大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究模板.doc

摘 要
刺玫果学名野蔷薇,又名野刺玫果,山刺玫果,系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫成熟果实。广泛分布于中国东北地域，尤以黑龙江省贮量最为丰富。现代药理学研究表明：刺玫果含有丰富营养成份及生物活性物质，含有健脾理气、养血调经、抗衰老、防治心血管疾病、增强免疫及促智等功效。刺玫果中所含总黄酮类物质含有预防和诊疗高血脂、血栓所致心脑血管疾病功效，且含有高效、低毒副作用优势。所以纯化刺玫果中总黄酮就含有现实科研意义。
现在，常见总黄酮纯化方法有水提醇沉法（水醇法）、醇提水沉法（醇水法）、酸碱法、盐析法、离子交换法和结晶法等。实践表明，这些方法也存在一定不足。多年出现了部分分离和纯化新方法，如絮凝沉淀法，大孔树脂吸附法、超滤法、高速离心法等。
本论文采取大孔树脂法纯化刺玫果提取物中总黄酮。探索洗脱剂、pH值、上样浓度等原因对纯化过程影响。采取紫外分光光度计法对总黄酮含量进行了分析，最终确定了洗脱剂浓度75%、上样PH为5，上样浓度为原液浓度，吸附速率为2Bv/h，洗脱速率为1Bv/h。该纯化方法简单，快捷，纯化效率高，深入拓展了刺玫果应用领域和范围，为刺玫果全方面和综合利用提供科学理论依据。

关键词：刺玫果 总黄酮 大孔树脂法 纯化

Abstract
Rosa multiflorais is the scientific name of Rosa davurica pall，also known as Wild rosa fruit. Rosa mountain fruit,this fruit is the Rosa mountain fruit of Rosaceae genus Rosa.It is growing in east-north China, especially in province of Heilongjiang. Modern pharmaceutical research shows that Rosa davurica Pall contains rich nutrients and bioactive substances, anti-aging, prevention and treatment of cardiovascular disease, enhances immunity and the efficacy of nootropic, etc. Total flavonoids in the Rosa davurica Pall possess the function of prevention and treatment of high blood lipids, thrombosis dued to cardiovascular and cerebrovascular diseases. It has properties like high-efficiency and the advantages of low toxicity side effects.Thus it is worth in doing research on refining total flavonoids in the fruit.
Recently, there are the several common methods in purifying Flavonoids such as water-extracting alcohol-precipitating,alcohol-extracting water-precipitating,acid-base method, saltdopositing,io-exchange and crystallization,and so on.In practice, there is the limit in all these method reported.Some new methods are investigated like flocculation precipitation, macroporous resin absorption,ultrafiltration,high-speed centrifugea- tion, and so on.
　 In this thesis, we report extraction of total flavonoids from Rosa davurica pall by using the method of Macroporous resin.It was investigated basing on how the type of Eluant,PH of solution,concentration of samples influences purification.Using Ultraviolet spectrophotometer method to analyze Flavonoids,This method is to know the content of total Flavonoids by measuring Ultraviolet absorption. As a result, it was found that the concentration of Eluant is 75 % ethanol, pH is 5 and the sample concentration is concentration of original solutionl, Adsorption rate is 2Bv / h, Elution rate is 1Bv/h. This method is simple, rapid and high-efficient. This research have obtained some scientific results which will board the application of Rosa davurica pall .

Keywords：Rosa davurica pall Total Flavonol Macroporous resin purification

目 录
摘 要 I
ABSTRACT II
1绪 论 1
1.1课题背景 1
1.2项目标目标意义 1
1.3相关刺玫果介绍 2
1.3.1药材起源及植物特征 2
1.3.2刺玫果化学成份 2
1.3.3刺玫果药理作用 3
1.3.4刺玫果营养价值 4
1.3.5刺玫果生物学特征 5
1.3.6刺玫果开发前景 5
1.4黄酮类化合物研究 6
1.4.1黄酮类化合物文件综述 6
1.4.2黄酮类化合物分类 6
1.5黄酮类化合物中国外研究进展 7
1.5.1提取工艺研究进展 7
1.5.2精制工艺研究进展 8
1.5.3总黄酮含量测定方法 10
1.5.4分离方法研究进展 12
1.5.5分析判定研究进展 13
2试验部分 15
2.1 试验仪器和设备 15
2.2 试验药品和试剂 15
2.3 试验原理和方法 15
2.3.1试验原理 15
2.3.2 试验方法 16
2.4 试验步骤及试验步骤图 16
2.4.1 试验步骤 16
2.4.2 试验技术路线 16
2.5 试验操作部分 17
2.5.1方法学研究 17
2.5.2大孔树脂法纯化刺玫果总黄酮工艺研究 21
2.5.3大孔树脂静态吸附及解吸 21
2.5.4大孔树脂动态吸附及解吸 23
2.5.5大孔树脂工艺优化研究 24
2.5.6树脂反复性使用 33
3结果和讨论 33
3.1大孔吸附树脂纯化方法讨论 33
3.1.1大孔吸附树脂法 33
3.1.2上样浓度讨论 34
3.1.3吸附速率考察 34
3.1.4解吸乙醇浓度考察 35
3.1.5洗脱速率考察 35
3.1.6洗脱终点考察 35
3.1.7上样液PH值考察 36
参考文件 38
致 谢 39

1绪 论
1.1课题背景
刺玫果学名野蔷薇,又名野刺玫果,山刺玫果,系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫成熟果实。广泛分布于东北及内蒙、山西、河北等省。该果实酸甜可口，含有丰富营养成份及生物活性物质，民间大量采食或用于泡茶、泡酒等。现代研究表明刺玫果含有健脾理气、养血调经、抗衰老、防治心血管疾病、增强免疫力功效，刺玫果中所含总黄酮类物质含有预防和诊疗高血脂、血栓所致心脑血管疾病功效，且含有高效、低毒副作用优势[1]。现在刺玫果正在作为一个天然保健药品被日益重视和广泛开发。
医学研究表明：心脑血管疾病已成为中老年人群中发病率较高一项顽疾。当今社会人口老龄化已成为很多国家面临普遍问题，中国人口老龄化现象也日益突出。所以市场上对诊疗心血管疾病药品需求量很大。鉴于刺玫果中含有丰富总黄酮，开发该药品社会前景和市场前景就很可观。为了提升对该药材质量控制，我们采取大孔吸附树脂法以芦丁为标准品对刺玫果中总黄酮提取进行研究，为提取刺玫果中有效物质提供一定参考。
1.2项目标目标意义
刺玫果含有很高经济价值和营养价值，根、茎、花、果实全部可入药。《中华大辞典》称：刺玫果含有健脾理气,养血调经之功效。前苏联第八、九版药典亦有收载,用于诊疗坏血病。现代医学研究发觉，刺玫果含有抗衰老、抗疲惫、耐缺氧，增强人体免疫功效作用，长久服用能显著提升人体SOD含量 [2]。
据相关资料记载：天然刺玫果是治维生素缺乏症良药，多种制剂可用来诊疗血压、动脉粥样硬化、脑溢血、肝、肾、胃溃疡。还含有显著抗衰老、抗疲惫、抗辐射、耐缺氧、治血栓、降血压、防癌、治癌、强身壮阳、健脑增智、延年益寿作用。由此可见，天然刺玫果是一个不可多得食、药同源宝贵资源[3]。现在刺玫果正在作为一个天然保健药品被日益重视和广泛开发。市场上已出现有以山刺玫果为主研制“刺玫果保健茶”等保健食品及保健饮料, 它又是各类食品不可多得添加剂，也可直接生产果酱、果冻、果脯等食品。临床已研制出以刺玫果为原料“冠心病口服液”等注射液和口服液[4]。
总而言之，刺玫果含有极高营养价值和生理活性，含有宽广市场开发前景。为提升刺玫果提取工艺科学性，特以关键成份总黄酮为考察指标，采取大孔吸附树脂纯化刺玫果中总黄酮，以多个树脂共同吸附黄酮,考察其吸附率及解析率,寻求最优树脂。并深入采取单原因探索试验和正交试验优选其提取工艺最好条件。对刺玫果中总黄酮提取方法做了深入探索，经过试验找出最经济实惠，效率较高方法，能实现实际工业生产。为以后刺玫果综合利用及其相关领域深入研究提供了新思绪,并为刺玫果深入开发应用奠定了良好基础。
1.3相关刺玫果介绍
1.3.1药材起源及植物特征
1．形态特征
野生刺玫果为落叶小灌木，茎直立，多皮刺，株高0.8～2m。根为木质，粗长，暗褐色，枝暗紫色，无毛，小枝及叶柄基部有成正确皮刺，刺稍弯曲或直。叶互生，奇数羽毛状复叶，小叶5～7个，小叶长圆形或阔披针形，长1～1.3cm，宽0.5～1.5cm，先端尖或稍钝,基部圆形或楔形，边缘具细锯齿，正面深褐色无毛，后面灰白色有粒状腺点及短柔毛，叶柄有腺体，托叶宿存。花两性，整齐，花梗稀膨大，花托坛状，稀为杯状，萼裂片5，稀为4，宿存，花单生或2～3朵并生，深红色或绛紫色，直径4cm。果实球形或卵球形，直径1～1.5cm，呈红色或橙黄色，果肉果边萼片基部有茸毛，种实为瘦果，多数包于花托内而成聚合果，果熟时花托肉质，果实为冬不落果。
2．生活环境
野生刺玫果生长于林缘开阔地、河流两岸、山坡灌木丛及杂木林中。阳性树种，喜光，但稍能耐阴，结果生长性状好郁闭度不超出0.3。土壤类型为壤土及沙质壤土，耐瘠薄，在有机质含量很低沙滩地和防洪水坝上生长良好，不宜通透性差粘重土壤，对水分要求不严格，耐干旱，不宜长久水涝环境。以群丛分布为主，极少单生。
1.3.2刺玫果化学成份
刺玫果果实中含有丰富维生素C、氨基酸、有机酸、糖、果胶、类胡萝卜素、酸类化合物、无色花色素、儿茶素、维生素A、B1、B2、K、E、P和黄酮、糅质化合物等多个矿物质[7]。现分类以下：
1.维生素类
刺玫果含丰富维生素（mg/100g）：Vc1274-2264，远高于苹果、橘子、猕猴桃等水果。VA10.90，VE18.75，VB10.32，VB20.40，VP0.54，被成为天然多个维生素浓缩物。
2.矿物元素
从刺玫果干果及鲜果中共检出了28种矿物元素，其中11种为人体必需矿物元素，如钾、磷、钙、钠、镁、锌、铜、铁、锰等。
3.脂肪油
从刺玫果种籽中提取脂肪油关键由高级脂肪酸及呋喃类衍生物组成。已经判定脂肪酸有硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸等，呋喃衍生物有糠基乙酸酯、正己基呋喃、2-呋喃基戊醛等。
4.三萜
该类化合物关键是从刺玫果甲醇提取物氯仿、乙醚及乙酸乙酯萃取部分中分离得到，已报道有：齐墩果酸、白桦脂酸、熊果酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-乌苏酸、19α-二羟基乌苏酸、2α，3α，19α-三羟基乌苏-12-烯-28-酸等。
5.氨基酸
刺玫果含17种氨基酸，包含7种人体必需氨基酸，游离氨基酸总量为273.4mg/100g，水解氨基酸总量为368.6 mg/100g，其中精氨酸含量最高。
6.黄酮
该类化合物是从刺玫果甲醇提取物正丁醇萃取部分中分离得到。已报道到有：金丝桃苷、银煅苷、橙皮苷、槲皮素。
7.鞣质
该类化合物是从刺玫果丙酮提取物部分中分离得到。已报道到有：木麻黄素、刺玫果素、刺玫果素D1、D2、T2，龙芽草素，金樱子素及特有成份1、2、3、6—四氧—没食子酰-β-D—葡萄糖，1、2、3、4、6—四氧—没食子酰-β-D—葡萄糖等。
8.其它
从刺玫果中分离出来还有蜡酸、二十七烷、β-谷甾醇、胡萝卜苷、β-谷甾醇乙酸酯、乙基-β-吡喃果糖苷等单体化合物。
1.3.3刺玫果药理作用
据《中国中药大辞典》记载：花：甘、微苦、温。止血、理气、解郁、调经。治吐血、血崩、肋间神经痛、月经不调、肺结核咳嗽、腹泻。果：酸、温、健脾胃、助消化，用于消化不良、食欲不振、胃腹胀痛、小儿积食、动脉粥样硬化、咳嗽、腹泻及维生素C缺乏症。根：苦、涩、平。止咳祛痰、止痛、止血。用于慢性气管炎、肠炎、细菌性痢疾、胃功效失调、膀胱炎、功效性子宫出血、跌打损伤[8]。经过现在研究者系统药理学研究表明，刺玫果还有以下药理作用[9]：
1.抗衰老作用
刺玫果能提升人和小鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制过氧化脂质（LPO）和脂褐素形成，清除体内有害自由基，从而延缓衰老。黑龙江老年医学研究所对100例健康老人临床测试表明服用刺玫果浸膏粉后，能使68.66%受试者睡眠增加，71.64%食欲增加，64.28%精力增加，70.15%体力增加，62.86%肺活量增加，56.72%听力增加。可见，刺玫果对老年人有很好保健作用[10]。
2.对心血管系统作用
刺玫果水提物及醇提物均可降低大鼠、兔血压及脑血管阻力，增加冠脉流量，抑制血小板聚集，延长凝血时间，抑制血栓形成。临床测试发觉老年人服用刺玫果浸膏粉后，血流速度显著加紧，血液粘度显著下降。以刺玫果为主组成复方制剂诊疗脑血栓、脑动脉硬化及冠心病133例，临床总有效率为83.3%。刺玫果这些作用和所含黄酮化合物相关[11]。
3.增强免疫作用
刺玫果能显著提升小鼠血清半数溶血值，增强机体体液免疫功效。对噪音所致小鼠免疫功效低下有扶正作用，对二硝基亚胺所致大鼠免疫器官胸腺、脾萎缩有显著拮抗作用，并能减轻环磷酰胺化疗及60Co放疗给荷瘤小鼠白细胞数量及免疫器官所造成损伤。
4.抗疲惫、耐缺氧和类性激素作用
刘中申等进行了小鼠荷重游泳试验及减压耐缺氧试验，结果刺玫果组存活时间显著高于空白对照组。临床观察也发觉刺玫果酒剂能显著改善老年人失眠多梦、疲惫健忘及性功效衰退等症状。
5.保肝作用
刺玫果对试验性酒精、氯仿及亚硝酸钠+氨基比林分布引发小鼠肝损伤全部有显著拮抗作用，能抑制这些肝损伤剂对小鼠谷丙转氨酶增高及肝细胞纤维化转变，此作用可能和刺玫果富含齐墩果酸及维生素C相关[13]。
6.防癌作用
氮-亚硝基化合物是一类强致癌物质，人类一些肿瘤发生有着亲密关系。刺玫果可阻断二甲基亚硝胺在动物体内外合成，其阻断率（98.49%）远高于同浓度维生素C阻断率（9.04%）。另外，刺玫果可拮抗放射性辐射引发机体损伤，能预防辐射癌变[14]。
7.促智作用
经过跳台试验、迷宫试验及药品所致记忆障碍试验表明，刺玫果复合制剂能显著提升小鼠记忆力，可对抗东莨菪碱所致记忆取得障碍，对氯霉素引发记忆巩固不良和400mL/L乙醇引发记忆再现障碍亦有拮抗作用[15]。
8.其它
刺玫果有促进动物DNA、RNA及蛋白质合成作用，而且对DNA损伤有一定修复作用。在临床上还应用于诊疗消化不良、气滞腹泻、胃痛、月经痛及顽固性淋病等。
1.3.4刺玫果营养价值
从刺玫果肉成份分析得出，其多种营养及疗效成份含量高，营养全方面。其中维生素C含量高达2720mg/100g，微量元素Se含量高达现在所报道果品、蔬菜及其它食品中极少见高含量。维生素C和微量元素Se是现在所知动、植物中含量最高，微量元素Se 比号称富硒植物中药黄芪（含Se）含量高是十倍[7]。
同时，刺玫果中还含有多个黄酮类物质及本文中未测定其它多个维生素类、活化酶类、药效成份等。称刺玫果为大地果实维生素C之冠和抗衰老药品后起之秀，确是当之无愧。在现代快速发展抗衰老药品研究中，作为人类抗衰老天然添加剂及其综合利用，刺玫果将含相关键意义。
现代药理研究证实有维生素E、维生素C、胡萝卜素、芸香甙类、硒元素及抗氧化酶等，这类抗氧化剂全部有提升肌体免疫力、抗癌、解毒、降低过氧化酯质、降血清胆固醇等作用。刺玫果中维生素E、胡萝卜素含量很高（1956年有报道），山西省医药研究所测试微量元素Se，17种微量元素及总黄酮未见有报道。Se是人体谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）关键组成部分，Se和维生素E、维生素C有协同作用，芸香甙类是维生素C抗氧化剂，多个抗氧化剂共为一体，可显著提升人体抗氧化能力。
在测定刺玫果中维生素C 含量时，我们在相同条件下测定山楂果维生素C含量，发觉山楂果中总黄酮含量远大于刺玫果肉（山楂浓缩汁中总黄硐含量大于280mg/100mL；但在相同条件下，刺玫果中维生素C含量稳定性很好，山楂果维生素C 含量保留率较低，揭示刺玫果中除含有大量类黄酮保护维生素C免受破坏外，可能还含有大量抗氧化酶类如谷胱甘肽还原酶（GSSG-12）、过氧氢酶（CAT）、过氧化物酶（POT）等，可抑制氧化酶系作用。刺玫果集多个抗氧化剂于一身，可谓是天然抗氧化浓缩剂。
多年对刺玫果药理研究表明，刺玫果有显著抗衰老、抗疲惫、抗血栓、耐缺氧及类似性激素样作用。刺玫果水醇提取物有显著降压作用。可护张冠状动脉、增加冠状动脉血流量，降低其阻力，改善心肌营养血流，降低心肌耗氧量及对抗氧化钾，去甲肾上腺素引发血管和脑垂体后叶素引发心肌缺血，使脑动脉压力下降，还可显著抑制血小板聚焦，可用于防治冠心病、高血压、脑血管功效不全，脑血栓和诊疗老年人失眠、健忘、易疲惫及性功效减退等。中医还认为刺玫果性味甘甜，含有健脾气、活血保精功效，可用于消化不良、食积、胃病、妇女经血不调、经络不畅等症状。刺玫果是野生食用果，对人体无毒，毒理试验报道，刺玫果水醇提取液对小鼠试验LD-50为5.5 g /kg.
总而言之，刺玫果是一个很有营养价值及保健作用天然植物。
1.3.5刺玫果生物学特征
野生刺玫果生长于林缘开阔地、河流两岸、山坡灌木丛及杂木林中。阳性树种，喜光，但稍能耐阴，结果生长性状好郁闭度不超出0.3。土壤类型为壤土及沙质壤土，耐瘠薄，在有机质含量很低沙滩地和防洪水坝上生长良好，不宜通透性差粘重土壤，对水分要求不严格，耐干旱，不宜长久水涝环境。以群丛分布为主，极少单生。
野生刺玫果为落叶小灌木，茎直立，多皮刺，株高0.8～2m。根为木质，粗长，暗褐色，枝暗紫色，无毛，小枝及叶柄基部有成正确皮刺，刺稍弯曲或直。叶互生，奇数羽毛状复叶，小叶5～7个，小叶长圆形或阔披针形，长1～1.3cm，宽0.5～1.5cm，先端尖或稍钝,基部圆形或楔形，边缘具细锯齿，正面深褐色无毛，后面灰白色有粒状腺点及短柔毛，叶柄有腺体，托叶宿存。花两性，整齐，花梗稀膨大，花托坛状，稀为杯状，萼裂片5，稀为4，宿存，花单生或2～3朵并生，深红色或绛紫色，直径4cm。果实球形或卵球形，直径1～1.5cm，呈红色或橙黄色，果肉果边萼片基部有茸毛，种实为瘦果，多数包于花托内而成聚合果，果熟时花托肉质，果实为冬不落果。
1.3.6刺玫果开发前景
从上述刺玫果药理作用、营养价值来看，能够知道刺玫果是很有开发价值野生果实资源，现在刺玫果正在作为一个天然保健药品被日益重视和广泛开发，市场上已经出现由该果汁为主开发研制保健食品及保健饮品；临床上也已经研制出以刺玫果为原料注射液及口服液。刺玫果除含有上述药用价值、营养价值外，还含有美容美发作用，刺玫果是富含维生素碱性药品，食用刺玫果花、花粉、果实能中和酸性物质，降低脂肪沉积软化血管和降低血液肌肉酸度，来达成减肥、袪斑、滋美肌肤，补充秀发营养、促进头发黑色素形成，而从刺玫果中提取芳香油，其经济价值高出黄金两倍多，是世界名贵香料。更关键是刺玫果生态价值，刺玫果属蔷薇科，根粗长且坚硬，根系发达，抗逆性和适应性极强，刺玫果喜温暖环境，又耐寒，能在-39℃下安全过冬，南北各地均可栽培，根、花、果实均可入药。因为现在全球生态环境正在恶化，刺玫果生态价值显尤其关键。现在野生刺玫果关键分布于东北及内蒙古、山西等省，其中以黑龙江省最多。现在市场上出现相关刺玫果产品关键是以野生刺玫果为主加工而成。因为刺玫果关键经济价值，假如要大量开发利用刺玫果资源，仅靠野生刺玫果资源是远远不够，必需进行人工栽培。经药理学上毒性试验研究得悉，刺玫果无任何毒副作用。伴随大家对绿色认识，该项资源开发可望有很好前景。
1.4黄酮类化合物研究
1.4.1黄酮类化合物文件综述
黄酮类化合物关键是指基础母核为2-苯基色原酮一系列化合物。现在，黄酮类化合物是泛指两个苯环经过三个碳原子相互连接而成一系列化合物。
黄酮类化合物是植物光合作用产生一大类化合物，是一组存在于植物中天然产物，在自然界中分布广泛。
黄酮类化合物包含：黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷酮类等。广义范围还包含查耳酮、嗅酮、异黄烷酮及茶多酚。黄酮类化合物是一类生物活性强化合物,含有降低心肌耗氧量、防治血管硬化等作用，同时也是一个天然抗氧化剂，含有抗衰老、增强机体免疫力、抗癌防癌功效[17]。
多年来，科学家们发觉黄酮类化合物含有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病、抗衰老等作用，伴随研究方法和技术不停提升，发觉了很多新种类和生理作用，尤其是抗自由基和抗癌、防癌作用，使黄酮类化合物研究进入了一个新阶段，掀起了黄酮类化合物研究、开发、利用热潮。
1.4.2黄酮类化合物分类
依据黄酮类化合物A环和B环中间三碳链氧化程度、三碳链是否组成环状结构、3位是否有羟基替换和B环连接位置等特点，将黄酮类化合物分为以下种类：
1．黄酮类
黄酮类即以2-苯基色原酮为基础母核，且3位上无含氧基团替换化合物。
2．黄酮醇类
黄酮醇类结构特点是在黄酮基础母核3位上连有羟基或其它含氧基团。
3．二氢黄酮类
二氢黄酮类结构可视为是黄酮基础母核2、3位双键被氢化而成。
4．二氢黄酮醇类
二氢黄酮醇类含有环酮醇类2、3位被氢化基础母核，且常和对应黄酮醇类共存于同一植物中。
5．异黄酮类
异黄酮类母核为3-苯基色原酮结构，即B环连接在C环3位上。
6．二氢异黄酮类
二氢异黄酮类含有异黄酮2、3位被氧化基础母核。
7．查耳酮类
查耳酮类结构特点是二氢黄酮C环1、2位键断裂生成开环衍生物，即三碳链不组成环。
8．二氢查耳酮类
二氢查耳酮类为查耳酮α、β位双键氢化而成。
9．其它黄酮类
1.5黄酮类化合物中国外研究进展
1.5.1提取工艺研究进展
现在，相关中国外研究现实状况关键有以下多个方法，现就各方法做简单介绍。
1．热水提取法
热水仅限于提取黄酮甙类，在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等原因。此工艺成本低，安全，适合于工业化大生产。比如：淫羊藿总黄酮(淫羊藿甙及淫羊藿次甙等)提取。
2．醇提法
高浓度乙醇(如90%-95%)适宜于提取黄酮甙元，60%左右浓度乙醇适宜于提取黄酮甙类。在提取过程中，包含冷浸法、渗漉法和回流法，这些方法各有优缺点。冷浸法虽不需加热，但提取时间长，效率低。渗漉法因为保持一定浓度差，所以提取效率较高，浸液杂质较少，但费时较长，溶剂用量大，操作麻烦。回流法效率较冷浸法和渗漉法高，但含受热易破坏成份药材不宜用此法。
3．碱性水或碱性稀醇提取法
因为黄酮类成份大多含有酚羟基，所以可用碱性水（如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液）或碱性稀醇（如50%乙醇）浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。稀氢氧化钠水溶液浸出能力较大，但浸出杂质较多。石灰水（氢氧化钙水溶液）优点是使含有多羟基鞣质，或含有羧基果胶、粘液质等水溶性杂质生成钙盐沉淀，有利于浸出液纯化。石灰水缺点是浸出效果可能不如稀氢氧化钠水溶液，有些黄酮类化合物能和钙结合成不溶性物质，不被溶出。5%氢氧化钠乙醇液浸出效果好，但浸出液酸化后，析出黄酮类化合物在稀醇中有一定溶解度，降低了产品收得率。
4．树脂法和酶法
国外最近采取此法提取工艺，能提升提取物有效成份得率及其在体内吸收效果。先将绿色银杏叶干燥、粗碎，用50%-70%乙醇加热提取。滤除银杏叶，提取液浓缩至二分之一体积以下，冷却，析出脂溶性成份。滤过，给予除去，这步还能除去水杨酸衍生物等杂质。将滤液转移到填充大孔树脂（非极性大孔树脂）柱上，银杏叶提取物被树脂吸附，用水洗柱，再用70 %乙醇洗脱被吸附提取物。日本专利用酶法提取银杏中黄酮类化合物。将预先干燥并粉碎过青银杏叶，用10%-30%乙醇在30-60℃加热回流提取。提取出水溶性有效成份后银杏叶含有油溶性成份，将这种银杏叶放入水或由醇水混合液组成提取液中，加入淀粉部分水解酶和葡萄糖苷酶或转糖苷酶。在不会使酶灭活温度（如30-60
℃）下加热提取液，进行糖苷转移反应，也能够用新鲜青银杏叶醇提取液直接进行酶化反应制备糖苷提取物。采取这种同时提取银杏叶中水溶性和脂溶性有效成份方法，有效成份提取率极高。
5．超滤法
控制超滤膜孔径大小能有效除去煎液中大分子物质，选择适宜孔径超滤膜是提升产品收率和质量关键。80年代后期，采取超滤技术提取黄芩甙，收到很好效果。超滤技术关键特点是分离过程无相改变，耗能低，分离率高，药液温度14℃和pH=15时提得率高。
6．超临界流体提取法
近十年来，伴随超临界流体提取技术快速发展，在天然药用植物有效成份提取中应用越来越广泛。它和上述提取工艺相比较，含有提取效率高、无溶剂残留、天然植物中活性成份和热不稳定成份不易被分解破坏等优点。同时还能够经过控制临界温度和压力改变，来达成选择性提取和分离纯化目标。所以，在当今大家渴望回归大自然时尚中，该提取方法倍受青睐，用超临界二氧化碳提取银杏叶黄酮类成份方法，已受到大家关注，在欧洲已经有专利报道【15】。
1.5.2精制工艺研究进展
1．醇沉
通常水提物杂质较多，浓缩后加入一定浓度乙醇（60%—80%）沉淀可除去蛋白质、多糖等大部分水溶性杂质。此法是现在中药精制最常见方法，优点是操作简单，能有效去除杂质，取得很好澄明度，但可造成药品（如苷类）有效成份不一样程度损失，而一些水中难溶成份如多个苷元、黄酮等在水体液中含量原来就不高，经醇处理后，大部分会沉淀或被沉淀包裹而滤除。所以加入乙醇浓度应依据实际情况确定。
2．膜滤
膜分离法是以超滤路膜为分离介质，以膜两侧压差为推进力，将溶液中混合物分成保留液和经过液两部分，从而相对分子质量分离组分。因为其过程不发生相变，能耗低，有效膜面积大，分离效率高，操作条件温和不需添加化学试剂，尤适于分离热敏性、化学性质不稳定药品。缺点是现在膜材料品种较少，膜孔径分布较宽，性能不够稳定。另外，在中药制剂膜分离过程中，若药液预处理效果不佳，膜面极易污染，膜孔堵塞，是渗透通量下降，生产效率降低，成本上升，膜使用寿命也大大缩短。
3．超速离心
超速离心法是经过离心机高速运转，使离心加速度超出重力加速度，增加沉降速度，从而加速药液中杂质沉淀并将其除去一个方法，含有省时、省力、药业回收充足，有效成份含量高、澄明度高等特点，适适用于分离含难于沉降过滤微粒或絮状物悬浮液。但超速离心法无法除去糖类等杂质，除杂也不完全，所以本法常作为膜分离法前处理工艺。
4．大孔吸附树脂法
大孔吸附树脂理化性质稳定，不溶和酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子低分子化合物影响。大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合分离材料。它吸附性能是因为范德华力或生成氢键结果。筛选原理由材料本身多孔性结构所决定。因为吸附和分子筛双重作用，有机化合物可依据吸附力及相对分子质量大小不一样，被吸附树脂吸附后再经一定溶剂洗脱而被分离[18]。
脂溶性黄酮应选择非极性或弱极性树脂，如D101，AB-8，HPD100，聚酰胺等；黄酮苷等应选择合成原料中加有甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈树脂，如D201，D301，HPD600，NKA-9等。大孔吸附树脂色谱常见洗脱剂包含水、不一样浓度乙醇、甲醇和丙酮等。
5．分子烙印技术
分子烙印技术是在聚合物单体溶液对将要分离目标分子和交联剂中共聚制备得到颗粒介质，然后用水解、提取等方法洗脱除去包埋在介质中目标分子，得到分子烙印聚合物介质，这么当聚合物再碰到目标分子时，便可进行选择性识别。根据单体和模板分子结合方法不一样，分子烙印技术课可分为共价型、非共价型和半共价型，周力等制备了以皮素为模板分子烙印聚合物，从沙洪粗提物中分离提取皮素和异鼠李素2种黄酮，效果良好。分子烙印技术应用中局限有：
（1）大量分子烙印聚合物局限在非极性环境中；
（2）目标分子和分子烙印聚合物结合位结合慢；
（3）分子烙印聚合物含有非均以结合位和可靠近性；
（4）分子烙印聚合物“烙印”容量低，部分结合位常被埋藏在聚合物三维结构中不能得到利用。
6．双水相提取
双水相提取技术是瑞典Per Albersson首先发觉并研究一个分离技术，因为此技术含有对生物产品稳定性好、易放大等优点，在生物大分子如蛋白质、核酸和细胞器等产品中得到广泛应用。20世纪90年代以来，双水相提取还用于天然产物分离纯化。张春绣等取一定量银杏叶浸提液，25℃加到PEG1500/磷酸盐体系双水相系统中，相比为0.56，则黄酮类化合物进入上相PEG，从而将黄酮化合物富集分离，提取率可达98.2%。双水相体系含有分相块，使用温度低，易操作等特点，且所用PEG及盐类对人体及环境无毒害，提取率高，为黄酮化合物富集分离一个有效方法。因为现在对此法研究较少，对中草药提取研究尚处于起步阶段，此技术应用有待深入研究。
7．超临界流体提取法
伴随国际上超临界流体提取技术快速发展，用该技术提取植物中活性成份愈加广泛。和有机溶剂法相比，含有提取效率高、无溶剂残留、活性成份和热不稳定成份不易被分解破坏等优点，经过控制温度和压力和调整改性剂种类和用量，还能够实现选择性萃取和分离纯化。邓启焕等以银杏叶有效成份分离为对象，建立了一套超临界流体小试、中试装置和试验方法，所得银杏叶提取物中黄酮含量为28%，银杏内酯含量为7.2%，均高于国际现行公认质量标准。据夏开元报道，以乙醇和用大孔树脂提取银杏叶精提物，于CO2-FE精制前，毒性成份白果酸含量为2.0%，而用CO2-FE精提后，白果酸含量降低到0.02%。用超临界CO2提取药材中药用成份成为新热点之一。所以，在当今大家渴望回归大自然时尚中，该提取方法倍受青睐，用超临界二氧化碳提取银杏叶黄酮类成份方法，已受到大家关注，在欧洲已经有专利报道。
1.5.3 总黄酮含量测定方法
1.紫外可见分光光度
(1)紫外可见分光光度法:以分子吸收光谱为基础紫外-可见分光光度法含有设备简单、适用性广、正确度和精密度很好等特点，已在中药总黄酮含量分析中发挥着关键作用。它是利用一些物质分子在200～800nm光谱区吸光度来进行分析测定方法。通常以中草药、中药制剂本身所含黄酮类化合物作为对照品，在紫外区或经显色后在可见光区，选择对照品最大吸收波优点进行测定。刘逢芹等用此法测定野葛藤总黄酮含量，测得野葛藤中总黄酮平均含量为3.34%。Chen等以淫羊藿苷作对照，于274nm处分析了精毛淫羊藿及其不一样炮制品中总黄酮含量。
(2)比色法:研究中，我们常向供试品中加入显色剂后测定吸光度以测定其含量，这种紫外可见分光光度方法又称为比色法。黄酮类化合物普遍存在于植物中，至今已证实结构化合物有多个。据文件报道，黄酮类化合物分子中若含有3-羟基、5-羟基或邻二酚羟基，则易于和金属盐类如铝盐、锆盐、锶盐、镁盐等反应，生成有色金属络合物，这些络合物作用在光谱上能产生显著改变，吸收峰红移。常见于黄酮类化合物含量测定金属盐试剂有Al(NO3)3、AlCl3等。
Al(NO3)3比色法是部分药典最常见总黄酮含量检测方法，它关键以Al(NO3)3为显色剂，在碱性条件下，利用其和黄酮形成红色螯合物为特征，以芦丁为对照品，在510nm处测定其吸收度，从而得到待测物质黄酮含量。刘斌等就采取这种方法对蒲黄总黄酮含量进行了测定， 得率为1.17% 。蒋惠娣等测得杭白菊含量为8.07%。而AlCl3比色法和Al(NO3)3比色法类似，即以AlCl3为络合剂，在非碱性条件下络合显色，生成黄色螯合物进行比色测定。刘春宇等采取AlCl3对沙苑子总黄酮含量进行了测定，得总黄酮含量为21.5 mg.g-1。丁明玉等以贯叶金丝桃为研究对象，对总黄酮含量测定多个分光光度法进行了比较研究，最终采取AlCl3比色法，总黄酮得率为36.4%。
中草药成份十分复杂，在进行黄酮含量测定时要依据具体条件选择合适方法。Liu等测定竹叶中黄酮含量时，因Al(NO3)3比色法测量值不稳定，采取过滤除去干扰物质，得到很好收率。郭亚建等曾对Al(NO3)3比色法专属性进行了讨论，发觉含有邻二酚羟基非黄酮类物质在芦丁显色最大波优点(510 nm左右)也有较强吸收，而黄酮类成份黄芩素、山奈酚在此波优点没有吸收。就本人见解，在采取比色法进行测量时， 要注意考察吸光度值稳定性， 在NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系中，碱性条件常常会影响结果正确性和稳定性，只有物质中含有邻二酚羟基，而且邻二酚羟基邻位没有替换时， Al(NO3)3比色法才在510nm左右有最大吸收。
2.薄层扫描法( TLCS)
样品经薄层分离后直接测定或经合适处理后使之显色或产生荧光，在特定波长下用光度计测定其吸光度或荧光强度方法称为薄层扫描法。薄层扫描法含有快速、简便、同时可测定多个样品特点，所以在中药及其制剂研究中含有广泛应用，可进行中药成份研究和含量测定。兰州大学Zhao等就采取双波长薄层扫描法，测定波长265nm，参比波长220nm，在聚酰胺薄膜上展开，同时测定乌贼中三种黄酮苷。因为薄层扫描法快捷方便，所以常见于中药判别。Lin等对两种化橘红进行质量判别时就采取薄层扫描法测定野漆树苷含量，不仅快速、正确而且稳定性、RSD均不逊于高效液相。
3.高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法是在液相色谱基础上引入气相色谱理论和技术，并加以改善而发展起来一个关键分离分析方法。含有分离效能高，分析速度快，灵敏度高等特点。
紫外检测器(UV)是使用最普遍检测器，含有灵敏度高(最小检出量可达