甘草苷抑制吗啡引起的神经损伤作用及机制.pdf

基础研究摘要目的：探讨甘草苷对吗啡引起神经损伤的调节作用及机制。方法：采用侧脑室注射吗啡建立神经损伤模型；腹腔注射甘草苷5 d和10 d，采用病理学观察、蛋白免疫印迹、细胞活力、凋亡及原代神经元分化检测。结果：吗啡处理之后，皮层组织中神经元减少，原代神经元细胞相对活力下降，凋亡数目增加，轴突断裂和胞体缩小；甘草苷给药后，细胞活力显著改善；轴突、树突及胞体结构逐渐完整，细胞凋亡情况减轻；蛋白 Akt 在473位点和PKA在197位点的磷酸化水平下降，自噬相关蛋白Becline和LC3B1/2不变。结论：甘草苷显著抑制吗啡引起的神经元分化抑制和神经元凋亡，这些作用可能是通过甘草苷协同吗啡对Akt通路。关键词甘草苷；吗啡；细胞凋亡；神经元分化中图分类号：R965.2文献标志码：A文 章 编 号：1009-2501(2024)-0554-07doi：10.12092/j.issn.1009-2501.2024.05.010吗啡是目前临床上最常用的作用于中枢神经系统的强效镇痛药物，是阿片类药物的一种，也是目前临床应用最广泛的成瘾物质，研究发现吗啡可以导致多个系统和器官的细胞死亡和凋亡1-2。因此吗啡在发挥镇痛效应的同时，也会诱导神经元的凋亡3-5。甘草苷作为甘草水提液中一个黄酮类化合物，其分子式为C21H22O9，甘草苷药效显著，具有抗溃疡、抗病毒、抗抑郁等作用6-9。在神经系统中，能促进小鼠胚胎脑神经干细胞的增殖，通过减少A25-35引起的神经细胞死亡，保护AD小鼠神经元损伤10。甘草苷可以剂量依赖性地降低痛觉过敏和异常性疼痛，因此，甘草苷对于受损的神经细胞具有一定的修复作用11-12。但对于甘草苷在吗啡引起的神经损伤中的作用及机制没有文献报道。本研究通过在探究甘草苷对吗啡损伤的组织病理形态、原代神经元凋亡和分化、细胞凋亡和自噬相关蛋白表达进行检测，明确甘草苷的治疗作用，为甘草苷的中医药临床防治提供新的思路。1材料与方法1.1实验动物成年、雄性的昆明系小鼠，体重1822 g，购于兰州大学医学院医学实验动物中心。实验动物生产许可证编号：SCXK（甘）2018-0002。饲养于甘肃中医药大学动物房，所有动物按 56 只/笼的密度分笼。饲养温度为（231），光照条件为光照12 h 光照（上午8:30至晚上8:30）/12 h黑暗循环，相对湿度50%60%，实验前至少适应3 d。适应期可自由摄食和饮水。本研究经甘肃中医药大学动物伦理委员会批准（批件文号：2019-084）。1.2试剂与仪器盐酸吗啡：青海第一制药；多聚赖氨酸（Solarbio公司）、青霉素链霉素双抗（元培公司）、高糖培养基（HyClone 公司）、Trition X-100（Solarbio公司），甲醇（天津市北辰方正试剂厂）、四甲基乙二胺（上海中秦化学试剂有限公司）、显色液（Millipore公司）GAPDH和Beclin抗体购自Proteintech公司、AKT（S473-p）、AKT（Total）、PKA（T197-p）、PKA（Total）与LC3B1/2抗体购自美2023-08-23 收稿2023-10-20 修回甘肃省青年科技基金计划项目（1506RJYA170）张建新，男，主管药师，研究方向：神经药理学。E-mail：杨孝来，通信作者，男，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学。E-mail：甘草苷抑制吗啡引起的神经损伤作用及机制张建新，杨孝来甘肃省人民医院药剂科，兰州 730000，甘肃中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办CN 34-1206/R，ISSN 1009-2501http:/2024May;29(5):554-560554中国临床药理学与治疗学 2024 May;29(5)国 CST 公司；Goat Anti-rabbit 1gG/HRP（Bioss 公司）、甘草苷和BCA试剂盒购自Solarbio公司；甲酚紫（中国国药集团）；胎牛血清、B27无血清添加剂、Neurobasal均购自美国Gibco公司。全波长酶标仪（Bio-Rad）；Ci-L 型显微镜（日本 Nikon 公司）；DYY-6C 型电泳仪、WD-9413B 凝胶成像分析仪（北京六一生物科技有限公司）1.3动物分组、造模及给药将30只小鼠随机分为正常组、模型组（Morphine 组）、联合给药（Morphine+Liquiritin）分别处理5 d和10 d；对照组（生理盐水）。除正常组外，其他2组每天侧脑室注射10 g/kg吗啡，甘草苷的剂量来自文献报道13，给药方式为腹腔注射均来自之前的研究，腹腔注射 100 mol/L 甘草苷直至造模成功14。侧脑室注射中15，注射位点位于右脑（距离中缝1.5 mm，距前囱1 mm，距离颅骨表面3 mm深）。使用10 L的微量注射器，每次给药体积4 L，给药速度为10 L/min。在试验结束后，给侧脑室内注射蓝墨水判断位置，检查侧脑室注射位点是否正确。1.4原代神经元培养16实验选用终浓度为0.1%的多聚赖氨酸包被铺24孔培养板，将出生一天的小鼠取出全脑组织，盛有预冷DMEM-高糖的培养皿，分离左右两半球，剥离干净皮层和海马上的血管膜。移入预冷的DMEM-高糖培养基，加入2 mL木瓜酶和适量DNA酶，置于37 温箱中消化约2030 min，加含10%血清的DMEM-高糖培养基终止消化。取上层的单个悬浮细胞重复上述步骤，分步吹打3次。用200目筛过滤后，1 000 r/min，离心5 min后弃上清液。向培养板中加入10%血清的DMEM-高糖培养基并计数24孔板7.5104。24 h之后更换培养液（Neurobasal+30 mmol/L glucose，2 mmol/L L-Glutamine，250 U/mL penicillin-0.25 mg/mL streptomycin and 2%B27Supplement），随后每天观察细胞状态，隔23 d半量换液进行后续实验。1.5Western blotting检测吗啡模型小鼠大脑皮层组织蛋白表达将小鼠为正常组、模型组（Morphine 组）、联合给药（Morphine+Liquiritin）处理5 d；取各组小鼠大脑皮层组织，提取蛋白，用 BCA 试剂盒测定其蛋白含量，95 水浴加热10 min 变性。样品上样，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用湿转法转膜，条件为转膜电压为100 V，时间为90 min。用脱脂牛奶封闭，加入一抗（1:1 000），置摇床上室温孵育过夜；用1TBST溶液洗膜，洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:3 000），孵育1 h，按照显影液说明书以1:1比例配制显影液（现用现配，注意避光），把条带正面朝上放在显影仪内的平台上，其充分反应，在电脑上调整合适的曝光时间可获得所需的图像。Image J软件分析蛋白灰度，计算目的蛋白的相对表达量。1.6皮层和海马组织形态观察小鼠麻醉后，生理盐水和4%多聚甲醛全身灌注，待全身僵硬，小心取出大脑。继续4%多聚甲醛固定72 h，后经20%和30%蔗糖溶液脱水、OCT包埋、冰冻切片，进行尼氏染液染色5 min，蒸馏水洗至玻片流水无颜色。于光学显微镜下观察的组织学形态。1.7荧光显微镜和 MTT 检测细胞凋亡和存活17原代培养的皮层神经元在完全培养基中连续培养 7 d，后将培养基换成没有血清 DMEM处理4 h。吗啡（2.5 umol/L）溶解在DMEM中，待细胞不同条件处理结束后，用将细胞固定在2%多聚甲醛中，用1 g/mL的DNA染料Hoechst 33342染色，然后在荧光显微镜下观察。细胞核碎裂或浓缩的细胞被评分为凋亡。避光条件下加入MTT（浓度为0.5 mg/mL），在37、浓度为5%的CO2培养箱中孵育2 h。吸去培养液，再向每孔加入150 L的DMSO 溶液，需震荡10 min。紫色结晶完全溶解后，要在波长为A490 nm条件下测定其吸光值，设置对照组，测得的吸光值为以对照组基数（100%）。1.8神经元分化的评价16以 75 000 个细胞/mL的降低密度接种细胞，原代培养的皮层神经元在完全培养基中连续培养3 d，后将培养基换成没有血清DMEM处理4 h。吗啡（2.5 umol/L）溶解在DMEM中，待细胞不同条件处理结束后，用将细胞固定在2%多聚甲醛中，从而可以测量单个神经元的轴突发育。通过高灵敏度的倒置显微镜相机在显微镜的最大分辨率。通过追踪每个细胞上的所有突起来测量每个细胞的突起长度使用Adobe Photoshop从细胞体到尖端的单个神经元。1.9统计学处理运用SPSS 23.0软件进行数据555Chin J Clin Pharmacol Ther 2024 May;29(5)统计分析，数据表示为平均数标准差（x s），通过独立样本t检验比较两组间差异，P0.05认为差异具有统计学意义。2结果2.1甘草苷抑制吗啡引起的神经损伤尼氏染色的结果显示：对照组小鼠皮层神经元排列整齐，细胞核呈现出深蓝色或紫色，在吗啡处理5 d之后，阳性细胞明显降低，凋亡细胞明显增多；而在处理10 d之后，凋亡细胞更多；采用甘草苷干预之后，5 d小鼠皮层神经元细胞数目增多，而10d干预之后，恢复效果较弱。在海马结构中，无论是5 d还是10 d吗啡处理以及甘草苷干预并没有明显区别。结果见Fig.1。ControlMorphineMorphine+Liquiri?n5 d10 d5 d10 dFig.1Nissl staining of the cortex and hippocampus in mice after treatment with morphine and liquiritinControl represents physiological saline;Morphine represents morphine;Morphine+Liquiritin represents co-treatment with mor-phine and liquiritin,d represents the number of days of treatment;scale bar represents 200 m.2.2甘草苷抑制吗啡诱导的皮层神经元凋亡利用原代神经元评价吗啡对神经元凋亡的影响，MTT结果显示，甘草苷（10 mol/L）处理组神经元24 h后，细胞相对活力没有显著差异，吗啡（2.5 mol/L）作用于培养7 d的皮层神经元12 h后，细胞相对活力显著低于对照组（P0.01），然而甘草苷和吗啡共同处理的皮层神经元相比吗啡单独处理，细胞活力更高（P0.05）。相同地，使用Hoechst 33342染色皮层神经元，在荧光显微镜下观察，发现对照组及甘草苷组大部分皮质神经元胞核为圆形，边缘光滑，着色均匀，偶有少量凋亡，吗啡组细胞皮质神经元凋亡细胞显著增多，凋亡细胞染色质固缩、呈边缘化分布，染色较亮，胞核着色不均匀，甚至解体，差异具有统计学意义（P0.01）；甘草苷和吗啡共同处理的皮层神经元相比吗啡单独处理，凋亡细胞数量较少（P0.05）。结果见Fig.2。556中国临床药理学与治疗学 2024 May;29(5)DMSOLiquiri?n120100806040200MTT reduc?on(%)Morphine Morphine+Liquiri?ncbeApopto?c cells(%)100806040200DMSOLiquiri?nMorphine Morphine+Liquiri?ncbeDMSOLiquiri?nMorphineMorphine+Liquiri?nABCFig.2Cell viability and apoptosis of primary neurons after treatment with morphine and liquiritinA:fluorescence microscopy of neuron morphology;B:relative cell viability;C:count of apoptotic cells.DMSO serves as the controlgroup,Morphine represents morphine treatment,and Morphine+Liquiritin represents co-treatment with morphine and liquiritin.Scale bar=50 m.bP0.05,cP0.01,compared with the DMSO group;eP 0.05,compared wih the morphine group.2.3甘草苷拮抗吗啡引起皮层神经元分化抑制利用原代神经元评价吗啡对神经元分化的影响，在皮层原代神经元培养3 d，对照组中神经元胞体完整，生长出轴突和树突；甘草苷（10 umol/L）处理组神经元24 h后，统计学发现轴突的长度和胞体的大小没有统计学意义；吗啡（2.5 umol/L）作用于培养3 d的皮层神经元12 h后，轴突长度和胞体大小显著低于对照组（P0.01），然而甘草苷和吗啡共同处理的皮层神经元相比吗啡单独处理，皮层神经元轴突长度和胞体大小更高（P0.05）。结果见Fig.3。DMSO Liquiri?n Morphine Morphine+Liquiri?n120100806040200Neurite length(m)cbeDMSOLiquiri?nMorphine Morphine+Liquiri?n121086420Soma diameter(m)cbeDMSOLiquiri?nMorphineMorphine+Liquiri?nABCFig.3Primary neurons differentiate after treatment with morphine and liquiritinA:neuronal morphology under a microscope;B:length of axons;C:diameter of cell bodies;DMSO is the control group,Morphine ismorphine,Morphine+Liquiritin is the combined treatment of morphine and liquiritin.Scale bar is 30 m.bP0.05,cP0.01,com-pared with the DMSO group;eP 0.05,compared wih the morphine group.557Chin J Clin Pharmacol Ther 2024 May;29(5)2.4甘草苷抑制吗啡引起的神经损伤的信号通路通过 Western blotting 评价甘草苷抑制吗啡引起的神经损伤的蛋白表达情况，选用5 d吗啡处理的皮层组织，与对照相比，吗啡组减弱了磷酸化AKT在473位点的表达，增加了PKA在197位点的磷酸化表达，但对Beclin和LC3B1/2没有明显的影响。另外吗啡和甘草苷协同给药发现，更加减弱了磷酸化AKT在473和PKA在197位点的表达。结果见Fig.4。140120100806040200Beclin levels(%of normalized with control)MorConMor+Li140120100806040200LC3B1/2 levels(%of normalized with control)MorConMor+Li140120100806040200MorConp-Akt/Akt levels(%of normalized with control)Mor+Libb140120100806040200p-PKA/PKA levels(%of normalized with control)MorConMor+LibMorConMor+LiAKT(S473-p)AKT(Total)PKA(T197-p)PKA(Total)BeclinLC3B1/2GAPDHABFig.4Changes in protein expression after morphine and liquiritin treatment in miceA:represents the Western blotting image;B:represents protein quantification.Con stands for physiological saline,Morphine standsfor morphine,and Morphine+Liquiritin stands for co-treatment with morphine and liquiritin.bP0.05,compared with the controlgroup.3讨论吗啡是目前临床上最常用的作用于中枢神经系统的强效镇痛药物，也是目前临床应用最广泛的成瘾物质，研究发现吗啡可以导致多个系统和器官的细胞死亡和凋亡1-2。吗啡有许多药理作用，包括镇静、镇痛、催吐、抑制呼吸等，但吗啡被吸收入血后可以通过血脑屏障直接进入中枢神经系统，从而产生神经毒性，使神经细胞出现功能障碍或坏死，造成永久性功能损伤3-5。甘草苷是从传统中药甘草中提取的一种黄酮类化合物，具有营养神经和保护神经等作用6-8。本研究通过尼氏体染色、原代神经元凋亡和分化检测，发现甘草苷可以显著减小吗啡引起的神经损伤。凋亡是神经元损伤后的一个显著特征，表现为细胞数量减小、细胞核 DNA 断裂等特征18。本文发现吗啡处理小鼠5 d之后，阳性细胞明显降低，凋亡细胞明显增多，另外在原代神经元中，吗啡作用于皮层神经元，细胞相对活力显著低于对照组,通过体内和细胞水平均证明吗啡可以引起神经细胞凋亡，这和之前的研究一致。然而，甘草苷无论是在体内和神经元中都可以抑制吗啡引起的神经元凋亡，但这只是在5 d处理的皮层神经元中，对10 d处理和海马没有明显差异，558中国临床药理学与治疗学 2024 May;29(5)具体机制需要更进一步实验证明。分化是原代神经元生长中重要阶段，特别是轴突的形成是突触的结构基础19。本研究发现吗啡处理的原代皮层神经元轴突断裂，树突消失，胞体减小，说明吗啡抑制了原代神经元的分化，这说明吗啡可能对大脑皮质的轴突、树突和突触数量产生影响，然而，甘草苷可以抑制吗啡引起的神经元分化抑制，降低了轴突的断裂和胞体的缩小。在之前的研究中发现，甘草苷抗凋亡的主要信号为PI3K/AKT信号通路，AKT和PKA信号通路是调控神经元凋亡和分化的主要关键酶20-22，本文发现，甘草苷和吗啡协同给药分别降低了AKT在 473 位点以及 PKA在 197 位点的磷酸化，说明联合给药进一步减弱其信号通路，其具体机制需要进一步证明。自噬是一种保守的分解代谢途径，严格控制着蛋白质周转和溶酶体介导的细胞器降解，对于神经细胞的自我更新和分化、维持细胞内稳态以及正常发育过程中的重塑都是至关重要。本研究证明吗啡和甘草苷并不影响自噬相关蛋白Beclin和LC3B1/2的表达，说明吗啡引起的神经元凋亡和分化抑制不依赖细胞自噬过程。综上所述，本研究结果表明，甘草苷可以显著恢复吗啡引起的神经损伤功能；此外，甘草苷显著抑制吗啡引起的神经元分化抑制和神经元凋亡，这些作用主要是通过甘草苷协同吗啡对Akt通路实现的。本研究结果提示，甘草苷可能对吗啡损伤具有一定的治疗效果。参考文献1 杨梦蝶,吴宁,李锦,等.多巴胺D3受体调控吗啡成瘾行为及其机制J.中国药理学与毒理学杂志,2023,37(7):530-31.2 Gabel F,Hovhannisyan V,Berkati AK,et al.Morphine-3-glucuronide,physiology and behaviorJ.FrontMol Neurosci,2022,15:882443.3 王涛之,李珍珍,刘万能,等.小鼠前扣带回皮质PKG-介导吗啡诱导的痛敏和焦虑样行为J.神经解剖学杂志,2023,39(1)：8-14.4 Zhuang Y,Wang Y,He B,et al.Molecular recognitionof morphine and fentanyl by the human-opioid re-ceptorJ.Cell,185(23):4361-4375.5 李丽,唐琼瑶,阮思蓓,等.多肽P10581对大鼠甲状腺癌转移性骨癌痛的镇痛作用及对吗啡耐受的影响J.现代肿瘤医学,2022,30(21):3868-3873.6 刘梅清,段瑞,孙晓燕,等.超滤-固体膜萃取-反萃取技术制备异甘草苷工艺研究J.中草药,2022,53(15):4673-4677.7 Zaid AN,Al Ramahi R.Depigmentation and anti-agingtreatment by natural moleculesJ.Curr Pharm Des,2019,25(20):2292-2312.8 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themetabolism of phosphoglyceridesJ.Front Pharma-col,2022,12:822154.15赵雪莹,司丽娜,魏萌,等.侧脑室注射促性腺激素抑制激素/RF酰胺相关肽-3对卵巢摘除术后补充雌激素大鼠子宫腔液影响的蛋白质组学分析J.解剖学报,2021,52(4)：499-505.16 Yang S,Pascual-Guiral S,Ponce R,et al.Reducing thelevels of Akt activation by PDK1 knock-in mutationprotects neuronal cultures against synthetic amyloid-beta peptides J.Front Aging Neurosci.2018,9:435.17Cordn-Barris L,Pascual-Guiral S,Yang S,et al.Muta-559Chin J Clin Pharmacol Ther 2024 May;29(5)tion of the 3-Phosphoinositide-dependent protein ki-nase 1(PDK1)substrate-docking site in the develop-ing brain causes microcephaly with abnormal brainmorphogenesis independently of Akt,leading to im-paired cognition and disruptive behaviorsJ.MolCell Biol,2016,36(23):2967-2982.18汪蒙蒙,韩岚,刘竹青,等.细胞凋亡、细胞焦亡、坏死性凋亡异同与交互J.生命的化学,2020,40(11)：1932-1940.19宋祖,荣陈涛.维A酸通过上调脑源性神经营养因子促进小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的研究J.中国临床药理学杂志,2022,38(6):491-494,503.20Jiang R,Xu J,Zhu D,et al.Targeting PI3K/AKT signalingfor treatment of idiopathic pulmonary fibrosisJ.Food 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treat-ment,neuronal loss,decreased cell viability,in-creased apoptosis,axonal breakage,and cell shrink-age were observed in cortical tissue.Glycyrrhizinadministration significantly improved cell viability,and axonal,dendritic,and cell body structuresgradually became intact,with reduced apoptosis.The phosphorylation levels of protein Akt at posi-tion 473 and PKA at position 197 decreased,whileautophagy-related proteins Beclin and LC3B1/2 re-mained unchanged.CONCLUSION:Glycyrrhizin sig-nificantly inhibits morphine-induced neuronal dif-ferentiation suppression and neuronal apoptosis,which may be mediated through the synergistic ef-fects of glycyrrhizin and morphine on the Akt path-way.KEYWORDSglycyrrhizin;morphine;cell apopto-sis;neuronal differentiation560