烟酰胺高产菌种筛选及烟酰胺检测生产工艺优化正稿模板.doc

高酶活烟酰胺生产菌株筛选及腈水合酶催化反应条件优化摘要烟酰胺作为B族维生素关键组员，参与了机体内两种关键辅酶形成。烟酰胺作为关键营养性添加剂被广泛应用于应用于饲料生产行业，其在医药、食品、化妆品行业应用前景也很宽广。在工业生产方面，大家关键利用化学法和微生物法进行烟酰胺生产。烟酰胺微生物生产法有着化学法无法比拟优越性，此方法对环境几乎不造成污染，且生产成本低，工艺简便。在本试验中，关键以下四个方面进行了试验研究并取得了一定结果：(1) 以试验室现有菌种HD1220为出发菌株，分别使用ARTP诱变、微波诱变、EMS诱变三种单因子诱变和在各因子最好诱变条件下复合诱变，确定了复合诱变最好条件为：ARTP诱变时间240 s；微波诱变强度60 %，微波照射时间90 s，；EMS浓度0.8 %。诱变完成后，筛选出一株能够稳定遗传且酶活高达1764U高腈水合酶活性菌株，和出发菌株相比，诱变后菌株酶活提升了33.13 %，并将该菌株临时命名为NHD-1。 (2)利用HPLC对烟酰胺进行检测，经过对HPLC检测紫外检测波长、流动相流量、流动相百分比三个条件进行单原因优化试验，最终确定HPLC检测烟酰胺各个最优条件为：紫外检测波长为220 nm，流动相流量为0.4 mL/min，流动相中甲醇：水=1：3。在以上条件下，烟酰胺出峰时间为5.306 min，和条件优化前相比，烟酰胺出峰时间显著缩短。(3) 对腈水合酶参与烟酰胺生产过程中酶催化反应条件进行单原因优化试验，我们得出各原因最好条件为：菌体浓度1.8 %，菌龄48 h，底物浓度100 g/L，温度29.5 ，PH 7.4，反应时间30 min，在实际发酵后期应该对产物烟酰胺进行立即分离。经过Plackett-Burman试验设计我们分析出底物浓度、温度和PH这三个原因对腈水合酶酶活有及其显著影响；经过对这三个原因进行响应面优化设计，我们得出了这三个原因最好条件组合为底物浓度98.88 g/L，反应温度29.59 ，PH值7.46。在此条件下酶活响应值为1784 U。对SAS软件统计分析结果进行三次验证试验，得到腈水合酶实际酶活为1775 U，和多元回归分析所得理论值吻合，说明利用响应面法能够很好优化酶催化反应条件。ABSTRACTNicotinamide is a kind of Vitamin B and its very important. In the body, Its one part of the formation of two kinds of coenzyme. Nicotinamide is mainly used in feed industry as nutrition additives, it also has a very broad application prospect in medical industry, food industry and cosmetics industry. In the industrial production of nicotinamide ,we mainly use chemical method and biological method. The biological method has a big superiority that chemical method hasnt it does little harm to the environment and has a lower production cost, and its very simple in process.Under the conditions of laboratory, we mainly carried out our research in several aspects and achieved some results as follows:(1) Started from the strain Norcardia sp.HD9611 we had in the laboratory, we used the method of ARTP mutagenesis, microwave mutagenesis and EMS mutagenesis to make mutagenesis of the strain. The three methods were all used alone. Then we made the composite mutagenesis under best conditions of the three method of mutagenesis. The best conditions of composite mutagenesis were: the time of ARTP mutagenesis was 240 s; the time and intensity of microwave were 90 s and 60 %; the concentration of EMS mutagenesis was 0.8 %. By the mutagenesis we screened one stain whose nitrile hydratase had a very high enzyme activity of 1764 U and the stain had stable heredity. Compared to the stain Norcardia sp.HD9611, the enzyme activity increased by 33.13 %, and we named the stain as NHD-1.(2)In the detection of Nicotinamide, we used the HPLC method. By optimizing the wavelength of UV detection, the flow rate of mobile phase and the proportion of mobile phase in the HPLC assay, we got the best conditions of HPLC method : the wavelength of UV detection was 220 nm; the flow rate of mobile phase was methanol: water=1:3; the proportion of mobile phase was 0.4 mL/min. under these conditions, the peak time of niacinamide was 5.306 min. Compared to the method before optimization we used, the peak time significantly shortened. (3) By optimizing the conditions of catalytic reaction of the nitrile hydratase, we got the best conditions: the concentration of bacteria producing niacinamide was 1.8 %; the fungus age was 48 h; the concentration of substrate was 100 g/L; the temperature was 29.5 ; the PH was 7.4; the reaction time is 30 min, and we should separate nicotinamide late in the actual fermentation. By Plackett-Burman experiment we confirmed that conditions of concentration of substrate, temperature, PH had significant influences on the enzyme activity of nitrile hydratase. By response surface test we optimized these three factors: the concentration of substrate was 98.88 g/L; the temperature was 29.59 ; the PH was 7.46. Under these conditions, we analyzed the enzyme activity is 1784 U. Through verification test, we confirmed the enzyme activity of nitrile hydratase was 1775 U. It was very close to the theoretical value. It showed that the response surface test was a very effective method in optimization of enzyme catalysis.Key word: mutagenes nitrile hydratase enzyme activity HPLC optimization 1序言1.1烟酰胺概述 1.1.1烟酰胺介绍烟酰胺（Nicotinamide）化学名称为3吡啶甲酰胺，又维生素B3英文简称VB3、NSA1。烟酰胺最早从动物肝脏中提取，市场上销售产品多为化学合成品2。烟酰胺分子式图1-1：图1-1 NSA分子式 Fig.1-1 The structure of NSA1.1.2烟酰胺化学性质 烟酰胺为白色针状结晶或结晶性粉末。熔点为128 131 ，沸点为150 160 。烟酰胺极易溶于水，在通常极性有机溶剂溶解，在苯和乙醚中无溶解性3。烟酰胺在空气中对光、热等条件稳定，干燥状态50 以下极其稳定。1.1.3烟酸介绍烟酸又称尼克酸，分子式为C6H5NO2，其整体性质和烟酰胺极其相同，但因为羧基存在造成在一些方面不用和含有酰胺基烟酰胺。二者通称维生素PP（二者混合物），在实际应用中，二者可相互等量替换4。在加热条件下有没有机酸和碱存在条件下，烟酰胺发生水解反应转化为烟酸。烟酸分子式图2图1-2 烟酸分子式Fig.1-1 The structure of niacin1.1.4烟酰胺用途烟酰胺参与生物体内糖原分解、脂类代谢及多种物质氧化作用5。烟酰胺有促进细胞新陈代谢等等作用6。当烟酰胺缺乏时会出现细胞正常代谢不能正常进行，糖原分解受阻等情况而引发糙皮病。在市场上烟酰胺共分为三种：医药级、食品级和饲料。烟酰胺最关键作为营养添加剂在饲料广泛应用，在食品和医药行业关键以维生素形式为大家所使用，烟酰胺在电镀及生化方面也有一定应用7。医学上常见来诊疗糙皮病、口炎、舌炎、肝脏疾病及日光性皮炎药品中均含有烟酰胺，其也被用来降低人体胆固醇和甘油三酯含量8。烟酰胺应用最广泛应用是在饲料工业，其作为关键饲料添加剂而被大量应用9。1.1.5国外和中国烟酰胺生产及消费情况 在20世纪50年代，国外烟酰胺生产已经实现工业大批量生产。现在全世界烟酰胺总产能约为30 kt/a，总产量也突破了20 kt/a10。世界上瑞士、美国、比利时、印度、西班牙等国家为烟酰胺关键产出国等，瑞士龙沙企业（LONZA）、美国Nepera企业、比利时Reilly Tor AG企业等是烟酰胺生产方面巨头，这些企业年产能均在千吨以上，瑞士Lonza企业以35 %生产能力在烟酰胺生产行业首位。烟酰胺消费有40 %50 %作为饲料添加剂应用在饲料生产方面；25 %30 %应用于食品生产加工；20 %25 %应用于医药生产方面。美国年均消费烟酰胺量在约10000 t以上，占世界消费总量二分之一，消费中80 %作为饲料添加剂使用。西欧烟酰胺消费量也很大。烟酰胺关键出口于日本。伴随第三世界国家饲料等工业高速发展，烟酰胺消费量正以每十二个月超出5 %速度快速增加12。中国在20世纪50年代初开始进行烟酰胺生产，首家进行烟酰胺生产企业在上海。中国在70年代烟酰胺年产量仅在100左右，因为此时中国烟酰胺生产还处于刚起步阶段，在设备、规模等方面还存在着很大不足。90年代初，伴随国外优异生产技术引进，中国出现了多家从事大规模生产烟酰胺企业，比较著名有南通醋酸化工股份、广州龙沙精细化工、浙江富阳胜大生化科技、山东潍坊一邦化工科技等13。其中广州龙沙是最早引进国外优异生产技术进行烟酰胺大规模生产企业，它是由中国广药和瑞士龙沙双方合资建设而成，年产烟酰胺达3400 t。到20世纪早期，中国烟酰胺年生产能力超出8000 t企业已经有6家，而且实现了对东南亚地域规模性输出 14。和国外烟酰胺应用一样，中国所消费烟酰胺关键用于饲料工业，比重占到总消费量约80 %。1.2烟酰胺生产工艺1.2.1烟酰胺化学合成法 利用化学合成法进行烟酰胺生产依旧是现在工业上主流工艺。化学合成工艺原材料关键是吡啶类物质，关键利用多种化学物质和吡啶类物质氧化反应来生产烟酰胺。应用氧化方法首先得到烟腈，以后将烟腈在适宜条件下进行碱水解得到烟酰胺1517。在氧化生产过程中，吡啶类物质和烟酰胺原料产出比约为0.95:1，所以工业上烟酰胺产量决定性原因依旧是原材料物质产量。1.2.2烟酰胺微生物发酵法 和化学工艺相比，烟酰胺微生物生产法有着独特优势：（1）反应条件温和，通常在常温常压下既能完成，没有爆炸、污染严重等问题。（2）原材料物质易得且廉价。微生物发酵所用原料通常为淀粉、糖蜜或其它农业副产品，不需要精制处理即可直接用于发酵生产。（3）微生物自主调控。微生物参与反应通常全部有本身酶系或代谢机制调解完成，无需过多认为参与。（4）高度专一性和选择性。因为微生物体内酶含有专一性，所以微生物本身能够专一性对一些复杂化合物进行特定部位等氧化、还原、官能团导入等等反应从而实现生产。（5）环境污染小。微生物发酵工业“三废”对环境污染小，对生物体也基础无害。这是微生物发酵相比于通常发酵最为显著地优越性。（6）此方法投资较小，见效较快，而且在效益方面潜力巨大。所以，针对烟酰胺生产来说，实现微生物发酵生产烟酰胺含有很重大意义，这也将改变烟酰胺生产工业长久以来部分难以改变不利原因18。法国研究员Galzy及其研究组最早提出了烟酰胺微生物发酵方法19，而且在试验过程中确定了烟酰胺发酵菌株。以后经过对微生物转化腈类物质必需腈水合酶进行深入研究，经过研究得出腈水合酶参与反应所需最好条件，该企业实现了腈水合酶活力不停提升，并让丙烯酰胺产量实现三次大幅度提升，到二十一世纪早期，丙烯酰胺产量已经提升到0 t/a。中国利用腈类物质进行工业生产起始于90年代中期，利用微生物转化腈类物质进行丙烯酰胺生产著名企业有江苏如皋化肥厂，江西南昌农科化工 20。1.3腈水合酶介绍1.3.1腈水合酶在微生物界分布腈类化合物通常是由和工业生产中一些物质间反应所产生副产物，这些物质通常含有很高毒性，存在于工业废水，腈类物质极难被分解掉，而微生物体内腈水合酶是腈类物质最好催化剂。腈类物质对人体来说毒性较强，不过这种物质却能够作为碳源或氮源为微生物所利用。自然界中存在能够利用腈类物质微生物种类很多，但通常利用率很低，以后科学家们将这些微生物进行人工驯化培养，经过改变微生物生长条件及代谢机制，实现了微生物腈水合酶活性提升。腈水合酶关键存在于短杆菌属、小球菌属及诺卡氏菌属等等。这些菌属中常见微生物菌株有：Nocardia sp.9611，Brevibacterium imperialis CBS489-74，Rhodocaccus rhodochrous JI， Corynebacterium pseudodiphterium ZBB-41，Breviterium R312，Rhodocaccus sp.N-774，Rhodocaccus sp. YH3-3，Alcaligenes faecalis ARCC8750，Alcaligenes faecalis JM，Pseudonocarda thermophila JCM3095，Becillus sp.BR449，Brecterium sp.CH2 等2125。广泛分布含腈水合酶微生物有着它们相同之处：腈水合酶必需经过澳合作用和特定金属离子结合后才能表现出酶活性，在无金属离子螯合情况下酶活基础为零或极低。现在已发觉能和腈水合酶发生螯合作用螯合因子关键有铁离子和钴离子。含有钴型腈水合酶微生物菌株常见有Rhodococcus rhodochrous JI，Pseudonocarda thermophila JCM3095等；含有铁型腈水合酶微生物菌株常见有Corynebacterium pseudodiphteriumZBB-41等26。1.3.2腈水合酶生物调控能和钴离子螯合腈水合酶是由和两个亚基组成组成一个水溶性蛋白物质，因为酶蛋白产生过程中诱导因子不一样，两个亚基含有了不一样结构，从而造成了不一样种类微生物内腈水合酶分子量差异，比如菌株Rhodococcus sp.N-774体内腈水合酶分子量为70 KDa，而菌株Rhodococcus rhodochrous JI 体内腈水合酶则有520 KDa和130 KDa两种大小27。研究中发觉高酰胺类物质生产能力伴随腈水合酶分子量不一样而出现不一样，通常认为高分子量腈水合酶更适合酰胺生产，这关键是由它高稳定性和高活性决定。 腈水合酶为诱导酶，在特定诱导剂存在下才能产生腈水合酶，以钴型腈水合酶为例，菌体培养期间腈水合酶酶活性和其含量只有在有钴离子存在情况下才会有提升。X射线衍射试验表明，辅助因子钴离子和2个N原子（酰胺基团）和3个S原子（半胱氨酸硫醇盐）形成5个配位键。在透析试验中游离钴离子全部消失，说明酶活性部位已将它们全部结合并在螯合作用下转化为本身关键一环，由此可见钴离子对腈水合酶关键性。从决定腈水合酶基因开始，当基因扩增，转录和翻译过程全部完成后，得到腈水合酶必需结合钴离子才能实现其催化活性，这是我们进行理论研究关键基础。1.3.3腈水合酶反应机理 钴型腈水合酶酶催化反应整个催化机制已经得到了透彻研究.当钴离子进入腈类溶液后，水分子、原料中腈分子和钴离子三者相互结合，氰基中C-N三键在此基础上实现激活并发生水合反应，使得-OH基攻击氰基并和其中C-离子形成一个亚酰胺R-C(-OH)=NH，异构化后亚酰胺即为酰胺类物质 28。 1.4课题研究意义 烟酰胺作为B族维生素关键组员，也是机体辅酶关键组成部分。医药、食品、化妆品和饲料等等领域全部有很广泛应用。伴随社会发展，现在烟酰胺在化妆品生产行业也得到了应用，而其它各行业对烟酰胺需求量也在继续增加。所以，在工业中怎样有效提升烟酰胺产量成为大家重视一个问题。利用微生物法生产烟酰胺是烟酰胺生产一个关键工艺，它含有化工合成生产不含有巨大优势。在此工艺中，微生物菌种活性决定了烟酰胺产量。所以，高腈水合酶活力生产菌株筛选对烟酰胺生产含相关键意义。在生产过程中，大家应该适时对烟酰胺产量及品质进行检测，所以确立一个快速有效检测手段对烟酰胺生产也含相关键意义。1.5课题研究内容本课题关键从试验室已经有菌种出发，利用现有设备、仪器、药品及方法并参阅相关文件资料，独立完成了以下几方面研究工作：1.5.1高腈水合酶活力菌株筛选 利用试验室已含有多种条件及仪器设备，参阅相关资料文件，研究ARTP、微波、甲基磺酸乙酯(EMS)三种诱变剂对试验中出发菌株中腈水合酶活力影响，确定了菌种诱变过程中三种诱变剂各自最好诱变条件。在单原因诱变基础上进行三种影响原因复合诱变试验，经过不停尝试和筛选，最终选育出含有高酶活性烟酰胺产生菌株。1.5.2烟酰胺HPLC检测条件优化。 利用高效液相色谱进行烟酰胺检测，在现有检测条件基础上，经过对高效液相色谱检测中流动相百分比、紫外检测波长、流动相流量、进样量等条件进行优化，确定出烟酰胺检测最好检测条件。1.5.3烟酰胺高产菌株酶催化反应条件优化 经过对菌体浓度、底物浓度、反应温度、PH和菌龄时间五个原因优化试验，确定最好酶反应条件。2 材料和方法2.1 材料2.1.1菌种 诺卡氏菌HD1220，河南大学生命科学院生物工程试验室保藏。2.1.2培养基 活化培养基（g/L）： 葡萄糖10， 酵母膏5，NaCl 1，K2HPO4 2，琼脂 20，pH 7.5，115 灭菌15 min。 筛选培养基（g/L）：3-氰基吡啶 8，葡萄糖 15，酵母膏 3，NaCl 1，MgSO4 0.2，K2HPO4 0.5，琼脂 15，pH 7.5，115 灭菌15 min。种子培养基（g/L）：葡萄糖 15，酵母膏 6，尿素 6，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MgSO47H2O 0.2，谷氨酸钠 1，pH 7.5，115 灭菌15 min。发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 9，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MgSO47H2O 0.5，谷氨酸钠 1，脲 7，钴离子 12 mg，pH 7.5，115 灭菌15 min。2.1.3关键试剂 在试验中应用到关键试剂规格和生产厂家以下表1-1所表示：表2-1 关键试剂规格及生产厂家Tab.2-1 Specifications and manufacturers of main reagent试剂名称型号生产厂家葡萄糖分析纯天津德恩化学试剂酵母膏生化级北京奥博星生物技术企业脲分析纯郑州派尼化学试剂厂磷酸二氢钾分析纯天津科密欧化学试剂磷酸氢二钾分析纯天津科密欧化学试剂硫酸镁分析纯天津科密欧化学试剂谷氨酸钠分析纯天津化学试剂六厂氯化钴分析纯天津德恩化学试剂甲醇色谱级西陇化工股份盐酸分析纯开封东大化工试剂厂3-氰基吡啶化学级郑州派尼化学试剂厂氯化钠分析纯天机科密欧化学试剂琼脂食品级福建莆田联邦琼脂氢氧化钠分析纯郑州派尼化学试剂厂酒石酸钾钠分析纯天津德恩化学试剂苯酚生化级天津德恩化学试剂2.1.4关键仪器在试验过程中所用到关键仪器如表1-2所表示：表2-2 关键仪器型号及生产厂家Tab.2-2 Types and manufacturers of main equipments仪器名称型号生产厂家高效液相色谱仪Waters-1525美国Waters企业常压等离子体诱变育种仪北京思情源生物科技全自动高压蒸汽灭菌锅SX-500日本TOMY企业洁净工作台SW-CJ-2FD苏州安泰空气技术回转式恒温摇床ZWY-2102上海智城分析仪器电子天平FA124上海舜宇恒平科学仪器企业移液器DV-04123大龙兴创试验仪器微波炉KJ23B-DE广东美微波炉制造水浴锅HH-6国华电器紫外分光光度计752N上海仪电分析仪器台式高速冷冻离心机5810R德国Eppendorf股份企业循环水式多用真空泵SHB-III郑州长城科工贸旋转蒸发仪RE-52AA上海亚荣生化仪器厂2.2试验方法2.2.1菌种培养方法 菌种活化：将保藏于超低温冰箱中菌种取出，在30 条件下放置10 min，以后进行梯度稀释涂布平板，以后置于30 恒温培养箱中培养48 h 斜面培养：挑取平板上面生长情况良好菌落转接斜面培养基进行培养，培养温度为30 ，培养时间为48 h。液体种子培养基：斜面培养菌种取一环接入液体种子培养基，以后放入恒温振荡培养箱振荡培养，培养温度为30 ，摇瓶装液量为30 mL，转速为200 r/min，培养时间为36 h。液体发酵培养基：将培养好种子液以5 %接种量接入发酵培养基中培养，培养温度为30 ，摇瓶装液量为30 mL，转速为200 r/min，培养时间为48 h。2.2.2高酶活烟酰胺生产菌种诱变及选育(1)等离子体诱变等离子体关键指电离气体，只有当带电粒子密度达成其建立空间电荷足以限制其本身运动时，带电粒子才会影响整个体系性质，此时才会形成等离子体29。当气体经过电场作用后，基态原子在电子动能、粒子碰撞作用下向高能级跃迁称为激发态。在此过程中，电子、光子、正负离子得以形成。等离子体关键是气体在加热或强电磁场作用下电离产生，关键由电子、离子、原子、分子、活性自由基及射线等组成。其中活性自由基及射线，如紫外线、射线等对微生物含有很强灭杀作用。近20年来，伴随大家对等离子体研究日益深入，它在灭菌和生物诱变方面应用也引发了大家关注。比较普遍采取等离子体消毒装置有高频电磁场、激光和微波等离子体，等离子云有空气、氦气、氮气、氧气、卤素气体等，所研究微生物有大肠杆菌、酿酒酵母、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草杆菌等3133。依据等离子体多种性质，我们对具体试验过程进行了设计，具体步骤以下：(1) 常温等离子体诱变出发菌株制备本试验诱变所用菌株为诺卡氏菌HD1220，保藏于温度为70 超低温冰箱中。将出发菌株从超低温冰箱中取出在平板上活化，在30 培养48 h，以后转接两代，从第三代生长良好平板中挑出菌落最大、长势最好菌落作为出发菌株，转接斜面培养48 h以后，在200 r/min旋转式摇床上震荡培养36 h，将培养好种子液用0.8%生理盐水进行稀释，经过血球计数板镜检试验使菌液浓度控制在108 个/mL。(2) 等离子体诱变 本试验所使用诱变设备是北京思情源生物科技生产常压等离子体诱变育种仪。该仪器所使用气体为氦气，在使用前需先设定气体流量为10 mL/min，打开紫外灯杀菌处理20 min。 取经过稀释处理菌液10 L置于诱变专用载片上，涂抹均匀制成菌膜后进行诱变处理。本装置采取紫外灭菌，以空气为传导介质，在常压下，灭菌室内电极经过特定条件激发产生辉光放电形成等离子体。在射频功率300 W下以60 s为梯度，对样品分别进行60 s、120 s、180 s、240 s、300 s、360 s诱变处理，诱变后样品放入1 mL EP管内，加入1 mL无菌生理盐水震荡洗脱，将洗脱液稀释成10-110-7浓度梯度，取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂布平板，30培养48 h后对平板菌落进行观察统计，以每皿菌落数在100左右为最好浓度，从而计算出不一样诱变时间所对应致死率情况。致死率计算公式为： 致死率=100%存活率 存活率=(诱变后存活菌落数对应稀释倍数) (对照平板菌落数对应稀释倍数)依据致死率和诱变时间对应关系，我们能够制作出致死率曲线。(3)高产菌株初筛在各个诱变时间相对应平板上分别挑出30株不一样形态菌落及一株不经过诱变处理平板菌落接斜面在30 条件下培养48 h，以后转接种子瓶培养36 h后，以5 %接种量转接发酵培养基震荡培养48h测定配活力，要求诱变后酶活高于出发菌株且酶活为其1.1倍以上突变株定义为正突变株，酶活低于出发菌株且酶活为其0.9倍以下突变株定义为负突变株。然后对突变株突变率进行统计，依据统计结果，选择最高正突变率所对应时间点作为诱变处理时间。正突变率计算方法为：正突变率=正突变菌株数突变株总数100%(2)微波诱变利用微波进行菌种诱变是一个新兴诱变手段、微波诱变关键利用微波辐射作用，微波辐射是一个低能电磁辐射，在诱变育种领域，它对微生物含有较强生物效应，这种生物效应关键包含两个方面：热效应和非热效应。热效应关键是指在一定功率和一定频率下，经过电磁辐射对微生物进行照射，引发局部温度上升，从而引发微生物体内部分生理生化反应改变，甚至死亡；非热效应是指在电磁波作用下，尤其是在长时间及低温电磁场作用下，生物体并没有显著温度改变，或生物体本身温度改变在自然范围内，但却能够产生强烈生物效应，并在生物体内产生多种生理，生化功效改变，表现为频率和功率选择性上。因为微波这两种效应存在，从而能够引发生物体内产生一系列正突变效应和负突变效应。在本试验中，菌种诱变所使用微波炉为广东美企业制造型号为KJ23B-DE型微波炉，微波输出功率800 W，频率为2450 MHz。微波炉含有低火、中低火、中火、中高火、高火五种不一样档位，假如设定高火档位为100 %，那么其它四种档位根据前后次序分别为80 %、60 %、40 %、20 %。在试验中，我们从不一样照射强度和不一样照射时间两个方面进行菌种诱变。为了确定微波诱变最好输出功率，我们设定在照射时间为60 s时，取经过稀释菌悬液5 mL于无菌培养皿中，开盖放入微波炉，设定微波炉输出频率分别为20 %、40 %、60 %、80 %、100 %进行照射处理，以后在4冰箱中放置2 h以降低回复突变，然后进行平板培养，并进行摇瓶发酵培养。对经过培养诱变菌株进行存活率及正负突变率进行统计，最终确定出最好照射强度。经过上述试验，我们确定了最好照射强度，在此基础上，将装有5mL稀释菌液培养皿开盖置于微波炉中，设定照射时间分别为30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，进行诱变处理。将诱变后菌种在冰箱中冷藏2 h后进行固体培养并进行发酵培养，统计菌株存活率及正负突变率，最终确定最好照射时间。(3)甲基磺酸乙酯诱变甲基磺酸乙酯是一个在微生物育种领域常见化学诱变剂，简称EMS。EMS是一个关键致癌物，在生物学上，EMS常见作突变体库建立、微生物育种等。EMS对微生物含有诱变效应机理关键是EMS能使基因中鸟嘌呤烷基化，并使烷基化鸟嘌呤和胸腺嘧啶配对，替换了胞嘧啶，从而产生转换型突变效应，另外，因为鸟嘌呤烷基活化造成糖苷键断裂造成在DNA复制过程中碱基对发生替换。EMS诱发这种染色体结构和数量方面改变是其诱变效应关键表现。本试验选择EMS作为诱变因子，首先要确定EMS浓度，因为EMS为液体物质，我们需要从EMS母液出发进行稀释。取0.5 mL EMS溶解于9.5 mL PH为7.2磷酸缓冲液，将其配置成体积分数为5 %EMS母液，震荡摇匀后待用。分别取不一样体积菌液，将其和EMS母液进行混合，混合后浓度分别为0.2 %、0.4 %、0.6 %、0.8 %、1.0 %、1.2 %，将混合液装入无菌三角瓶中，在30 下置于震荡培养箱中震荡培养30 h，最终加入一定量2 %硫代硫酸钠终止反应。将诱变后菌种进行固体培养并进行发酵培养，统计诱变后菌种存活率和正负突变率，确定最好EMS浓度。（4）复合诱变在诱变育种过程中，假如对同一菌株进行长久单一因子诱变，会使该菌种对诱变剂产生“疲惫效应”，从而会是诱变效果大大降低。单一诱变因子长久使用会改变菌株一些生理特征，比如可能会使菌株生长缓慢，代谢效率降低，对于真菌会造成孢子产生量降低，这些负面效应不利于发酵工艺控制。在实际生产中，复合诱变能有效降低这些负面效应。复合诱变包含多个诱变剂前后使用，同一个诱变剂反复使用和多个诱变剂同时使用。大家普遍认为，复合诱变含有显著协同效应，多个诱变剂合理搭配及使用效果要显著优于单一诱变剂诱变效果。在本试验中，复合诱变实在单因子诱变基础上进行，复合诱变所使用诱变剂分别为等离子体、微波和EMS三种因子。取5 mL稀释过菌悬液加入到无菌培养皿内，分别利用以上三种诱变因子在已确定最好条件下进行第一次诱变处理。诱变后，将菌液混合均匀，并将其分成两部分，一部分在30 、200 r/min条件下震荡培养8 h后，利用甘油保藏法进行超低温冷冻保藏，一部分作为出发菌株分别在三个诱变因子最好诱变条件下进行第二次诱变，如同第一次操作，第二次诱变所得菌液也分成两部分，一部分保藏，另一部分作为出发菌株进行第三次诱变处理，将所得菌液进行超低温冷冻保藏。诱变操作完成后，将第一次、第二次、第三次分别保藏突变菌株进行稀释，涂布于含有80 g/L 3-氰基吡啶筛选培养基上进行菌种筛选，挑选生长情况良好菌株转接发酵培养基在30 、220 r/min条件下进行震荡培养，筛选出高酶活菌株，并进行立即保藏。(5)遗传稳定性测定为确保诱变后菌株遗传稳定性，降低回复突变对菌株酶活带来负面影响，我们需将挑选出来酶活性最高3株菌株进行连续传代培养，每代菌株在30 条件下培养48 h，连续传代培养6 次，测定每次传代菌株酶活，并将遗传稳定性改变图绘制成曲线图。依据遗传稳定性曲线图挑选出稳定性良好菌株进行保藏，保藏于设定温度为70 超低温冰箱中。(6)菌株酶活性测定方法在测定菌株酶活性高低时，我们需要严格控制酶反应时间和参与反应酶量。我们定义1 mL发酵液在1 min内催化3-氰基吡啶生成1 mol烟酰胺所需腈水合酶数量定义为一个酶活力单位(U)。测定腈水合酶酶活时，整个反应过程是在磷酸缓冲液中进行。将发酵液进行离心，磷酸缓冲液洗涤两次后，取1 mL菌悬液加入到9 mL质量分数为8 %3-氰基吡啶溶液，再向混合溶液中加入10 mL磷酸缓冲液，混匀后置于30 条件下震荡反应5 min，反应结束后用6 mol/L盐酸溶液终止反应。利用HPLC测定腈水合酶没活力。 2.2.3HPLC检测烟酰胺条件优化现在在烟酰胺检测方面最正确方法是高效液相色谱检测法。高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又称“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“高压液相色谱”。高效液相色谱技术使色谱技术一个关键分支，其所用流动相为液态，利用高压输液系统，将含有不一样极性单一溶剂或不一样百分比混合溶剂、缓冲液等流动相进入装有固定相色谱柱，在柱内完成份离各成份分离，再经检测器检测，从而实现对样品分析检测34。和其它检测技术相比，高效液相色谱有以下特点：（1）流动相为液体，在高压作用下能使各成份快速完成份离。（2）分离效能高。（3）灵敏度高。检测可达成纳米级。（4）应用范围广。在有机化合物中，70 %物质全部能用高效液相色谱法进行检测分析，尤其是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物。（5）分析速度快。通常检测通常能够在几分钟到几十分钟内完成，通常不超出一个小时。但高效液相色谱也有其缺点，高效液相色谱含有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，假如流动相流型有改变，被分离物质任何扩散和滞留全部会显著地造成色谱峰加宽和柱效能降低。现在高效液相色谱作为一个快速、正确、直接检测技术已被广泛应用，尤其是在药品检测方面。通常药品成份全部比较复杂，尤其是中药成份，检测难度比较大。利用高效液相色谱技术能够成功对很多