基于Notch信号通路探索...卵巢生殖干细胞的作用及机制_杨一博.pdf

第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023基于 Notch信号通路探索菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷对生理小鼠卵巢生殖干细胞的作用及机制杨一博，徐颖*，王璐，邹钊，徐盼瑜，杜寒倩，李佳珊，林娜*（中国中医科学院 中药研究所，北京 100700）摘要 目的：探讨菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片对雌性生理小鼠卵巢生殖干细胞的作用，并从神经源性位点缺口同源蛋白（Notch）信号通路探讨其作用机制。方法：将 60只 5周龄雌性昆明种小鼠随机分为正常组，1、2倍临床等效剂量雷公藤多苷片组（低、高剂量组 13.65、27.3 mg kg-1d-1），菟丝子总黄酮（低、高剂量组 150、300 mg kg-1d-1），配伍组（雷公藤多苷片低剂量+菟丝子总黄酮低剂量组），每组 10只，连续给药 3周后取材，计算子宫、卵巢脏脑指数，光镜下观察卵巢组织病理形态学改变；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中雌二醇含量；免疫荧光法观察卵巢上皮的卵巢生殖干细胞标志物果蝇 VASA基因同源类似物（Mvh）、八聚体结合转录因子 4（Oct4）、酪氨酸激酶受体（c-kit）、同源框蛋白质（Nanog）及 Notch信号通路分子神经源性基因 Notch同源蛋白 1（Notch1）、Hes家族 BHLH 转录因子 1（Hes1）、锯齿典型 Notch配体 1（Jagged1）的表达。结果：与正常组比较，雷公藤多苷片低剂量组和高剂量组对小鼠子宫、卵巢的脏脑系数及形态学差异无统计学意义，仅可致小鼠闭锁卵泡数显著增加（P0.01）；雷公藤多苷片低剂量对卵巢生殖干细胞标志物和 Notch信号通路分子的表达有降低趋势，雷公藤多苷片高剂量下 Mvh、c-kit、Nanog的表达水平明显降低（P0.05，P0.01），Notch1、Hes1表达水平显著降低（P0.01）；菟丝子总黄酮低剂量组上述指标均明显升高（P0.05，P0.01）；与雷公藤多苷片低剂量组比较，配伍组闭锁卵泡数显著降低（P0.01），Mvh、Nanog表达水平显著升高（P0.01），Notch1、Hes1表达水平明显升高（P0.05，P0.01）。结论：卵巢生殖干细胞是雷公藤多苷片生殖毒性的源头靶点，菟丝子总黄酮可参与调控卵巢生殖干细胞途径缓解雷公藤多苷片所致的生殖损伤，其作用机制可能与 Notch信号通路相关。关键词 雷公藤多苷片；菟丝子总黄酮；配伍；卵巢生殖干细胞；神经源性位点缺口同源蛋白（Notch）信号通路中图分类号 R2-0；R33；R289；R593.22 文献标识码 A 文章编号 1005-9903（2023）05-0009-07doi 10.13422/ki.syfjx.20220944 网络出版地址 https:/ 2022-04-06 15:22:09Effect and Mechanism of Cuscutae Semen Total Flavonoids Combined with Tripterygium wilfordii Polyglycoside Tablets on Ovarian Germline Stem Cells of Physiological Mice by Notch Signaling PathwayYANG Yibo，XU Ying*，WANG Lu，ZOU Zhao，XU Panyu，DU Hanqian，LI Jiashan，LIN Na*（Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）Abstract Objective：To observe the effect of Cuscutae Semen total flavonoids combined with Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets（TWPT）on ovarian germline stem cells of female physiological mice through neurogenic locus notch homolog（Notch）signaling pathway.Method：Sixty female Kunming mice（5 weeks old）were randomly divided into normal group，Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets 收稿日期 2022-01-07基金项目 国家自然科学基金项目（81974537，82004248）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ZXKT20011）；中国中医科学院科技创新工程项目（CI2021A03802）第一作者 杨一博，硕士，从事中药药理学研究，E-mail：通信作者 *徐颖，研究员，博士生导师，从事中药生殖药理学和中药药性研究，E-mail：；*林娜，研究员，博士生导师，从事中药药理学及中药药性研究，E-mail：9第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023low-，high-dose groups（13.65 mg kg-1d-1 and 27.3 mg kg-1d-1，1 and 2 times clinical equivalent dose），Cuscutae Semen total flavonoids low-and high-dose groups（150 mg kg-1d-1 and 300 mg kg-1d-1），and combination group（13.65 mg kg-1d-1 TWPT and 150 mg kg-1d-1 Cuscutae Semen total flavonoids），with 10 in each group.After 3 weeks of continuous administration，the uterus/brain and ovarian/brain indexes were calculated，and the pathological changes of ovarian tissue were observed under light microscope.The content of estradiol in serum was determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Immunofluorescence assay was performed to observe the expressions of germline stem cell markers in ovarian epithelium，including mouse vasa homologue（Mvh），octamer-binding transcription factor 4（Oct4），tyrosine-protein kinase receptor（c-kit），Nanog，Notch signaling pathway molecules，neurogenic locus notch homolog protein 1（Notch1），hes family BHLH transcription factor 1（Hes1），and jagged canonical Notch ligand 1（JAG1）.Result：Compared with the normal group，low and high doses of TWPT had no significant effect on the uterus/brain and ovary/brain indexes and the uterus and ovary morphologies of mice，while only the number of atretic follicles was increased（P0.01）.The expressions of ovarian germline stem cell markers and Notch signaling pathway molecules had a decreasing trend in TWPT low-dose group，while the expressions of Mvh，c-kit，and Nanog were down-regulated（P0.05，P0.01）and the expressions of Notch1 and Hes1 were also reduced（P0.01）in TWPT high-dose group.However，the above indexes were increased in Cuscutae Semen total flavonoids low-dose group（P0.05，P0.01）.Compared with the low does of TWPT group，the combination group had a decrease in the increased number of atretic follicles（P0.01），an improvement in the down-regulated expressions of Mvh and Nanog（P0.01），and an increase in the expressions of Notch1 and Hes1（P0.05，P0.01）.Conclusion：Ovarian germline stem cells are the source target of the reproductive toxicity of TWPT.Cuscutae Semen total flavonoids participate in the regulation of the germline stem cell pathways to alleviate the reproductive toxicity caused by TWPT，and its mechanism of action may be related to the Notch signaling pathway.Keywords Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets（TWPT）；Cuscutae Semen total flavonoids；combination；ovarian germline stem cells；neurogenic locus notch homolog protein（Notch）signaling pathway雷公藤多苷片是雷公藤最常用的代表性制剂，被世界卫生组织（WHO）认定为治疗关节炎“中国首创植物新药”，在治疗类风湿关节炎、慢性肾病、红斑狼疮等多种疾病中应用的日益广泛，但其不良反应尤其是临床首发及最突出的生殖损伤严重限制了雷公藤多苷片的临床应用，女性生殖毒性已成为雷公藤临床用药中遇到的重大挑战之一1。目前对雷公藤所致雌性生殖系统损伤机制研究主要集中在抑制卵泡生长发育、引起卵巢细胞凋亡及干扰生殖内分泌 3个方面。目前雷公藤多苷片毒性研究的剂量严重高于临床常用剂量，临床指导意义有限，且其生殖毒性成分及深入机制研究缺乏。有研究表明菟丝子总黄酮可降低雷公藤多苷造成的雌性生 殖 功 能 损 伤，其 作 用 机 制 与 Smad 家 族 成 员 4（Smad4）、生长分化因子-9（GDF-9）的表达干预卵巢颗粒细胞和卵母细胞的功能相关2，其减毒机制尚有待深入探讨。自 2004年 JOHNSON等3提出原始卵泡池理论，打破了传统的“固定卵泡池学说”，卵巢生殖干细胞作为女性生殖的源头，已成为生殖毒性 研 究 的 新 靶 点，神 经 源 性 位 点 缺 口 同 源 蛋 白（Notch）信号通路广泛参与多种成体干细胞不对称分裂的过程，在生殖干细胞增殖、分化和凋亡过程中起着关键性作用，并与细胞衰老密切相关4-6，但目前尚无关于雷公藤从卵巢生殖干细胞的角度及Notch 信号通路探索其生殖毒性的作用及机制研究。本实验从 Notch信号通路探讨菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片对雌性生理小鼠卵巢生殖干细胞的作用及机制。1 材料1.1动物 5 周龄雌性昆明种小鼠，共 60 只，SPF级，体质量 2630 g，购自北京维通利华生物科技股份有限公司，许可证号 SYXK（京）2019-0003。动物饲养于中国中医科学院中药研究所实验动物中心，日光灯照明，空调控温，实验操作符合中国中医科学院中药研究所实验动物福利伦理审查委员会标准（伦理编号 2020B136）。适应性饲养 3 d 后用于实验。1.2试剂 大鼠雌二醇（E2）酶联免疫吸附测定法10第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023（ELISA）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号 7ZCBU6H6W2）；苏木素、伊红染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为15111830、15111828）；果蝇 VASA 基因同源类似物（Mvh）、八聚体结合转录因子 4（Oct4）、酪氨酸激酶受 体（c-kit）、同 源 框 蛋 白 质（Nanog）抗 体（英 国Abcam 公 司，批 号 分 别 为 ab27591、ab181557、ab231780、ab106465）；Notch1、Hes 家族 BHLH 转录因子 1（Hes1）、锯齿典型 Notch配体 1（Jagged1）抗体（美国 Cell Signaling Technology 公司，批号分别为3608S、11988S、70109S）；山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（美 国 Earthox 公 司，批 号 320581）；DAPI（美 国Sigma公司，批号 D9542）。1.3 仪 器 BX60 型 正 置 显 微 镜、FV1000（40X-100X）型激光共聚焦显微镜（日本 Olympus 公司）；BSA224S 型天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；BMJ-1B 型组织包埋机（天津天利航空机电有限公司）；RM2016型切片机（上海徕卡仪器有限公司）。1.4中药溶液配制 雷公藤多苷片购于浙江得恩德制药股份有限公司，批号 1706103B，规格 10 mg/片。据说明书所示，人临床给药剂量为 11.5 mg kg-1 d-1，临床常用剂量为 1.5 mg kg-1d-1，按人与小鼠的体表面积计算法换算给药剂量，以 1.5 mg kg-1d-1计算小鼠临床等效剂量为 13.65 mg kg-1d-1。将雷公藤多苷片研磨成粉，用 0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成质量浓度为 1.365、2.73 g L-1的雷公藤多苷片的混悬溶液。菟丝子总黄酮购于南京欣厚生物科技有限公司，批号 ZL20200926，纯度 95%。用 0.5%羧甲基纤维 素 钠 溶 液 配 制 成 质 量 浓 度 为 15、30 g L-1的溶液7。2 方法2.1动物分组与给药 将 60 只昆明种小鼠按随机数字表法分为 6组：正常组、雷公藤多苷片 1倍临床等效剂量组（雷公藤多苷片低剂量组），雷公藤多苷片 2 倍临床等效剂量组（雷公藤多苷片高剂量组），菟丝子总黄酮 150 mg kg-1组（菟丝子总黄酮低剂量组），菟丝子总黄酮 300 mg kg-1组（菟丝子总黄酮高剂量组），配伍组（菟丝子总黄酮低剂量+雷公藤多苷片低剂量组），每组 10 只，连续给药 3 周，正常组每天灌胃等体积的 0.5%羧甲基纤维素钠溶液。2.2取材及组织处理 摘眼球取血，分离血清。取血后脱颈处死小鼠，使用无菌器械剥取全脑、子宫及双侧卵巢，去掉多余的组织和脂肪，称重后左侧卵巢放在 10%甲醛组织固定液中进行固定，右侧卵巢置于80 冻存。计算子宫、卵巢脏脑指数：按照下列公式计算各脏脑指数：脏器指数=脏器质量（g）/全脑质量（g）100%。2.3ELISA 检测大鼠血清 E2水平 ELISA 检测各组大鼠血清中 E2，检测方法按试剂盒说明书进行。2.4苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠卵巢组织病理形态学改变将取材固定的左侧卵巢进行常规石蜡包埋，4 m 厚度切片，脱蜡、水化后，行苏木素染色、伊红溶液染色，脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察8。显微镜下计数每个卵巢内总卵泡数、闭锁卵泡数、成熟卵泡数、黄体数、原始卵泡数，分别求取平均值及标准方差9。2.5免疫荧光法检测卵巢组织中卵巢生殖干细胞标志物 Mvh、Oct4、c-kit、Nanog及 Notch信号通路分子 Notch1、Hes1、Jagged1 表 达 水 平 卵 巢 石 蜡 切片，脱水，抗原修复，5%BSA 封闭，Mvh（1 50）、Oct4（1 250）、c-kit（1 500）、Nanog（1 50）、Notch1（1 400）、Hes1（1 1 000）、Jagged1（1 200）抗体 4 孵育过夜，结合荧光山羊抗兔二抗，滴加 DAPI核染液，封片，荧光显微镜下观察并采集图像。2.6统计学分析 采集得到的图片使用 Image J进行相应处理，采用 Graphpad Prism 6.00 软件分析实验数据，数据均用x s表示，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），P0.05 为差异具有统计学意义。3 结果3.1对小鼠子宫、卵巢脏脑系数和血清 E2的影响 与正常组比较，雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠子宫、卵巢脏脑系数及血清 E2无明显影响。仅雷公藤多苷片高剂量对子宫、卵巢脏脑系数及血清E2有降低趋势，菟丝子总黄酮对子宫、卵巢脏脑系数有升高趋势，但差异无统计学意义。见表 1。3.2对小鼠卵巢组织病理学的影响 正常组小鼠卵巢皮质内可见大小不等的卵泡，颗粒细胞层次多且排列规则，卵泡液丰富，黄体发育好，黄体细胞充实，闭锁卵泡数目较少；与正常组比较，雷公藤多苷片组可见卵巢体积缩小，出现不同程度的萎缩，雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢总卵泡数、成熟卵泡数、黄体数无明显影响，雷公藤多苷片各剂量组小鼠卵巢闭锁卵泡数均显著增多（P0.01），菟丝子总黄酮组小鼠闭锁卵泡数无明显影响，与雷公滕多苷片低剂量组比较，配伍组闭锁卵泡数显著降低（P0.01）；与正常组比较，雷公11第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023藤多苷片组小鼠卵巢初级卵泡数有降低趋势，与雷公滕多苷片低剂量组比较，配伍组可使雷公藤多 苷 片 所 致 原 始 卵 泡 数 的 降 低 趋 势 明 显 改 善（P0.05）。见表 2、图 1。3.3对小鼠卵巢组织中生殖干细胞标志物的影响 与正常组比较，雷公藤多苷片低剂量组小鼠卵巢生殖干细胞标志物的表达有降低趋势，差异无统计学意义；雷公藤多苷片高剂量组 Mvh、c-kit、Nanog的表达水平明显降低（P0.05，P0.01）；菟丝子总黄酮低剂量组 Mvh、c-kit、Nanog的表达水平明显升高（P0.05，P0.01）；与雷公滕多苷片低剂量组比较，配伍组 Mvh、Nanog 表达水平显著升高（P0.01）。见图 2、表 3。3.4对小鼠卵巢组织中 Notch 信号通路分子的影响 与正常组比较，雷公藤多苷片低剂量组小鼠Notch1、Hes1、Jagged1的表达有降低趋势，差异无统计学意义；雷公藤多苷片高剂量组 Notch1、Hes1 表达水平显著降低（P0.01）；菟丝子总黄酮低剂量组Notch1、Hes1 表达水平明显升高（P0.05，P0.01）；菟丝子总黄酮高剂量组 Notch信号通路分子表达水平有升高趋势，差异无统计学意义；与雷公滕多苷片低剂量组比较，配伍组可显著改善雷公藤多苷片所致 Notch1、Hes1表达水平的降低趋势（P0.05，P0.01）。见图 3、表 4。表 1雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠子宫、卵巢脏脑系数和血清 E2的影响（x s，n=10）Table 1 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets and Cuscutae Semen total flavonoids on uterine，ovarian organ and serum estradiol of mouses（x s，n=10）组别正常组雷公藤多苷片低剂量组雷公藤多苷片高剂量组配伍组菟丝子总黄酮低剂量组菟丝子总黄酮高剂量组剂量/mg kg-113.6527.313.65+150150300卵巢脏脑系数/%6.461.486.501.986.131.146.350.906.861.347.041.30子宫脏脑系数/%32.8013.1933.6912.0530.016.0237.5815.4338.4618.4738.3212.00E2/ng L-1712.6495.83716.1892.95694.46123.05795.22103.91732.1364.77719.5579.71表 2雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢组织病理学的影响（x s，n=10）Table 2 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets，Cuscutae Semen total flavonoids on ovarian histomorphology of mouses（x s，n=10）个组别正常组雷公藤多苷片低剂量组雷公藤多苷片高剂量组配伍组菟丝子总黄酮低剂量组菟丝子总黄酮高剂量组剂量/mg kg-113.6527.313.65+150150300总卵泡数25.989.8330.008.3427.5012.9639.179.5441.5010.3931.1410.90闭锁卵泡数1.401.149.175.151）9.674.181）3.001.103）6.173.822.430.53成熟卵泡数0.670.820.170.410.000.000.140.380.170.410.130.35黄体数9.053.678.832.717.833.259.864.8512.676.2211.135.72原始卵泡数10.203.904.501.876.334.0313.007.852）11.506.169.004.96注：与正常组比较1）P0.01；与雷公藤多苷片低剂量组比较2）P0.05，3）P0.01注：A.正常组；B.雷公藤多苷片低剂量组；C.雷公藤多苷片高剂量组；D.配伍组；E.菟丝子黄酮低剂量组；F.菟丝子黄酮高剂量组（图 2、图 3同）图 1雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢病理形态学的影响（HE，40）Fig.1 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets and Cuscutae Semen total flavonoids on ovarian histomorphology of mouses（HE，40）12第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023图 2雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢组织中生殖干细胞标志物的影响（免疫荧光，600）Fig.2Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets and Cuscutae Semen total flavonoids on ovarian reproductive stem cell markers in mouses（IF，600）表 3雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢组织中生殖干细胞标志物的影响（x s，n=10）Table 3 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets and Cuscutae Semen total flavonoids on ovarian reproductive stem cell markers in mouses（x s，n=10）组别正常组雷公藤多苷片低剂量组雷公藤多苷片高剂量组配伍组菟丝子总黄酮低剂量组菟丝子总黄酮高剂量组剂量/mg kg-113.6527.313.65+150150300Mvh/110221 102.101 181.6317 846.32406.3515 887.071 089.602）22 657.601 757.523）26 638.722 525.762）22 311.931 265.23Oct4/110219 755.401 064.0118 573.35764.4617 129.561 328.9519 907.99669.7221 583.012 096.8520 253.38295.71c-kit/110216 733.80907.2614 423.521 532.3911 510.151 620.961）18 785.602 962.3521 532.831 028.301）19 114.522 344.00Nanog/110218 408.451 300.5014 148.463 342.1512 030.341 129.662）22 499.223 043.043）23 614.00674.721）20 588.84933.68注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与雷公藤多苷片低剂量组比较3）P0.01图 3雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢组织中 Notch信号通路分子的影响（免疫荧光，600）Fig.3 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets and Cuscutae Semen total flavonoids on ovarian Notch signaling pathway molecule in mouses（IF，600）13第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，20234 讨论雷公藤多苷片所致的女性生殖毒性已成为其临床用药中遇到的重大挑战之一，毒性机制不清严重限制了其在临床中的应用，本研究探讨菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片对雌性生理小鼠卵巢生殖干细胞的影响，并从 Notch 信号通路探讨其作用机制，结果发现菟丝子总黄酮可显著降低雷公藤多苷片所致正常小鼠卵巢闭锁卵泡数的增加，显著升高雷公藤多苷片所致卵巢生殖干细胞标志物和 Notch信号通路分子表达水平的降低趋势，表明菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片可能通过 Notch信号通路参与调控卵巢生殖干细胞途径。目前对雷公藤所致生殖系统的毒性作用及机制研究中，毒性研究的剂量严重高于临床常用剂量，对临床应用指导意义有限，为了更符合临床实际使用情况，本研究采用 1、2 倍临床等效剂量的雷公藤多苷片进行研究，发现两剂量均可致正常小鼠卵巢闭锁卵泡数显著增加。结合前期预实验结果发现菟丝子总黄酮 1倍临床等效剂量对小鼠卵巢生殖干细胞标志物的表达影响更优于其 2倍临床等效剂量的作用，因此本实验选择 1 倍临床等效剂量菟丝子总黄酮配伍 1倍临床等效剂量雷公藤多苷片进行减毒作用机制研究。卵巢生殖干细胞自被发现以来，许多学者已经通过原代培养等方法在多种哺乳动物甚至人类卵巢中发现了卵巢生殖干细胞10-11。存在于卵巢皮质层中的卵巢生殖干细胞可通过增殖分化形成生殖细胞使卵巢能始终存在卵泡的更新，从而补充原始卵 泡 池 的 耗 竭3，12。已 有 文 献 证 明，果 蝇 Mvh、Oct4、c-kit、Nanog 等多种生殖细胞和干细胞标志物均在哺乳动物卵巢生殖干细胞中特异性表达13-15。卵巢生殖干细胞作为女性生殖的源头，是生殖毒性研究的新靶点，但目前尚无从卵巢生殖干细胞角度研究雷公藤的生殖毒性实验。本实验首次从卵巢生殖干细胞角度探索雷公藤多苷片对雌性生理小鼠的生殖毒性。结果表明雷公藤多苷片低剂量对卵巢生殖干细胞标志物的表达有降低趋势，雷公藤多苷片高剂量可显著降低 Mvh、c-kit、Nanog的表达水平，菟丝子总黄酮低剂量可显著升高 Mvh、c-kit、Nanog 的表达水平，菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片后可显著升高雷公藤多苷片对卵巢生殖干细胞标志物表达水平的降低趋势。提示菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片对女性生殖毒性的作用可能通过干预女性生殖的源头卵巢生殖干细胞途径相关。Notch信号通路参与卵巢生殖干细胞的不对称分裂，在生殖干细胞增殖、分化和凋亡过程中起着关键性的作用16。研究发现，Notch 信号通路参与卵巢内的卵泡启动和发育，当抑制 Notch 信号后小鼠卵巢内原始卵泡形成减少17。Notch信号通路包括 Notch 配体、Notch 受体以及下游分子18，目前研究 者 已 在 哺 乳 动 物 体 内 发 现 了 4 种 同 源 受 体（Notch1-Notch4）和 5 种 同 源 配 体（Delta1-Delta3、Jagged1-Jagged2）19，而 Notch 通 路 的 重 要 配 体Jagged1 与膜受体 Notch1 结合，经一路信号转导最终激活效应靶基因 Hes1、Hes5，调控细胞的增殖与分化20。Notch信号通路与哺乳动物卵巢功能关系密切，参与调控卵巢生殖干细胞的增殖、分化。本实 验 研 究 发 现 雷 公 藤 多 苷 片 低 剂 量 对 Notch1、Hes1、Jagged1 的表达有降低趋势，雷公藤多苷高剂量可显著降低 Notch1、Hes1 表达水平，菟丝子总黄酮低剂量可显著升高 Notch1、Hes1 表达水平，菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片后可不同程度显著升高其对 Notch1、Hes1 的表达水平的降低，提示菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片可能通过 Notch信号通路参与调控女性生殖的源头卵巢生殖干细胞途径。卵巢功能的衰老和生殖能力的下降，主要原因表 4雷公藤多苷片及菟丝子总黄酮对小鼠卵巢组织中 Notch信号通路分子的影响（x s，n=10）Table 4 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets and Cuscutae Semen total flavonoids on ovarian Notch signaling pathway molecule in mouses（x s，n=10）组别正常组雷公藤多苷片低剂量组雷公藤多苷片高剂量组配伍组菟丝子总黄酮低剂量组菟丝子总黄酮高剂量组剂量/mg kg-113.6527.313.65+150150300Notch1/110221 962.581 726.3418 255.172 194.2614 032.23326.302）24 575.483 052.764）27 842.601 600.331）24 181.231 326.93Hes1/110219 974.23.1 472.3817 640.90577.8915 431.57950.932）22 484.181 921.453）24 406.372 748.142）22 769.00554.18Jagged1/110221 624.531 315.8018 838.371 424.6417 870.382 364.3122 432.071 859.4523 290.742 442.9522 361.781 350.29注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与雷公藤多苷片低剂量组比较3）P0.05，4）P0.0114第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023正是原始卵泡池的消耗远远多于卵巢生殖干细胞的补充，最终造成原始卵泡池的耗竭。因此，卵巢生殖干细胞与卵巢的功能密切相关。Notch信号通路在多种体干细胞的增殖和分化中发挥重要作用。有实验研究表明，在不孕和衰老小鼠卵巢皮层中，卵巢生殖干细胞标志物 Mvh、Oct4 及 Notch 信号通路分子Notch1、Hes1的表达量均显著下降，鉴于此，通过预实验对 5、7 周的小鼠卵巢上皮生殖干细胞标志物Mvh 的表达进行对比研究，选择了表达量较多的 5周龄小鼠作为实验对象21。本实验着重探讨菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片对雌性生理小鼠卵巢生殖干细胞的作用及机制，为了更符合雷公藤多苷片的临床实际使用情况，课题组亦在开展菟丝子总黄酮配伍雷公藤多苷片对关节炎大鼠病理模型体内卵巢生殖干细胞的作用及机制研究，并拟通过其对生理和病理模型的对比研究探讨雷公藤多苷片女性生殖损伤是否符合中医“有故无殒”的学术思想。利益冲突 本文不存在任何利益冲突。参考文献 1徐颖，樊媛芳，赵元，等.近 40 年雷公藤生殖毒性研究概述 J.中国中药杂志，2019，44（16）：3406-3414.2崔瑞琴，丁樱.菟丝子总黄酮对雷公藤多苷片所致生殖损伤雌鼠卵巢损伤表达的影响 J.辽宁中医药大学学报，2009，11（8）：246-247.3JOHNSON J，CANNING J，KANEKO T，et al.Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovaryJ.Nature，2004，428（6979）：145-150.4TANG Z，WEI J，YU Y，et al.Gamma-secretase inhibitor reverts the Notch signaling attenuation of osteogenic differentiation in aged bone marrow mesenchymal stem cellsJ.Cell Biol Int，2016，40（4）：439-447.5ZYGMUNT D A，SINGHAL N，KIM M L，et al.Deletion of pofut1 in mouse skeletal myofibers induces muscle aging-related phenotypes in cis and in transJ.Mol Cell Biol，2017，doi：10.1128/MCB.00426-16.6MANOKAWINCHOKE J，NATTASIT P，THONGNGAM T，et al.Indirect immobilized Jagged1