甘草酸的纯化工艺研究分析模板.doc

河北工大学
毕 业 论 文

作 者： 贾晋阳 学 号：
学 院： 化工学院
系(专业)： 制药工程
题 目： 甘草酸纯化工艺研究

指导者：
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评阅者：
(姓 名) (专业技术职务)

年 6 月 9 日

毕业设计汉字摘要

甘草酸纯化工艺研究

摘要：从6种树脂中经过静态吸附筛选出了ADS-17树脂作为提取纯化甘草酸最好树脂。研究了pH值、上样液流速、上样液浓度、洗脱液浓度、洗脱液用量这五个原因对甘草酸吸附、解吸作用影响，并经过正交试验考察了最好工艺条件。试验结果证实最好吸附条件为：pH值为6.0、上样液流速为2BV/h、上样浓度为10mg/ml；最好解吸条件为：洗脱剂10%乙醇、洗脱液用量234ml。在试验得出最好条件下，甘草酸纯度为65.07%，回收率为61.39%。另外，我们还在氢氧化钠回流条件下进行了甘草酸构型转换，结果表明转构后甘草酸纯度为87.66%，产率44.1%。

关键词： 大孔树脂 吸附 纯化 甘草酸

毕业设计外文摘要

Title The research of the Purification Technology of Glycyrrhizic Acid

Abstract
By static adsorption, ADS-17 resin is filtered as the optimal resin to extract purified glycyrrhizic acid from the six kinds of resins. The study of pH, supernatant flow rate, supernatant concentration, eluent concentration and eluent amount shows these five factors effects on the adsorption and desorption of glycyrrhizic acid, and optimum conditions were investigated by orthogonal experiment. Experimental results showed that the optimum adsorption conditions as follows: pH 6.0, supernatant flow rate for 2BV/h, the concentration of the supernatant for 10mg/ml; best desorption conditions were as follows: 10% ethanol, eluent amount for 234ml. Under optimal conditions droved by experiment, the purity of glycyrrhizic acid was 65.07%, recovery rate was 65.3%. In addition, we completed the structural conversion of glycyrrhizic acid under a condition of sodium hydroxide's reflux; results showed that the purity of glycyrrhizic acid reached 87.66%; recovery rate reached 44.1% after the conversion.

Keywords：Macroporous resins Adsorption Purification
Glycyrrhizic Acid

目 次

1 引言 1
1.1 甘草酸介绍 1
1.2 甘草酸及其生产概述 2
1.3 大孔树脂分离纯化技术 3
1.4 本论文研究内容 3
2 试验原理及材料 4
2.1 试验原理 4
2.2 试验试剂和设备 5
3 甘草酸纯化研究 7
3.1 大孔树脂预处理及再生 7
3.2 甘草酸检测方法确实定 8
3.3 树脂种类选择 9
3.4 甘草酸动态吸附 11
3.5 甘草酸梯度洗脱 14
3.6 18β-甘草酸到18α-甘草酸构型转换 17
4 试验数据和讨论 20
4.1 静态试验结果分析 20
4.2 动态试验结果分析 20
4.3 构型转换结果分析 21
结 论 22
参 考 文 献 23
致 谢 25
附录 26

1引言
甘草酸(GA)，是从甘草根茎中提取出一个高甜度、低热值含有天然活性成份，其在甘草中存在形式关键为钾盐和钙盐，游离甘草酸含量并不多。它植物起源——甘草也是一个中国传统中药，含有悠久使用历史，中医上认为：甘草味甘，是补脾益气，止咳、止痛良药，而且已被美国FDA收录为安全无毒物质[1]。
科学研究表明，甘草中关键成份有甘草酸和黄酮类，含有抗炎、镇咳、抗肿瘤、等作用，有较强人体免疫功效促进作用[2]，在医疗领域含有极高应用价值。所以本文叙述了将大孔树脂用于甘草酸纯化原理、方法及应用，并在此基础上提出本论文研究内容。
1.1 甘草酸介绍
汉字名：甘草酸，又称甘草甜素、甘草皂甙
CAS：1405-86-3
英文名：Glycyrrhizic acid
分子式：C42H62O16
分子量：822.92
化学名：(3β,20β)-20-羧基-11-氧代-30-去甲基-(18α-H)-整齐墩果-12-烯-3β-羟基-2-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸基-α-D-葡萄吡喃糖醛酸[3]
结构式为：

甘草酸是一个三萜皂苷类天然药品，分解温度220℃，在醋酸中为无色柱状结晶，易溶于热水，可溶于热稀醇，但难溶于无水乙醇或乙醚[4]。其关键用途有：
(1)作为高甜度、低热值食品添加剂，可添加于食品、饮料中作甜味剂，或在黄色或棕色食品、饮料中作天然色素[5]。
(2)用于化妆品及卷烟业，可间接增强皮质甾类化合物作用，关键用霜、露、乳液、奶类等化妆品，能降低化妆品毒性，也可用于预防化妆品过敏反应，适于高级发用或肤用化妆品[6]。
1.2 甘草酸及其生产概述
因为甘草成份复杂，仅黄酮类就有150多个成份，其分离、纯化较为复杂、难度较高。现在甘草酸及其盐生产工艺方法较多[7]，其中关键有溶剂法和树脂法二种。
1.2.1 水提法
水提法是使用时间最早,也是最为常见一个溶剂提取法,其特点在于操作简单,成本低廉,但得率较低,据1990年中国药典方法测定，甘草酸得率仅为3%。这是在因为甘草酸中水容性杂质较多，水提法提取出杂质也对应增加,在去除杂质过程中损失了大量甘草酸。
1.2.2 氨性醇提取法
在对甘草酸提取研究中,发觉用含氨0.3%60%乙醇回流，对甘草酸提取含有很好效果。甘草酸得率达10.49%,比水提法提升了两倍,而且避免了糖类、淀粉等水溶性杂质混入,利于深入精制过程。但在加热回流过程中，有氨气逸出会造成环境污染问题，氨损失也不能忽略。
1.2.3 聚酰胺法
将甘草酸粗品制成单铵盐，再吸附在粉末状聚酰胺上，然后洗脱掉杂质,再用极性溶剂洗脱甘草酸单铵盐，最终用强酸型交换树脂脱胺,制得甘草酸。该方法取得甘草酸纯度很高，但操作繁琐，不易进行工业化生产。
1.2.4 离子交换树脂法
该法利用甘草酸中含有3个羧基和离子交换树脂形成离子键，吸附在树脂上,而其它部分不含羧基杂质不能被吸附,进而达成分离目标。日本曾以弱碱性树脂吸附甘草酸, 再用氨水洗脱下来，进而得到纯度较高产品。不过离子交换树脂法处理量小，不宜大批量生产。
1.2.5 大孔吸附树脂法
大孔吸附树脂法是一个较为经济实用方法。通常选择树脂有D101、NKA、X-5、XAD、DA 201和AB-8等。利用大孔树脂空间结构、氢键进行吸附,以水或稀低级醇洗脱,搜集洗脱液,回收溶剂后可得到较高纯度甘草酸。该法优点在于操作简单、易于大批量生产，大孔树脂可反复使用，缺点是即使回收溶剂，消耗乙醇依旧较多，需要控制成本[8-10]。
1.3 大孔树脂分离纯化技术
大孔树脂（macroporous resin）作为一个新材料，多年来已广泛应用于天然产物分离,已成为分离有机化合物尤其是水溶性化合物一个有效手段。大孔树脂对甘草酸粗品吸附量较大,且能再生并反复使用。该方法操作简便，成本低，是现在纯化甘草酸经济有效方法。
据报道，20世纪80年代日本首先采取大孔树脂来分离纯化甘草酸，而且使收率显著提升，成本也降低了。随即中国也对该项工艺路线进行了相关研究，但因为商业机密等原因披露较少。所以，即使中国甘草出口量很大，但多为原料粉或浸膏等初加工产品，不仅工艺落后，而且对环境也有严重污染。所以，我们设计了这个试验，研究多个大孔树脂对甘草酸分离纯化效果，改善纯化甘草酸工艺条件[11-13]。
1.4 本论文研究内容
大孔树脂应用于甘草酸分离已快要20年[14]，但纵观现有文件不难发觉，很多大孔树脂发觉时间较早，即使研究较为透彻，但分离纯化效果已经落后于新型选择性大孔吸附树脂，所以有必需对其进行重新研究。
本论文关键试验内容：
1、利用静态吸附试验，筛选出吸附量和纯化程度比较高大孔树脂。
2、经过动态吸附试验，确定大孔树脂泄漏点，进而计算吸附量，并取得影响吸附量具体试验原因。
3、经过梯度洗脱试验，确定洗脱剂最好洗脱浓度。
4、由解吸试验，取得洗脱液中甘草酸含量分布，绘制解吸曲线。
5、最终将纯化后甘草酸置于碱液中蒸煮，将含有毒副作用18β构型，转变为含有疗效18α构型。

2试验原理及材料
2.1 试验原理
本试验以低含量甘草酸为原料，利用大孔树脂空间结构对甘草酸及杂质吸附能力差异，从甘草酸粗提液中选择性吸附甘草酸，再经过吸附和解吸附过程，用一定浓度乙醇溶液将其从树脂柱中洗脱下来，从而达成分离纯化甘草酸目标。
由甘草酸结构上看能够发觉，甘草酸分为两个关键部分，一部分是由五环三萜组成疏水基；另一部分为两个葡萄糖环组成亲水基，这就造成了甘草酸不仅含有疏水性还含有亲水性。而大孔树脂是吸附性和筛选性相结合分子分离材料,其吸附性是因为范德华力或氢键作用，而筛选原理由树脂本身孔型结构所决定[15]。所以，需要筛选出孔径大小和甘草酸近似，孔隙率较高，在水中易于和甘草酸经过范德华力或氢键结合，在一定浓度乙醇溶剂中易于和甘草酸分离大孔树脂。

2.2 试验试剂和设备
2.2.1 试验试剂
名称
等级
生产厂家
甲醇
色谱纯
天津市康科德技术
磷酸
色谱纯
天津市康科德技术
乙腈
色谱纯
天津市科密欧化学试剂
乙酸铵
分析纯
天津市化学试剂一厂
冰醋酸
分析纯
天津市科密欧化学试剂
氢氧化钠
分析纯
天津市科密欧化学试剂
碳酸氢钠
分析纯
天津市天大化工试验厂
氯化钠
分析纯
天津市风船化学试剂科技
甲酸
分析纯
天津市化学试剂一厂
正丁醇
分析纯
天津市科密欧化学试剂
乙酸乙酯
分析纯
天津市科密欧化学试剂
氨水
分析纯
天津市科密欧化学试剂
无水乙醇
分析纯
天津市风船化学试剂科技
无水甲醇
分析纯
天津市江天化工技术
浓硫酸
分析纯
天津市光复精细化工研究所
甘草酸80%

西安融升生物科技
甘草酸25%

西安融升生物科技
甘草酸单铵盐

成全部曼思特生物科技
盐酸

蒸馏水

2.2.2 试验用树脂
牌号
树脂结构
极性
粒径范围（mm）
平均孔径（nm）
孔隙率
（%）
比表面（m2/g）
X-5
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
非极性
0.3-1.25
29-30
50-60
500-600
AB-8
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
弱极性
0.3-1.25
13-14
42-46
480-520
NKA
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
非极性
0.3-1.0
20-22
-
570-590
ADS-17
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
中极性
0.3-1.25
25-30
45-50
90-150
D101
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
非极性
0.3-1.25
25-28
42-46
600-700
D4020
-
非极性
0.3-1.25
10-10.5
-
540-580

2.2.3 试验设备
名称
型号
生产厂家
循环水真空泵
SHZ-D（Ⅲ）
巩义市英峪予华仪器厂
层析柱
φ2.2×30cm

旋转蒸发器
RE52CS
上海亚荣生化仪器厂
恒温水浴锅
B-220
上海亚荣生化仪器厂
色谱泵
LC-10ATvp
日本岛津
色谱控制器
AT-530
Auto Science
紫外检测器
SPD-10Avp
日本岛津
色谱泵
600
Waters
色谱控制器
600
Waters
二极管阵列检测器
2996
Waters
薄层层析硅胶板
GF-254
青岛海洋化工厂分厂
超声波清洗器
PS-10A
东莞市洁康超声波设备
紫外分析仪
ZF7
巩义市予华仪器有限责任企业
玻璃点样毛细管

华西医科大学仪器厂

3甘草酸纯化研究
3.1 大孔树脂预处理及再生
3.1.1 大孔树脂预处理[16-19]
工业级新树脂在工厂被合成出来后不能直接使用，使用前需要用部分方法进行预处理，以除去树脂中所含少许低聚物，有机物及有害离子，才能确保其理化特征符合要求。以下为通常树脂预处理步骤：
① 以丙酮为溶剂浸泡树脂24h(1BV为1个树脂床体积)。
② 用2BV乙醇以2BV/h流速经过树脂柱,并浸泡树脂4～5h。
③ 用乙醇2BV/h流速洗涤树脂，至流出液加水不呈白色混浊为止，再用蒸馏水以一样流速洗净乙醇。
④ 用2BV5%HCl溶液以4～6BV/h流速经过树脂层，并浸泡树脂2～4h，以后用水以一样流速洗至出水pH中性。
⑤ 用2BV2%NaOH溶液以4～6BV/h流速经过树脂层，并浸泡树脂2～4h，以后用水以一样流速洗至出水pH呈中性。
将处理完树脂置于水环境中密封保留，备用。
3.1.2 大孔树脂再生
树脂反复使用数次后，会在其表面或内部残余很多非吸附性杂质或吸附性杂质，造成树脂颜色加深，吸附能力下降，柱效降低。所以，需要对大孔树脂进行再生处理。
处理前首先要明确树脂中残留物种类，最常见是树脂受到有机物污染，能够用1%NaOH、10%NaCl盐碱混合溶液浸泡处理。若是因为大孔树脂放置时间过久，受到微生物污染后，可重新进行预处理或用小于1%双氧水溶液浸泡、水洗即可。若大孔树脂失水变干时，能够用乙醇浸泡，然后再水洗。若树脂受到铁污染时，能够用4~10%盐酸溶液浸泡处理[20]。
3.2 甘草酸检测方法确实定
3.2.1 TLC法
取甘草酸粗品2.0g用10ml70%乙醇溶解，置于温包上加热5分钟，然后趁热过滤，得到红棕色溶液作为原料对照品。配制展开剂正丁醇：水：冰醋酸=4:2:1和4:1:1[21]，取对照品和标准品点板，用两种展开剂展开，在紫外灯光下观察。展开剂为正丁醇：水：冰醋酸=4:2:1硅胶板有拖尾现象，展开时间约为2小时；展开剂为正丁醇：水：冰醋酸=4:1:1硅胶板分离很好，Rf约为0.6，展开时间约为1.5小时。
3.2.2 HPLC法
色谱条件为流动相：甲醇：0.2%mol/L醋酸铵：冰醋酸=67:33:1检测波长为254nm[22]，流量1.0ml/min,柱温维持在28-30℃。先由标准品进样，取得甘草酸保留时间。再用处理过原料对照品进样，和标准品谱图对比取得原料中甘草酸含量。
结果发觉在甘草酸高效液相色谱上，邻近甘草酸位置存在很多杂质峰，TLC法得到点不能说明只存在甘草酸，还可能存在和甘草酸类似杂质，该方法不能用于甘草酸定性分析。所以只选择HPLC法进行检测。
3.2.3 流动相选择
依据文件记载，甘草酸高效液相色谱使用流动相关键分为两类，一类为乙腈体系，即乙腈：0.1%磷酸=35：65；另一类为甲醇体系，即甲醇：0.2%mol/l乙酸铵：乙酸=67：33：1[23]。我们将两种体系全部用于高效液相色谱检测，发觉乙腈体系峰形很好，杂质峰较少，保留时间较长，出峰时间较晚，不过因为乙腈毒性较大，价格较贵，和甲醇换相时易产生气泡阻塞泵体。甲醇体系保留时间较短，峰形较乙腈体系差，但杂质峰较多，更能说明样品中甘草酸实际含量，且较短保留时间有利于缩短检测时间增加检测效率。
在流动相为甲醇：0.2%mol/l乙酸铵：乙酸=67：33：1中，甘草酸峰值和杂质峰未完全分开，积分结果不正确。所以，我们调整了流动相百分比，甲醇：0.2%mol/l乙酸铵：乙酸=60：40：1，保留时间变长，甘草酸峰值和杂质峰分离不理想。将流动相百分比调整为甲醇：0.2%mol/l乙酸铵：乙酸=65：35：1，保留时间对应变短，用原料进样，甘草酸峰周围未发觉杂质峰。
所以，确定高效液相色谱流动相为甲醇：0.2%mol/l乙酸铵：乙酸=65：35：1。

3.3 树脂种类选择
正确称取六种大孔树脂（AB-8、ADS-17、D4020、X-5、D101、NKA）各5g，分别置于100ml锥形瓶中，加入25%甘草酸原料30ml，浓度10mg/ml，静置二十四小时，期间摇动几次，取少许上层清液检测甘草酸含量，结果发觉六组试验均未检测到甘草酸。
继续向锥形瓶中加入25%甘草酸原料20ml，浓度10mg/ml，静置二十四小时，期间摇动几次，取少许上层清液检测甘草酸含量，发觉 AB-8、D4020、X-5、NKA中均检测到甘草酸，在ADS-17和D101中则均未检测到甘草酸。
再次向锥形瓶中加入25%甘草酸原料20ml，浓度10mg/ml，静置二十四小时，期间摇动几次，取少许上层清液检测甘草酸含量，在ADS-17和D101中仍然未检测到甘草酸。
最终向ADS-17和D101组锥形瓶中加入25%甘草酸原料20ml，浓度10mg/ml，静置二十四小时，期间摇动几次，取少许上层清液检测甘草酸含量，ADS-17中检测到甘草酸含量为0.81%，D101为0.01%，可认为这两种树脂已经达成泄漏点，ADS-17静态吸附量为88.37mg原料，D101静态吸附量为89.98mg原料。
GA0.81%

图1 ADS-17泄漏点HPLC图
GA0.01%

图2 D101泄漏点HPLC图
所以，选择ADS-17和D101树脂进行动态试验。
3.4 甘草酸动态吸附
3.4.1 ADS-17动态吸附试验
设定pH（5.0、6.0、7.0）、原料流速（1BV/h、2BV/h、3BV/h）、上样浓度（5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml）为试验原因，绘制三原因三水平正交试验表。
表1：ADS-17动态吸附正交试验原因水平表
序号
A
pH
B
原料流速（BV/h）
C
上样浓度（mg/ml）
1
5.0
1
5
2
6.0
2
10
3
7.0
3
15

取ADS-17树脂540ml，平均装入9根层析柱中，即填料体积为60ml(1BV)。配制多种pH和浓度原料液3BV，以设定条件进行试验，用一组13ml西林瓶盛接原料流出液，检测各瓶中甘草酸含量，确定各组试验泄漏点，并计算吸附量。
表2：ADS-17动态吸附正交试验表
试验号
A
B
C
吸附量（mg）
1
5.0
1
5
1015
2
6.0
2
5
1565
3
7.0
3
5
365
4
6.0
1
10
1770
5
5.0
2
10
720
6
7.0
3
10
1180
7
7.0
1
15
1095
8
5.0
2
15
1290
9
6.0
3
15
1485

表3：ADS-17动态正交试验结果总结表
项目
pH项
原料流速项
上样浓度项
K1（mg）
3485
3880
2936
K2（mg）
4820
3575
4045
K3（mg）
2171
3021
3870
1（mg）
1162
1293
979
2（mg）
1607
1191
1348
3（mg）
724
1007
1295
R（mg）
883
286
369

对于该动态吸附试验，其中吸附量计算公式：
（1）
C——上样浓度，单位mg/ml
n——泄漏点所在瓶号（13为每个西林瓶体积）
计算举例：
在第4组试验中，由HPLC检测得出第9瓶出现泄露，则在第4组试验条件下，甘草酸吸附量为
（60+13×9）×10=1770mg
其它试验组吸附量以一样方法计算。
当pH=5时，三组吸附量加和为K1=1015+1180+1290=3485mg，而1= K1/3=1162mg。
同理能够计算出正交表中其它各原因水平下吸附量总和K及平均值。
pH原因下极差计算公式：
（2）
即R =1607-724=883。
同理以一样方法可计算原料流速和上样浓度极差。
所以在三个影响原因中，pH是最关键影响原因，其次为原料流速，上样浓度影响最小，最好条件组合为A2B2C2，即ADS-17树脂选定最好试验条件为pH=6.0，原料流速2BV/h，上样浓度C=10mg/ml。
3.4.2 D101动态吸附试验
设定pH（5.5、6.0、6.5）、原料流速（1.5BV/h、2.0BV/h、2.5BV/h）、上样浓度（8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml）为试验原因，绘制三原因三水平正交试验表。
表4：D101动态吸附正交试验原因水平表
序号
A
pH
B
原料流速（BV/h）
C
上样浓度（mg/ml）
1
5.5
1.5
8
2
6.0
2.0
10
3
6.5
2.5
12

取D101树脂540ml，平均装入9根层析柱中，即树脂床体积为60ml(1BV)。配制多种pH值和浓度原料液5BV，以设定条件进行试验，搜集原料流出液，检测甘草酸含量，确定各组试验泄漏点[24]。
表5：D101动态吸附正交试验表
试验号
A
B
C
吸附量（mg）
1
5.5
1.5
8
1728
2
6.0
2
8
1936
3
6.5
2.5
8
2048
4
6.0
1.5
10
2290
5
6.5
2
10
2410
6
5.5
2.5
10
1900
7
6.5
1.5
12
2280
8
5.5
2
12
1968
9
6.0
2.5
12
1968

表6：D101动态正交试验结果总结表
项目
pH项
原料流速项
上样浓度项
K1（mg）
5596
6298
5712
K2（mg）
6194
6314
6600
K3（mg）
6738
5916
6216
1（mg）
1865
2099
1904
2（mg）
2065
2105
2200
3（mg）
2246
1972
2072
R（mg）
381
133
296

试验数据处理可依据ADS-17树脂方法进行。
从正交试验结果能够看出：原料流速对其影响最大，其次是pH值，最终是上样浓度，最好条件组合为A3B2C2。即D101树脂选定最好试验原因为pH=6.5，流速2BV/h，上样浓度10mg/ml。
3.5 甘草酸梯度洗脱
3.5.1 ADS-17梯度洗脱试验
量取ADS-17树脂60ml(1BV)装柱，配制浓度为10mg/ml甘草酸原料液3BV，调整pH=6.0，以2BV/h流速经过树脂柱，分别用10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各4BV洗脱甘草酸，进行平行试验，检测洗脱液中甘草酸含量，确定最好洗脱浓度。
表7：ADS-17梯度洗脱表
洗脱剂浓度
10%乙醇
30%乙醇
50%乙醇
70%乙醇
90%乙醇
甘草酸含量(%)
34.54
27.32
13.41
9.32
4.03

图3 ADS-17梯度洗脱曲线
由洗脱曲线可知，伴随乙醇浓度增加，甘草酸纯度逐步降低。
试验中发觉，先用水洗后再用乙醇洗脱时，会显著降低色素等水溶性杂质含量，但在溶剂改变时有大量气泡产生，且乙醇浓度越高产生气泡越多，甚至会出现断层，造成乱流或短路，严重影响了柱层析分离效果。该现象出现关键原因是因为乙醇为亲水试剂，和水混合时，混合体积减小，因氢键结合而产生空腔，在树脂床内产生了气泡。所以，用高浓度乙醇洗脱时，在树脂床上层预留一段水溶液，开始时能够减慢乙醇流速，待溶液稳定后再提升至所需流速，现象会改善很多。
3.5.2 ADS-17解吸曲线绘制
取60mlADS-17树脂装柱，称取25%甘草酸1.8g，配制成10mg/ml溶液。以6BV 10%乙醇溶液为洗脱剂，用一组13ml西林瓶盛接洗脱液，检测各瓶中甘草酸含量。以洗脱液体积为横坐标，甘草酸含量为纵坐标，绘制解吸曲线。搜集全部洗脱液，测定甘草酸平均含量为34.54%，旋转蒸发，取得甘草酸粗品0.51g(以纯甘草酸计187mg)，回收率为61.39%。
表8：ADS-17解吸表
洗脱液体积（ml）
26
52
78
104
130
156
182
甘草酸含量（%）
8.72
15.70
23.57
27.57
35.22
49.39
49.71

洗脱液体积（ml）
208
234
260
286
312
338
364
390
甘草酸含量（%）
56.05
65.07
53.98
45.43
38.23
24.25
11.71
3.79

图4 ADS-17解吸曲线
由解吸表可知，洗脱体积在234ml时甘草酸含量已达最高65.07%。
回收率计算：
ADS-17中甘草酸粗品吸附用量为3BV即1.8g，最好吸附和洗脱条件下，甘草酸含量为34.54%，旋蒸得干燥固体质量为0.51g。
甘草酸回收率计算公式：
（3）
M1——洗脱质量，单位g
M2——原料质量，单位g
回收率为（34.54×0.51）/(15.94×1.8)×100%=61.39%
(用HPLC检测甘草酸原料纯度为15.94%)
3.5.3 D101梯度洗脱试验
量取D101树脂60ml (1BV)装柱，配制浓度为10mg/ml甘草酸原料液4BV，调整pH=6.0，以2 BV/h流速经过树脂柱，分别用10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇洗脱甘草酸，检测洗脱液中甘草酸含量，确定最好洗脱浓度。
表9：D101梯度洗脱表
洗脱剂浓度
10%乙醇
30%乙醇
50%乙醇
70%乙醇
90%乙醇
甘草酸含量(%)
2.79
13.89
24.09
23.92
11.74

图5 D101梯度洗脱曲线
取60mlD101树脂装柱，称取25%甘草酸2.40g配成10mg/ml甘草酸原料液，以5BV50%乙醇溶液为洗脱剂，用100ml烧杯盛接洗脱液，检测各瓶中甘草酸含量。以洗脱液体积为横坐标，甘草酸含量为纵坐标，绘制解吸曲线。搜集全部洗脱液，测定甘草酸平均含量为24.09%，旋转蒸发，取得甘草酸粗品1.03g(纯甘草酸计248mg)，回收率为64.9%。
表10：D101解吸表
洗脱液体积（ml）
60
90
120
150
180
甘草酸含量（%）
17.77
35.23
22.06
21.26
7.74

图6 D101解吸曲线
由图可知，洗脱体积在1.5BV时甘草酸含量已达最高35.23%。
回收率计算：
D101中甘草酸粗品吸附用量为4BV即2.4g，在最好吸附和洗脱条件下，甘草酸含量为24.09%，旋蒸得干燥固体质量为1.03g。
甘草酸回收率为（1.03×24.09）/(2.4×15.94)×100%=64.9%
3.6 18β-甘草酸到18α-甘草酸构型转换
3.6.1 甘草酸构型简述
据报道，中国大部分文件认为甘草酸18位氢为α构型，而国外认为甘草酸18位是β构型。我们用纯度为80%甘草酸原料进行全波长紫外扫描，在252nm处和254nm处均发觉吸收峰。即植物甘草中存在两种构型，即18β-甘草酸和18α-甘草酸，其吸收波长分别为254nm和252nm，其中18β-甘草酸占有很大百分比，而18β-构型含有毒副作用，18α-构型含有疗效。所以，有必需对高纯度甘草酸进行构型转换，得到18α-构型较高组分。
总结文件得出，18β-甘草酸能够在氢氧化钠溶液中转变为18α-甘草酸，所以我们设计了合成路线(图7)，成功得到18α-甘草酸单铵[25]。
3.6.2 甘草酸构型转换工艺路线
该路线各步反应条件温和，无特殊和危险反应，工艺步骤图以下：

图7 转构工艺步骤路线图

正确称取18β-甘草酸4.0g，在254nmHPLC为84%， 4mol/l氢氧化钠溶液50ml，置于250ml三口瓶中，加热沸腾，回流2小时，冷却至室温，用稀硫酸调pH至2.0，加入正丁醇萃取，静置，分液，用氨水调pH至8.0，减压蒸发至靠近全干，得18α-甘草酸单铵盐1.8g，相当于甘草酸1.76g在252nm下用高效液相色谱法测得纯度为87.66%，收率44.1%。
(4)
GA27.95%

图8 甘草酸转构前HPLC图（252nm）
GA87.66%

图9 甘草酸转构后HPLC图（252nm）

4试验数据和讨论
本文研究了大孔树脂对甘草酸分离纯化工艺，关键研究了大孔树脂吸附、解吸过程，关键考察了pH值、上样浓度、上样流速、洗脱浓度、洗脱体积等原因对分离纯化效果影响。经过静态吸附试验，初步选择了吸附效果很好两种树脂，再经过正交试验深入对吸附、解吸过程条件进行优化，取得了各个原因对纯化效果影响大小。
4.1 静态试验结果分析
对于静态吸附试验，因甘草酸分子量大，D101和ADS-17含有较为适宜孔径，D101为非极性树脂，ADS-17为中极性树脂，而甘草酸属于三萜皂苷类，三萜为脂溶性成份，通常应选择非极性或弱极性树脂，而皂苷类成份应选择弱极性或极性树脂，正因为甘草酸成份复杂性，可能D101和ADS-17均能用于吸附甘草。查看ADS-17和D101高效液相谱图，D101中甘草酸含量低于ADS-17；而ADS-17周围杂质峰较多，D101杂质峰较少。证实D101吸附量较大，ADS-17选择性较高，而且二者吸附量差异不显著，所以将这两种树脂作为动态试验用树脂进行深入筛选。
4.2 动态试验结果分析
依据ADS-17和D101吸附试验，经过正交试验可知ADS-17最好吸附条件为：pH=6.0，流速2BV/h，上样浓度10mg/ml；D101最好吸附条件为：pH=6.5，流速2BV/h，上样浓度10mg/ml。
依据ADS-17和D101梯度洗脱试验，得出ADS-17最好洗脱剂为10%乙醇，洗脱下来甘草酸纯度为34.54%，依据相同相溶原理，对中极性大孔树脂而言，用极性较大溶剂更易于洗脱，而ADS-17是在AB-8基础上加以修饰氢键型吸附树脂，能和甘草酸分子形成氢键，提升选择性。D101最好洗脱剂为50%乙醇，其洗脱下来甘草酸纯度为24.09%，对于非极性大孔树脂而言，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，所以伴随乙醇浓度提升，洗脱下来色素等杂质会越来越多，当乙醇浓度小于50%时甘草酸洗脱速率较杂质快，当超出50%时，杂质洗脱速率较甘草酸快，所以用50%乙醇洗脱取得甘草酸纯度最高。
依据ADS-17和D101解吸试验，由树脂解吸曲线可知，对ADS-17树脂解吸曲线，在使用234ml(3.9BV)洗脱液时，甘草酸纯度达成最高为65.07%，回收率为61.39%；对D101树脂解吸曲线，在使用90ml(1.5BV)洗脱液时，甘草酸纯度达成最高为35.23%，回收率为64.9%。
4.3 构型转换结果分析
对于构型转换试验，因为试验时间问题仓促进行，没有具体进行设计和总结，该方法完成第一步后，甘草酸结晶中残留溶剂pH值依旧很低，直接干燥后硫酸浓度增加，将使甘草酸碳化，所以需要继续进行萃取和氨化，得到甘草酸单铵盐进行检测。试验结果表明，该方法取得18α-甘草酸纯度较高，但产率较低，可能是因为回流时间较短，反应不完全造成。下一步试验需要对反应时间进行试验，因为试验时间短暂，所以未能对转构条件进行更深入研究，在此深表遗憾。

结 论
经过上述试验结果比较，ADS-17和D101树脂回收率相差不多，而在相同试验条件下，D101纯度远低于ADS-17，所以选定ADS-17为最好树脂。ADS-17树脂是一个中极性氢键型选择性树脂，其本质是以AB-8树脂为基础进行了基团修饰，使其在选择性上含有较高单一性。该树脂曾被用于黄酮类提纯，但还未看到用于甘草酸相关报道。
在对ADS-17树脂解吸研究中，选择10%乙醇作为洗脱溶剂，首先，甘草酸难溶于冷水，溶于热水，所以其在水中溶解度不大，便于对大孔树脂进行解吸；其次，甘草黄酮溶于水，用10%乙醇做洗脱溶剂也降低了一部分甘草黄酮解吸，即使和其它树脂纯化效果相比偏低，但该法避免了乙醇大量使用，可省略溶剂回收步骤，处理了大孔树脂法乙醇消耗量大，成本高缺点，使得该方法工业化更轻易实现。所以，确定纯化甘草酸最好树脂为ADS-17树脂，最好试验条件为：pH值为6.0、上样液流速为2BV/h、上样浓度为10mg/ml；最好解吸条件为：洗脱剂10%乙醇。

参 考 文 献
[1] 张嫱，杨继民.大孔吸附树脂分离纯化甘草酸工艺[J].食品研究和开发，，31（5）：23-25
[2] 苑可武等.甘草酸提取和精制法概述[J].中国医药工业杂志，，33（7）：362-364
[3] 冯福盛等.吸附树脂AB-8对甘草酸吸附性能及其在提取纯化中应用[J].天然药品研究和开发，1997，10（1）：60-64
[4] 付