抗菌抗病毒常用实验研究应用方法知识.doc

抗菌抗病毒惯用实验研究办法细菌、病毒性疾病是当前国内外流行重要传染病,特别是近两年来,由冠状病毒引起SARS及由流感病毒引起禽流感给动物及人类带来严重危害,是人所共知由于各种疫苗不断浮现,虽然某些细菌、病毒病已得到了有效控制,但是其治疗尚无有效解决办法因而研制高效、低毒新型中药抗菌、抗病毒制剂已成为巫待解决问题。1、惯用抗菌办法1、1稀释法1、1、1试管稀释法培养基内抗生素含量按几何级数稀释并接种适量细菌，经孵育后，观测能引起抑菌作用最低抗生素浓度，称最低抑菌浓度(MIC)为该菌对药物敏感度。稀释法所获得成果比较精确，常被用作校正其她办法原则。如如下黄贝贝等青钱柳抗菌作用实验研究和黄利权等火绒草抗菌活性研究实验办法:1、应用试管稀释法,测定青钱柳提取物对实验菌抑菌效果,检查不同浓度下青钱柳提取物对细菌、霉菌抗菌作用。成果:青钱柳提取物在体外对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具备较强抗菌作用;而对大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌抗菌作用不明显;对黄曲霉、烟曲霉等霉菌抗菌作用不明显1。2、采用试管稀释法,分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚某些、醇提乙酸乙酯某些、醇提正丁醇某些、醇提水溶某些等7种提取物对大肠杆菌C83882、大肠杆菌C83903、大肠杆菌C83914、沙门氏菌C79-20、金黄色葡萄球菌Newbould S-305、金黄色葡萄球菌临床分离株等6株病原菌最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。实验成果表白,火绒草醇提物及其石油醚某些和乙酸乙酯某些对两种金黄色葡萄球菌具备较强抑制作用,其MIC为0114 mg/ml生药浓度,MBC为0127 mg/ml生药浓度,而其他某些对金黄色葡萄球菌抑制作用较弱。火绒草醇提正丁醇某些和水溶某些对3株大肠杆菌和1株沙门氏菌具备较强抑制作用,其MIC为2170 mg/ml生药浓度,MBC为2170 mg/ml生药浓度,显示了较强抗菌活性2。1、1、2肉汤稀释法以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗生素作不同浓度稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)。如刘菁菁研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA) 体内外抗菌活性。蓝玉簪龙胆分别以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸馏水提取，得到极性不同4某些产物，运用肉汤稀释法测定其对 MRSA 和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌( MSSA) 最低抑菌浓度( MIC) ；体内实验某些：采用腹腔注射 MRSA 法建立小鼠感染模型，分别予以蓝玉簪龙胆水提液高、中、低剂量，银黄胶囊治疗 15 d，并与模型对照组比较，观测存活率。成果：体外实验：蓝玉簪龙胆各极性组分对 MRSA 和 MSSA 菌株均有不同限度抑菌作用，其中正丁醇组分抑菌作用最强，另一方面为乙醇、水层组分；体内实验：除了蓝玉簪龙胆大剂量组，别的各治疗组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。结论 蓝玉簪龙胆对 MRSA 和 MSSA 均具备一定抗菌作用，并且敏感性差别无明显性；对 MRSA 感染小鼠有一定治疗作用3。胡景玉等为了理解衡水地区大肠埃希菌药敏状况，采用肉汤稀释法18种抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）并计算其MIC50和MIC90。成果亚胺培南、哌拉西林、她唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦显示良好抗菌作用，其MIC50分别为0.5 g/ml、1 g/ ml、0.5 g/ ml；MIC90均为2 g/ml，其她药物显示不同限度耐药，且大肠埃希菌产ESBLs检出率较高。结论检出大肠埃希菌存在多重耐药，仅对亚胺培南、哌拉西林、她唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦普遍敏感4。Kianbakht S等通过肉汤稀释法研究刺蒺藜不同部位（果、茎叶、根）甲醇提取物对金黄色葡萄球菌ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 29212、肠埃希氏菌ATCC 25922、绿脓杆菌ATCC 27853四种细菌抗菌能力，研究成果表白：果、茎叶对四种菌MIC值均为2mg/ml；根甲醇提取物对MIC值对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肠埃希氏菌均为4mg/ml，对绿脓杆菌MIC值为2mg/ml5。1、1、3琼脂平板稀释法 将不同浓度抗菌药物，分别加入到定量琼脂培养基中，混匀，制成固体含药平皿，使每一种平皿中所含抗菌药物浓度相差2倍，用多点接种仪把待测细菌点种到具有抗菌药物琼脂培养基表面上，在特定温度下培养恰当时间后，平皿上无菌落生长最低药物浓度为抗菌药物对受试菌种最低抑菌浓度。每一次实验都应用原则菌株做质控。琼脂平板稀释法本法特点是可同步进行大量菌株药敏测定。也合用于中草药和厌氧菌药敏测定。 如汪黎虹等应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄等10种中药进行加工解决至粒径为510m后，运用琼脂稀释法测定其实验室近年来收集患病鳗鲡中分离得到18 株常用致病菌抑菌作用。成果表白：上述10种中药单用对除B12 肺炎克雷伯菌以外17株养殖鳗鲡重要致病菌均有一定抑制作用，其平均抑菌浓度( MIC) 范畴为0. 165128 mg /mL，平均杀菌浓度(MBC) 范畴为0. 210128 mg /mL6。1、1、4浓度梯度法 浓度梯度实验是一种定量抗生素药敏测定技术，可用于非苛养革兰阳性和阴性需氧菌(如肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌和肠球菌)以及苛养菌(如厌氧菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌)药敏测定。该系统包具有一种预先制备好抗生素浓度梯度，可用于在琼脂培养基判断某抗生素对微生物最小抑菌浓度(MIC)。如刘芳等武汉地区住院患儿感染肺炎链球菌耐药状况。如刘芳等收集医院1-12月住院患儿分离肺炎链球菌1521株，采用纸片扩散法及E-test法进行抗菌药物敏感实验;按CLSI 年版判断成果；使用X2检查分析耐药性变化。研究结论为武汉地区住院患儿分离肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素及磺胺甲噁唑、甲氧苄啶敏感率极低，对左氧氟沙星及万古霉素均有极高敏感率，对青霉素仍保持较高敏感率，可作为治疗普通肺炎链球菌感染首选药物7。1、1、5 试管两倍稀释法试管两倍稀释法取生长浊度达9108mg/ml菌液，菌液用培养液稀释，接种于无菌试管中，然后加入不同浓度抗菌药物或未知药物，37孵育。1624 h，以无细菌生长最低浓度为MIC。将无细菌生长完全清晰液再移种于不含抗菌药物血平板中，经37过夜培养，菌落数不超5个平板最低药物浓度即为该药物MBC。普通以MIC来评价细菌对药物敏感度。马加庆等采用试管两倍稀释法观测利胆止痛胶囊在体外对甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌、大肠杆菌和沙门菌生长影响研究成果表白：利胆止痛胶囊对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、痢疾杆菌和大肠杆菌MIC 分别为25、50、50、25 和12.5 mg/mL，对沙门菌无明显抑菌作用8。1、1、6微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法原理：原理同肉汤稀释法。石功名等对西她沙星与莫西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌ATCC25923活性进行体内外研究，采用微量肉汤稀释法检测药物MIC，MBC及MPC，研究成果表白：在体外实验中，MIC，MBC，MPC及时间与浓度杀菌曲线实验表白西她沙星胞内外抑菌活性均强于莫西沙星9。1、1、7微量稀释法微量稀释法本法为改进试管稀释法。取稀释菌液接种在96孔板中，然后加入待试抗菌药物，混匀后放置37孵育1624 h，在衬有黑底板光线下观测，细菌生长时小孔呈弥散状混浊或在孔底部有圆形或丝状沉淀；无细菌生长时孔内所含最低抗菌药物浓度即为MIC。把无细菌生长孔内液体移种不含抗菌药物血平板中，菌落数少5个平板最低药物浓度即为MBC。如宋晓晶等通过微量稀释法分别测定特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素对38株临床分离口腔念珠菌体外敏感性。研究成果表白：38株白念珠菌对氟康唑耐药4株，敏感34株；对伊曲康唑耐药5株，敏感33株；对特比奈芬耐药15株，敏感23株；制霉菌素均敏感10。1、2纸片琼脂扩散法琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种实验菌平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而减少，在药物一定扩散距离内，由于药物抗菌效应，实验菌不能生长，此无菌生长范畴称为抑菌圈，抑菌圈大小与药物抑菌效应成正比。如熊枫等从西太平洋近赤道区采集到18个深海沉积物样品中分离到83株海洋真菌,采用滤纸片琼脂扩散法和MTT法分别对其发酵液乙酸乙酯抽提物抗菌、抗肿瘤活性进行筛选.成果显示,有37株菌株对至少一种批示菌有抑制作用;有29株菌株对KB或Raji肿瘤细胞具备明显抑制活性,分别占总供测菌株44.6%和34.9%.在抗肿瘤活性菌株中,WP-M-1、DY-G-2、DY-C-2、WP-K-3和WP-Q-2等5株菌具备很高活性,其发酵液乙酸乙酯抽提物对Raji细胞IC50分别为5.000、1.064、2.796、1.920、0.520Lg/mL.研究成果表白,海洋沉积物来源真菌中蕴藏着丰富抗菌及抗肿瘤活性代谢产物产生菌,是开发抗菌和抗肿瘤药物宝贵资源11。又如邬晓勇等建立了蛙皮抗菌肽活性测定办法TTC 微量稀释法；运用 SephadexG25 凝胶层析分离抗菌肽粗品获得一种活性组分命名为 G5，运用 TTC 微量稀释法测定活性组分 G5 抑制大肠杆菌 MIC 是 80g/mL、抑制铜绿假单胞菌 MIC 是 20 g/mL、抑制金黄色葡萄球菌 MIC 是 80 g/mL；活性组分 G5 再经凝胶 HPLC 分离纯化获得两个活性组分和，组分和组分再分别通过 RP-HPLC 分离纯化获得两个色谱纯活性组分命名为 Rana和 Rana12。1、3平板稀释法 如吴决等探讨抗菌性中药药物敏感实验在鉴定中药新药上应用。应用中药药敏实验平板稀释法鉴定中药新药/万力通0对常用十余种细菌最低抑菌浓度(MIC).成果 运用平板稀释法测定中药新药MIC,效果抱负.结论 在中药药敏实验诸办法中,平板稀释法鉴定中药新药抑菌作用,办法简便,易操作,成果易观测13。1、4打洞法如向红采用平板打洞法对西南委陵菜(Potentilla fuigens)全草、根、叶水煎剂进行体外抗菌实验。成果表白,全草、根、叶水煎剂对G-大肠杆菌、G-志贺氏痢疾杆菌、G+金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。不同入药部位对同一细菌抑菌能力不同,作用强弱与药液浓度大小关于;同一入药部位对不同细菌无明显选取抑制作用14。再如袁婷等常用中草药体外抑菌实验，应用体外抑菌实验平板打洞法、试管两倍稀释法和平板培养法对本地常用中草药一枝黄花、黑老虎、土甘草、花木通等进行了对肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌药物敏感性测定。成果一枝黄花对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌呈高度敏感，最小抑菌浓度分别为1/ 80 和 1/ 40，最小杀菌浓度分别为 1/ 20 和 1/ 10；对肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌呈中度敏感，最小抑菌浓度均为 1/ 20，未见最小杀菌浓度,黑老虎、土甘草均对肺炎链球菌呈高度敏感，最小抑菌浓度均为 1/ 80，最小杀菌浓度分别为 1/ 20 和1/ 10，对鼠伤寒沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用；花木通则对四种供试菌均未见抑菌作用15。1、5挖沟法如武延隽等理解巴豆油抗菌谱。办法:采用琼脂挖沟法与琼脂绝对浓度法3,6,对20种临床常用病原菌和条件致病菌进行了实验室条件下,巴豆油抗菌活性研究。成果:琼脂绝对浓度法,巴豆油在1B101B40浓度时,对金黄色葡萄球菌有抑制生长作用,对别的19种细菌均无作用;琼脂挖沟扩散法,巴豆油对所有20种实验菌均无抑制生长作用。结论:琼脂挖沟扩散法实验中,巴豆油对所有实验菌均无抗菌活性,而在琼脂绝对浓度法实验中1B40稀释浓度对金黄色葡萄球菌仍有抗菌活性,不同办法影响巴豆油抗菌成果16。2、抗病毒办法2、1细胞病变法(cytopathic effect，CPE)细菌病变法是以CPE为指标,办法简便,可以对多数药物抑制病毒增殖效果进行测定与评价。普通以加号表达细胞病变限度,细胞病变75%为+。如张春江等探讨藏药甘青乌头抗单纯疱疹病毒 II 型（HSV-2）作用和机制。办法 MTT 法测定甘青乌头对 Vero 细胞毒性，采用细胞病变法和蚀斑法测定甘青乌头体外抗病毒活性，以半数抑制浓度和治疗指数为评价指标；定量荧光 PCR 法和蚀斑法考察甘青乌头体外抗病毒作用机制。用 HSV-2 建立小鼠脑炎模型，对甘青乌头体内抗单纯疱疹病毒抗病毒活性进行评价。成果：甘青乌头对 Vero 细胞半数中毒浓度(CC50)为 5.57 gL-1。细胞病变法和蚀斑法测得甘青乌头半数有效浓度(EC50)分别为 2.25，1.68 gL-1，治疗指数 TI 分别为 2.47，3.32。LD50值为 0.85 gkg-1。甘青乌头延长了小鼠平均存活时间，对小鼠死亡显示出 10%保护率。甘青乌头能直接灭活 HSV-2，可以明显抑制 HSV-2 感染性；对病毒吸附到细胞没有抑制作用，能抑制 HSV-2 大分子增值。抑制 HSV-2 DNA 合成抑制倍数达 102。结论：甘青乌头体外具备较强抗 HSV-2 活性，抗病毒作用是通过抑制病毒复制循环各个环节起作用17。2、2 染料吸取法 2、2、1 MTT染色法MTT可被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原成紫色不溶性结晶(颗粒)并沉积在细胞内或细胞周边,而死细胞则无此功能。二甲基亚砜(DMSO)或酸化异丙醇能溶解细胞中紫色不溶性结晶物,用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光密度值(OD),可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范畴内,MTT结晶物形成量与细胞数成正比,因而可用于抗病毒药物活性筛选。如付光发等中药鸭拓草提取物抗病毒作用研究。在96孔培养板单层培养vero细胞,将鸭拓草提取物按照倍比关系稀释,浓度分别为25.6mg/ml 12.8mg/ml 6.4mg/ml 3.2mg/ml 1.6mg/ml 0.8mg/ml 0.4mg/ml 0.2mg/ml 0.lmg/ml,每一稀释浓度都要重复3次,同步设正常细胞对照,观测细胞病变,采用MTT法,在培养过48h细胞中,加入含MTT培养液5mg/ml,每孔0.01ml,继续培养4一6h后,加入二甲亚矾,每孔0.lml,测定其在570nm波长下吸光度。将Vero细胞生长呈单层孔培养板上,加入100而TCro50HZN3型病毒液,每孔加入0.lml,lh后,除去病毒液,加入TCS(12.80mg/ml)1/10倍稀释出5个浓度鸭拓草提取物,再以4倍倍比稀释,即分别为1280、320、80、20、5vg/ml,并设病毒对照,细胞对照,受试药物和阳性药物对照组用此法检测病毒抑制率,按照Probit回归法计算IC5018。又如Kruse PF，Patterson等采用MTT法评价清热消炎复方制剂体外抗柯萨奇病毒(CVB3)、呼吸道合胞病毒(RSV)效果。办法:待正常细胞长成单层,用病毒感染,培养一定期间后,依照不同病毒感染细胞浮现细胞病变(CPE)时间不同,加入一定量MTT液,然后测定OD570值,计算病毒抑制率。成果:MTT法较光镜CPE法更为客观,能以OD值变化反映药物对病毒抑制限度,从而获得实验成果,且便于记录学解决。成果证明MTT法是一种能广泛应用于抗病毒药物筛选和评价办法19。2、2、2 中性红染色法中性红染料吸取法原理是活细胞可以吸取一种弱阳离子染料)中性红,后者与活细胞胞浆中阴离子结合而滞留于活细胞中,并不被细胞洗涤液洗脱,渗入活细胞中性红量与活细胞数量成正比,因而OD值直接反映活细胞数量,与细胞增殖限度成正比。普通依照各组之平均OD值,计算抑制百分率,再按Reed andMuench法计算IC50。抑制百分率=实验组平均OD值-病毒对照组平均OD值细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值勤x100%如高川等探讨白颖苔草粗提物对呼吸道合并胞体病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和柯萨基病毒B3(Cox B3)体外抑制作用。办法:采用超声提取,获得药物粗提物,以HEK293-RSV、MDCK-Flu A和HEK293-Cox B3体外感染模型,通过显微镜下观测细胞病变,酶标仪测定中性红染色A540值,计算抑毒指数评价抗病毒效果。成果:白颖苔草丙酮-乙酸乙酯粗提物可抑制RSV和Flu A细胞病变效应,抑毒指数分别为14.22和92.41,对Cox B3病毒抑毒指数为1。结论:白颖苔草对RSV和Flu A具备明显抑制作用,而对Cox B3无抑制作用20。再如褚秀玲等采用中性红染色法检测人参皂苷及其衍生物抗马立克病毒作用研究，研究成果表白先加中药后感染病毒时，人参皂苷和衍生物7体现出较强抑制病毒活性作用； 先接病毒后加中药时，人参皂苷和衍生物7体现出较强抑制病毒活性作用；病毒和药物混合感作后加入细胞时，衍生物7，8,2体现出较强抑制病毒活性作用；综合3种加药实验成果,中药抑制病毒活性作用由强到弱顺序依次为衍生物7、人参皂苷、衍生物2、衍生物1、衍生物6和衍生物821。2、3蚀斑减少法实验证明,将病毒接种于单层培养细胞,数天后固定细胞并染色,因病毒感染而导致变性细胞不被染色,形成蚀斑(空斑)。蚀斑减少法以此为基本,运用蚀斑形成,以接种病毒后,在未添加实验药物培养基上形成蚀斑数为100%对照,通过计算添加实验药物培养基上形成蚀斑减少率,来研究实验药物抗病毒活性。通惯用于对照蚀斑数为50-100个。超过该范畴,药物感受性即减少,且会影响实验成果。此外蚀斑缩小也是抗病毒活性指标。因而,蚀斑减少法是一种定量测定法,理论上一种蚀斑代表一种有感染性毒粒。药物解决后,蚀斑数减少,表达病毒复制受到抑制,子代毒粒产生减少。蚀斑减少法定量精确,成果可靠。用一系列药物浓度,可得到剂量反映曲线,合用于不同药物抑制强度比较。由于操作较复杂。需较多细胞及药物,不适合初筛,可作为二筛或有效药物效价评估。2、4病毒抗原测定 有些病毒不产生细胞病变或蚀斑,或者产生细胞病变过程较慢,如乙型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒等。病毒复制过程可产生各种病毒基因编码蛋白质,如表面糖蛋白、衣壳蛋白、酶蛋白及调控蛋白等,这些蛋白为病毒构造蛋白或功能蛋白,浮现于病毒繁殖周期不同阶段,均可作为病毒复制限度之指征。运用抗原、抗体特异结合免疫学原理,用特异抗体检测某一特异抗原,特别单克隆抗体应用,更明显地提高了免疫检测法特异性。此外,可运用定量PCR、荧光定量PCR等办法测定病毒核酸。参照文献1 黄贝贝,叶荷平,HUANG X Y,等.青钱柳抗菌作用实验研究J.江西中医学院学报,18(4):48-49.2 黄利权,伍义行.火绒草抗菌活性研究J.中兽医医药杂志,105(1)：5-6.3 刘菁菁.蓝玉簪龙胆提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌作用实验研究J.中华人民共和国药理学通报,27( 7):1024-1026.4 胡景玉,杜红丽,乔艳梅,等.245例大肠埃希菌临床分离株药敏分析J.当代防止医学,39 (21):5664-5666.5 Kianbakht S,Jahaniani F.Evaluation of Antibacterial Activity of Tribulus terrestris L. Growing in IranJ. Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics,2(1):22-24.6 汪黎虹,关瑞章,李忠琴,等.10种单味中药对养殖鳗鲡重要致病菌抑制作用J.集美大学学报(自然科学版),15(6):1-5.7 刘芳,虞涛,鲍连生,等.武汉地区住院患儿分离肺炎链球菌耐药分析J.中华医院感染学杂志,21(5):1040-1042.8 马加庆，陈鹏，沈志强,等.利胆止痛胶囊对小鼠抗抑菌炎、镇痛和利胆作用研究J.昆明医学院学报,32(1):10-15.9 石功名,陈向东,汪辉,等.西她沙星与莫西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌活性研究J.中华人民共和国抗生素杂志,37(11):867-880.10 宋晓晶,董岩,张虹,等.微量稀释法检测四种药物对白念珠菌敏感性分析J.大连医科大学学报,32(4):462-464.11 熊枫,郑忠辉,黄耀坚,等.从深海沉积物中筛选具备抗菌、抗肿瘤活性海洋真菌J. 厦门大学学报,45(3):419-423.12 邬晓勇,何钢,颜军,等.蛙皮抗菌肽活性检测办法筛选及其分离纯化J.西南农业学报， ,24 (4 ):65-69.13 吴决,顾世海,王立霞,抗菌性中药药物敏感实验办法研究J.北华大学学报,，1(6):489-490.14 向红.民间草药西南委陵菜抗菌作用实验J. 贵州师范大学学报,21( 2):24-26.15 袁婷,钟学稳.常用中草药体外抑菌实验J.兽牧兽医信息,26(9):25-26.16 武延隽,赵中夫,明亮.巴豆油抗菌范畴实验室研究J.长治医学院学报,18(2):45-48. 17 张春江,李薇,孙振鹏,等. 藏药甘青乌头抗单纯疱疹病毒 II 型体内外作用研究J.中华人民共和国药学杂志,，44 (1):54-56. 18 付光发.中药鸭拓草提取物抗病毒作用研究D 湖北中医药大学,.19 Kruse PF，Patterson MK. Tissue culture；methods and ap-plications. 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