造成了严重的经济损失2-3。Mh可产生多种毒力因子，如脂多糖(LPS)、白细胞毒素和鞭毛蛋白等，它们在牛支气管肺炎的发病过程中发挥重要作用4-6。研究表明，Mh可通过Toll样受体(TRL)介导并激活宿主细胞多条炎症相关的信号通路，其中包括NF-资B信号通路7，从而诱导宿主发生炎症反应，使机体内炎症因子的含量发生变化8-9。通常使用犊牛支气管上皮细胞分离培养Mh，并且已有研究证实Mh能够激活犊牛支气管上皮细胞Toll样受体4(TRL4)介导的NF-资B信号通路对细胞造成炎症损伤10。然而犊牛支气管上皮细胞属于犊牛体内分离培养的原代细胞，分离培养过程相对困难，并且对传代次数也有严格限制。而牛鼻甲骨(Bovineturbinate，BT)细胞是新生牛的鼻甲细胞，培养条件相对简单，还可以传代，并且将BT细胞作为体外感染对象更接近Mh临床感染首先在牛鼻咽部增殖的特征2。为了研究Mh感染BT细胞是否引起炎症反应及对其NF-资B信号通路的影响及诱导细胞炎症反应的机制，本研究将Mh感染BT细胞，通过检测该细胞中细胞因子的转录与分泌水平，以及NF-资B信号通路相关蛋白的表达水平。为深入了解Mh的发病机制的研究提供新思路。1材料与方法1.1主要实验材料BT细胞和Mh由黑龙江八一农垦大学牛病防治工程技术中心实验室保存；DMEM培养基购自Gibco公司；脑心浸出液肉汤(BHI)购自海博生物技术有限公司；牛白细胞介素I茁(IL-茁)、牛IL-6、牛肿瘤坏死因子琢(TNF-琢)ELISA试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；兔源TLR4、p-P65、磷酸化的NF-资B抑制蛋白(p-I资B琢)、茁-actin多克隆抗体(pAb)均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG(IgG-HRP)购自北京中杉金桥生物技术有限公司1.2不同浓度Mh感染后BT细胞活性的MTT法检测将不同终浓度的Mh(1伊104cfu/mL1伊107cfu/mL)感染96孔细胞板中的BT细胞，每组重复5个孔，37、5%CO2培养24 h后，每孔加入10 滋L MTT 溶液(5 mg/mL，即 0.5%MTT)，继续培养4 h。弃液，每孔加入100 滋L DMSO，置低速摇床振荡10 min，测OD490nm值。设只加100 滋L DMSO的5个孔作为阴性对照组，设不加Mh的BT细胞作为空白对照组。根据所测OD490nm值计算细胞存活率，公式如下：细胞存活率=(Mh感染组OD490nm值-阴性对照组OD490nm值)/中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1062(空白对照组OD490nm值-阴性对照组OD490nm值)伊100%。1.3Mh感染后BT细胞中细胞因子IL-1茁、IL-6、TNF-琢 mRNA转录水平的荧光定量PCR(qPCR)检测及分泌水平的间接ELISA检测各细胞因子基因扩增的qPCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成(表1)。根据1.2结果，以终浓度1伊106cfu/mL的Mh感染BT细胞，设未感染的BT细胞为空白对照。37、5%CO2培养24 h后，收集细胞上清用于后续试验；细胞用PBS冲洗2次，0.25%胰酶消化后3 000 r/min离心收集细胞沉淀，采用TRIzol法提取各组细胞的RNA，反转录为cDNA作为模板，采 用表1中 的 引 物 经 qPCR检 测 细 胞 中 促 炎 因 子IL-1茁、IL-6、TNF-琢 mRNA的转录水平，以GAPDH作为内参，采用2-驻驻Ct法计算各细胞因子的相对转录水平；收集的细胞上清液4、1 000 r/min离心10 min后取上清，采用相应ELISA试剂盒检测各组血细胞上清液中IL-6、IL-1茁、TNF-琢的分泌水平。1.4Mh感染BT细胞中TLR4/NF-资B通路相关蛋白表达水平的western blot检测将1.3中收获的细胞，加入80 滋L RIPA(已加入 PMSF)在冰上裂解30 min，4、12 000 r/min离心10 min。吸取上清经SDS-PAGE电泳后，分别以兔源TLR4 pAb(1颐1 000)、兔源p-P65 pAb(1颐1 000)、兔源p-I资B琢 pAb(1颐1 000)、兔源茁-actin pAb(1颐5 000)为一抗，以羊抗兔IgG-HRP(1颐8 000)为二抗，采用western blot检测各蛋白的表达，并采用Image J 软件经灰度值分析并作图。1.5数据的统计与分析使用SPSS软件处理分析各组实验数据，采用Graphpad Prism 9.0软件绘图，并 采 用 SPSS 软 件 中 的 单 因 素 方 差 分 析(One-wayANOVA)各组实验数据的差异性，其中 0.05具有统 计 学 意 义，*：0.05；*：0.01；*：0.001均为差异极显著；ns为差异不显著。2结果2.1不同浓度Mh感染后BT细胞活性的MTT法检测结果分别以不同浓度的Mh感染BT细胞24 h后通过MTT法检测不同浓度Mh对BT细胞活性的影响。结果显示，当以1伊104cfu/mL、1伊105cfu/mL终浓度的Mh感染时，BT细胞的存活率与空白对照组细胞的存活率相当，均在80%以上；当以1伊106cfu/mL终浓度的Mh感染时，BT细胞的存活率为空白对照组细胞存活率的60%70%；当以1伊107cfu/mL终浓度的Mh感染时，BT细胞的存活率为空白对照组细胞的50%以下。细胞存活率与细菌感染浓度呈正相关，虽然终浓度1伊104cfu/mL、1伊105cfu/mL也能对细胞致死并且造成一定的损伤，但致死率不高造成的损伤也小；当以终浓度1伊107cfu/mL的Mh感染细胞的致死率太高，无法进行后续试验；而终浓度1伊106cfu/mL的Mh感染后BT细胞的存活率为空白对照组细胞的60%70%，并且差异极显著(0.001)(图1)，此时该浓度的细菌能对细胞造成的致死率和损伤正合适，因此本实验选用该浓度作为后续Mh的感染浓度。2.2Mh感染BT细胞后细胞因子mRNA转录水平的qPCR和分泌水平的间接ELISA检测结果将经Mh感染24 h后的各组BT细胞采用qPCR检测细胞因子IL-1茁、IL-6、TNF-琢 mRNA的转录水平；采用采用间接ELISA检测各组细胞上清中上述各细胞因子的分泌水平。结果显示，与空白对照细胞相比，Mh感染细胞中细胞因子IL-1茁、IL-6、TNF-琢 mRNA的转录水平及各组细胞上清中的上述细胞因子的分泌水平均极显著升高(0.001)(图2)。表明Mh感染能够极显著上调BT细胞中细胞因子IL-1茁、IL-6、TNF-琢表1qPCR引物序列引物名称Primer namesBovine IL-I茁FBovine IL-I茁RBovine TNF-琢FBovine TNF-琢RBovine IL-6 FBovine IL-6 RBovine-GAPDH FBovine-GAPDH R引物序列(5-3)Primer sequence(5-3)CTCCGACGAGTTTCTGTGTGACGGAGAGGAGGTGGAGAGCCTTCAGGCTGACGGGCTTTACCTCATCTACGGCTCTTGATGGCAGACAGGATGCCACTGCTGGTCTTCTGGAGTGTTTGTGGCTGGAGTGGTTAGCCGCATCCCTGAGACAAGATGCCGTGGGTGGAATCATACTGGA扩增片段大小(bp)Product length(bp)2525262220201825注：与空白组相比，*：0.05；*：0.01；*：0.001，下同。Note:*:0.05;*:0.01;*:0.001 vs the control group.The same as below.图1不同浓度Mh对BT细胞存活率的检测结果谢艺萌，等.牛溶血性曼氏杆菌对 BT 细胞炎症因子及其 TLR4/NF-资B 信号通路影响的研究第 10 期10631501005001伊1071伊1061伊1051伊1040Mh(cfu/mL)*mRNA的转录及其表达的水平。2.3Mh感染的BT细胞中TLR4/NF-资B通路相关蛋白表达水平的western blot检测结果采用westernblot检测Mh感染后BT细胞中TLR4/NF-资B信号通路中TLR4、p-P65、p-I资B琢蛋白的表达水平，结果显示，与空白对照组相比，Mh感染的BT细胞中TLR4、p-P65蛋白的表达水平显著升高(0.05)，p-I资B琢蛋白的表达水平极显著降低(0.01)(图3)。表明Mh感染可能通过调节TLR4/NF-资B信号通路中的TLR4、p-P65、p-I资B琢蛋白表达水平的变化诱发细胞的炎症反应。3讨论Mh是引发牛呼吸道疾病综合征的重要细菌性病原之一，通常定植于牛的上呼吸道内，在应激条件下可引发犊牛的纤维性肺炎和胸膜肺炎11，对畜牧业造成了严重的经济损失。本研究采用MTT法筛选体外感染BT细胞的Mh浓度。通过检测并统计感染Mh后细胞的存活率，筛选出合适的Mh感染终浓度为1伊106cfu/mL进行后续实验。筛选合适的感染终浓度是为了避免因细菌浓度过低，不能对BT细胞造成明显损伤，细菌浓度过高细胞大量死亡不利于细胞的收集，从而影响后续试验的准确性。该结果与Cai等的研究结果不同，其筛选的Mh感染牛支气管上皮细胞的浓度为1伊105cfu/mL，分析其原因可能是Cai等使用的是牛支气管上皮细胞，而本实验使用的是BT细胞所致10。细胞因子在机体的先天免疫和获得性免疫反应中发挥着广泛的生物学功能，可通过自分泌或旁分泌的方式对细胞的增殖、分化等方面发挥促进或抑制的作用12-13。其中的IL-1茁、TNF-琢、IL-6是有效的促炎因子，当促炎因子的分泌水平升高时，预示着机体发生了炎症反应14。为了探究Mh诱导BT细胞是否发生炎症反应及发生炎症反应的机制，本研究通过qPCR检测Mh感染的细胞中细胞因子IL-1茁、TNF-琢、IL-6 mRNA的转录水平；并采用间接ELISA检测细胞上清液中上述细胞因子的分泌水平。结果显示，IL-1茁、IL-6、TNF-琢 mRNA的转录水平以及蛋白分泌水平均极显著高于空白对照组细胞。Cai等通过建立小牛体外肺感染模型发现，当支气管上皮细胞感染Mh后，TNF-琢的分泌水平会显著升高15，这与本研究Mh感染的细胞中TNF-琢显著升高的结果一致。Cozens等在2019年以Mh感染牛气道上皮细胞，与空白对照细胞相比，Mh感染的细胞中IL-1茁、IL-6的分泌水平显著升高16，该结果与本研究结果基本一致。表明Mh感染能够引起BT细胞中细胞因子的显著变化。本研究进一步通过western blot检测BT细胞中TLR4/NF-资B信号通路中TLR4、p-P65及p-I资B琢蛋白的表达水平。结果显示，Mh感染的细胞中上述蛋白的表达水平比空白细胞均发生了显著或者极显著的变化。2020年Cai等通过分离的牛支气管上皮细胞建立了Mh体外感染模型，证实Mh可通过TLR4介导的图2Mh感染BT细胞中各细胞因子mRNA转录水平的qPCR(A)及分泌水平的间接ELISA(B)的检测结果图 3Mh感染BT细胞TLR4/NF-资B 信号通路相关蛋白表达的western blot检测(A)及其灰度值的分析(BD)Mh1伊106(cfu/mLABCDMh(cfu/mL)Mh(cfu/mL)Mh(cfu/mL)p-p65p-I资B琢茁-actinTLR41伊10601伊10601伊10601.00.80.60.40.201.51.00.501.51.00.50*-+中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年106410008006002105040302010060402002001501005001伊10601伊10601伊1060Mh(cfu/mL)Mh(cfu/mL)Mh(cfu/mL)TNF-琢IL-6IL-1茁AB*1伊1060Mh(cfu/mL)80060040020021010008006002101伊1060Mh(cfu/mL)1伊1060Mh(cfu/mL)TNF-琢IL-6IL-1茁*NF-资B信号通路引发细胞的炎症反应10。本实验结果与该结果基本一致。NF-资B在调节细胞反应中起重要作用，是对有害物质刺激细胞的第一反应者，已知的NF-资B信号通路激活的细胞因子有很多，包括IL-1茁、IL-6、TNF-琢等17。NF-资B通常与抑制剂I资B结合形成三聚体，一般情况下以无活性的状态存在于细胞胞浆中18。TLR4是机体天然免疫系统中一个重要的模式识别受体，其与炎症反应中的促炎因子分泌以及TLR下游信号通路的激活密切相关19。有研究表明TLR4信号的活化受细菌LPS的调控，并且该受体的缺失可抑制由LPS诱导的炎症反应的发生20。TLR4是NF-资B信号通路的上游蛋白，当TLR4的表达升高时就会激活其下游的NF-资B信号通路，从而使该通路中相关蛋白的表达水平发生变化21-22。因此通过本实验的结果表明，Mh感染BT细胞后可通过TLR4介导的NF-资B信号通路诱导其发生炎症反应。本研究首次证实Mh可通过TLR4/NF-资B信号通路诱导BT细胞发生炎症反应，为Mh发病机制的研究奠定实验基础，并为溶血性曼氏杆菌病的防治提供新思路。参考文献：周玉龙，李国军，李阳，等.奶牛曼氏杆菌与大肠杆菌混合感染病原分离鉴定J.黑龙江畜牧兽医，2007，(11)：80-82.谢倩茹，童胜涛，邵咏旋，等.牛呼吸道感染细菌病原的致病机理与防控研究进展J.中国兽医学报，2016，36(12)：2183-2188.郭珏岑.溶血性曼氏杆菌PCR检测方法比较及四川五个地区山羊曼氏杆菌感染的调查D.成都：西南民族大学，2022.楚会萌，孙阳阳，张亮，等.牛呼吸系统疾病研究进展J.现代农业科技，2019，(17)：219-220.董捷.浅谈溶血性曼氏杆菌研究进展J.广西畜牧兽医，2020，36(1)：43-44.张继鑫，彭远义，李能章.溶血性曼氏杆菌白细胞毒素研究进展J.中国预防兽医学报，2019，41(11)：1178-1182.MOMBENI 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