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基于网络药理学探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病的作用机制及实验验证赵勉1,2,邱雨轩2,胡杨1,2,刘子涵2,王培丽2,陈伟伟3,潘安2,程建明1,2(1.南京中医药大学江苏省经典名方工程研究中心,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;3.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029)摘要:目的 结合网络药理学方法和实验验证探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病(ALD)的作用靶点及潜在机制。方法借助 TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM 数据库及文献报道检索复方鲜石斛颗粒的化学成分,利用 Swiss ADME 数据库筛选优效目标化合物,并通过 Swiss Target Prediction 数据库对活性成分靶点进行预测。通过 GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET 数据库获取 ALD 相关疾病靶点,采用 String 数据库和 Cytoscape 软件构建靶点相互作用网络图(PPI)及“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图,将预测的潜在作用靶点通过 DAVID 数据库进行 GO/KEGG 功能富集分析预测作用机制。构建酒精性肝损伤小鼠模型,通过病理染色、ELISA 检测、qPCR 及 Western blot 来验证网络药理学富集分析结果。结果 通过数据库及文献报道共筛选获得 73 个关键活性成分,与 ALD 交集靶点有720 个,根据P0.05,FDR0.05 的 GO 注释分析得到789 个 BP 信息,93 个 CC信息,204 个 MF 信息,194 个 KEGG 信号通路,主要涉及代谢过程、PI3K/Akt 信号通路、MAPK 信号通路、cAMP 信号通路、钙信号通路等。体内实验表明,与对照组相比,模型组小鼠肝细胞索排列紊乱,肝小叶界限不清,肝细胞出现明显炎性细胞浸润和脂肪空泡,血清中 ALT、AST 活力,肝组织 TG、TCHO 含量及 IL-1、CXCL10、Srebp-1c 的基因表达水平显著升高,CPT1 基因表达水平显著降低,炎症通路蛋白 p-AKT、p-mTOR、p-p65 蛋白表达水平升高。复方鲜石斛颗粒治疗后,小鼠肝细胞炎性细胞浸润和脂肪空泡数量减少,肝脏恢复正常细胞结构,血清中 ALT、AST 活力,肝组织 TG、TCHO 含量及 IL-1、CXCL10、Srebp-1c 的基因表达水平显著降低,CPT1 基因表达水平显著升高,同时 p-AKT、p-mTOR、p-p65 蛋白表达水平也显著降低。结论 复方鲜石斛颗粒能有效改善酒精性肝损伤小鼠的肝脏炎症和脂质代谢,并可能通过调节 PI3K/Akt 信号通路抑制组织炎症。该研究初步揭示了复方鲜石斛颗粒防治 ALD 的作用机制,为临床用药和后续研究提供参考依据。关键词:药食同源;网络药理学;复方鲜石斛颗粒;酒精性肝病;分子机制中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1672-0482(2023)09-0895-05DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2023.0895引文格式:赵勉,邱雨轩,胡杨,等.基于网络药理学探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病的作用机制及实验验证J.南京中医药大学学报,2023,39(9):895-909.598南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期J Nanjing Univ Tradit Chin Med Vol.39 No.9 Sep.2023收稿日期:2023-08-20基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(81803391);江苏省高等学校基础科学(自然科学)研究重大项目(23KJA350003);江苏省研究生实践创新计划项目(KYCX22_2041);国家级大学生创新创业训练计划项目(202210315136Z);江苏高校“青蓝工程”资助项目;江苏省卫生健康委科研课题(BJ21024)第一作者:赵勉,女,硕士研究生,E-mail:zhaomian163 通信作者:胡杨,男,副教授,主要从事中药标准化及功效物质基础研究,E-mail:huyang ;程建明,男,研究员,主要从事中药新剂型新技术及其产品开发研究,E-mail:320320 Exploring the Mechanism of Compound Fresh Dendrobium Granules in Treating Alcoholic Liver Disease Based on Network Pharmacology and Experimental VerificationZHAO Mian1 2 QIU Yu-xuan2 HU Yang1 2 LIU Zi-han2 WANG Pei-li2 CHEN Wei-wei3 PAN An2 CHENG Jian-ming1 2 1.Jiangsu Province Classic and Famous Formula Engineering Research Center Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210023 China 2.School of Pharmacy Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210023 China 3.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210029 China ABSTRACT OBJECTIVE Combining network pharmacology methods and experimental verification to explore the target and poten-tial mechanism of Compound Fresh Dendrobium Granules in treating alcoholic liver disease ALD.METHODSWith the help of TCMSP ETCM BATMAN-TCM databases and literatures the chemical components of Compound Fresh Dendrobium Granules were searched.The optimal target compounds were screened by Swiss ADME database and the active ingredient targets were predicted by Swiss Target Prediction database.The targets of ALD-related diseases were obtained from GeneCards OMIM DrugBank and DisGeN-ET databases.The protein-protein interaction PPI network analysis and traditional Chinese medicine TCM-active ingredient-tar-get-disease network diagram were constructed using String database and Cytoscape software.The predicted potential targets were ana-lyzed by GO/KEGG functional enrichment through DAVID database to predict the mechanism of action.A mouse model of alcoholic liver injury was constructed and the results of network pharmacology enrichment analysis were verified by pathological staining ELISA qPCR and Western blot.RESULTS A total of 73 key active ingredients were obtained by database screening and literatures and 720 targets were intersected with ALD.789 BP information 93 CC information 204 MF information and 194 KEGG signaling pathways were obtained by GO annotation analysis based on P0.05 and FDR0.1 的靶点,并进一步去重,初步得到与活性成分相对应的标准化靶点10。2.1.2 ALD 靶点与潜在作用靶点信息收集利用Genecards(https:/www.genecards.org/)、OMIM(ht-tps:/omim.org/)、DrugBank(https:/www.drugbank.ca/)、DisGeNET(https:/www.disgenet.org/)数据库,以“Alcoholic liver disease”为关键词进行检索,将获得的 ALD 作用靶点信息进行汇总去重整理。将“2.1.1”步骤中获得的活性成分的标准化靶点,同 ALD 疾 病 靶 点 上 传 至 jvenn(https:/jvenn.toulouse.inrae.fr/)绘图平台,从而获得复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的潜在作用靶点。2.1.3 中药-活性成分-靶点-疾病网络图的构建分析 将已知的中药、活性成分与潜在作用靶点信息、疾病做成 Network 和 Type 文件导入 Cytoscape 软件中,使用 Network Analyzer 功能进行网络拓扑分析,绘制“药物-活性成分-靶点-疾病”的可视化网络图,根据度值(Degree)、中介中心度(Betweenness centrality,BC)筛选出复方鲜石斛颗粒核心活性成分11-13。2.1.4蛋白互作网络(PPI)的构建将复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的潜在作用靶点导入 String 数据库中,设置蛋白物种为“Homo sapiens”,最小相互作用阈值选择 highest confidence(0.9),隐藏与网络无连接的蛋白,其余设置均为默认,从而构建 PPI。将获得的 PPI 数据选择 Exports 中 TSV 文件格式保存下载,将下载的数据导入 Cytoscape 软件,使用软件的 Network Analyzer 功能对 PPI 网络进行拓扑分析,得到各靶点的 Degree 值与 BC 值,再对网络图进行可视化处理,使得其中各节点的大小和颜色深浅反映数值的大小变化,方便筛选出关键靶点。2.1.5 基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析将潜在作用靶点导入 DA-VID(https:/david.ncifcrf.gov/)数据库,设定基因物种为人源基因,对潜在作用靶点进行 GO 和KEGG 富集分析,从而分析复方鲜石斛颗粒治疗ALD 的生物学过程和相关信号通路。2.2 实验验证2.2.1 实验动物分组、给药以及急性肝损伤模型的建立 适应性饲养小鼠 1 周左右,随机分为 4 组,即空白对照组 K(10 g 体质量注射生理盐水 0.1 mL),模型组 M(10 g 体质量注射生理盐水 0.1 mL),阳性对照组 P(水飞蓟宾葡甲胺加水配制成 5 mgmL-1溶液,50 mgkg-1d-1给药),给药组高剂量 D-H、低 剂 量D-L(复 方 鲜 石 斛 颗 粒,400、100 mgkg-1d-1),每组 10 只。实验过程如下:实验开始前 5 d 让所有小鼠进食 Lieber-DeCarli 液体控制饮食(F1259SP;Bio-Serv,Flemington,NJ),第 6天起,空白组小鼠用 F1259SP 液体饮食饲养,其余组改用含乙醇的 F1258SP 液体饮食喂养 10 d。每组对应药物从实验第 1 天起灌胃,15 d 给药结束,禁食 12 h,处死,取肝组织和血液。将小鼠肝脏用 4%多聚甲醛固定,剩余肝组织置于-80 冰箱保存;血898南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期液室温静置 23 h 后,3 500 rmin-1离心 10 min,收集血清置于-80 冰箱保存。2.2.2 行为状况观察每天观察各组小鼠精神状态行为是否异常,毛发是否脱落,记录每日小鼠体质量,观察体质量波动是否在一个正常区间。2.2.3 小鼠肝组织切片染色光学显微镜下观察各组小鼠肝脏病理组织学变化并拍照,评估组织变化。2.2.4 小鼠血清中 ALT、AST 水平及肝组织中 TG、TCHO 水平测定按照小鼠 ALT、AST 试剂盒说明书方法,检测血清中 ALT、AST 水平;参照小鼠 TG、TCHO 试剂盒说明书操作步骤,准确称取小鼠肝组织 20 mg,加入 200 L 的无水乙醇于冰上匀浆,以10 000 rmin-1离心 10min,取上清,测定肝组织中TG 和 TCHO 的含量水平。2.2.5小鼠肝组织中 IL-1、CXCL10、Srebp-1c、CPT1 mRNA 表达水平测定切取每个小鼠约等质量的肝组织,加入预冷的 RNA 裂解液,进行匀浆后加入氯仿,静置 5 min 后离心,取上清加异丙醇,静置 30 min。以 12 000 rmin-1,4 条件下离心10 min,倒上清得白色沉淀。加入 75%乙醇进行洗脱,静置 5 min 后以 12 000 rmin-1,4 条件下离心 5 min,弃掉乙醇,白色沉淀干燥后加 DEPC 水使其溶解,测定 RNA 浓度。根据浓度配置样品,进行逆转录,转录完再加 DEPC 水进行一定比例稀释,振荡后于 4冰箱保存。将样品进行点板,板每格加4 L 样品、6 L 引物 荧光素酶=1 5 的混合物,之后放入 qPCR 仪检测,引物信息见表 1,引物由上海生工生物技术有限公司合成。表 1 引物序列Table 1 Primer sequences基因名上游引物(53)下游引物(53)IL-1GCAACTGTTCCTGAACTCAACTATCTTTTGGGGTCCGTCAACTCXCL10CCAAGTGCTGCCGTCATTTTCGGCTCGCAGGGATGATTTCAASrebp-1cCGCTACCGTTCCTCTATCAATGTGGTTGCTGTGCTGTAAGAAGCPT1CTCCGCCTGAGCCATGAAGCACCAGTGATGATGCCATTCT2.2.6小鼠肝组织中 PI3K-Akt 信号通路蛋白表达测定 切取每个小鼠约等质量的肝组织,加入预冷的组织裂解液,进行匀浆,冰上裂解 30 min,于4 条件下离心 10 min,13 000 rmin-1,取上清液,用 BCA 法测定蛋白浓度,计算出上样体积。根据各样品上样体积进行电泳、PVDF 膜转膜,转膜后用脱脂奶粉配置的溶液封闭,封闭完成后按照分子量进行裁剪,分别加入一抗 p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-P-65、P65 和 -actin(稀释倍数 1 1 000),放 4 孵化过夜后回收一抗,用 TBST 稀释液清洗后,加入二抗 Rabbit(稀释倍数 1 1 000),于室温摇床孵化 1 h,用 ECL 化学发光液显色,经自动凝胶成像分析系统拍照后以 Image J 软件分析各组蛋白相对表达水平。2.2.7 统计学方法 采用 GraphPad Prism8.0.1 软件进行数据分析,所有数据均以 xs 表示。符合正态性和方差齐性时,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P0.05 为差异有统计学意义。3 结果3.1 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的网络分析结果3.1.1 复方鲜石斛颗粒中活性成分与作用靶点的获取 以 OB30%、DL0.18 为阈值,通过 TCM-SP、ETCM、BATMAN-TCM 数据库对复方鲜石斛颗粒中的葛根、三七的活性成分进行筛选;通过文献报道归纳“铁皮石斛”活性成分。通过 Swiss ADME 数据库进一步筛选,将获得的信息进行整合,删除重复数据后,共获得 73 个活性成分。对筛选出的有效成分通过 Swiss Target Prediction 数据库进行靶点预测,选取出评分高的靶点,得到复方鲜石斛颗粒的靶点共 900 个。中药-活性成分-作用靶点数目统计信息见表 2。998赵勉,等:基于网络药理学探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病的作用机制及实验验证 第 9 期表 2 复方鲜石斛颗粒“中药-活性成分-作用靶点”信息Table 2 Information on Compound Fresh Dendrobium Granules TCM-active Ingredients-action targets中药编号主要活性成分作用靶点数目葛根W13-Methoxydaidzein31W2Dimethylesculetin,Scoparone2W3Genistein57W4Daidzein2W5Formononetin-7-Glucoside11W6Formononetin5W7Coumingidine93W8Dauricine2W9Robustadial A22W10Puerarol10W11Coumestrol20W12Dalbergenone61三七W13Mandenol58W14DFV35W15Diop2W16Quercetin23W17Enanthic acid10W18Nonanoic acid1W192,6-Ditertbutyl-4-methyl phenol1W20Ditertbutyl phthalate30W21(-)-Dicentrine14W22Sandaracopimarinol1W23Panaxynol1W241-Tetradecanol1W25Panaxydol32W26Alpha-Cuparenol1W27Panaxatriol23W28Panaxadiol5W29Dithiocyclopentene26铁皮石斛W30Chrysotoxene20W31Flavone5W32Naringenin16W33Erianin13W34Gigantol24W354-2-(3,4-Dimethoxyphenyl)ethyl-2,6-dimethoxyphenol7W362-Butyl-2-octenal1W37Methyl cinnamylate6W38-Cyclocitral1W395,7,4-Trihydroxy-3,5-dimethoxy-flavone3W40Cedrol nanomedicine1W41Bis-n-butyl phthalate14W42Dendrocandin E4W43Dendrocandin D7W44Dendrocandin B14W45Dendrocandin A13W465-Formyl-1-methyl-3-(3-methylphenoxy)methyl-1H-pyrrole-2-carboxylic acid24009南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期(续表)中药编号主要活性成分作用靶点数目W473,4-Dimethoxybenzyl-D-glucopyranoside14W48Moupinamide10W49Koaburaside2W504,4-Dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl6W51Eugenol glucoside3W52Anchoic acid1W53Hendecanal4W544-(3,5-Dimethoxyphenethyl)phenol23W55Chrysotobibenzyl14W562,3,4,7-Tetramethoxyphenanthrene5W57Bulbophyllanthrin3W58Dihydroconiferyl dihydro-p-coumarate3W59Dihydro-feruloyltyramine3W60Syringaldehyde5W61Vanillic acid3W624-Coumaric acid1W63Secoisolariciresinol16W64Aduncin1W653-Methoxy-5-(4-methoxyphenethyl)phenol2W66-linalool1W67N-Cinnamoyltyramine6W683-Deoxyestradiol1W69Androst-5-en-4-one3W70Dehydroabietic acid10W7117-Hydroxyandrosta-4,9(11)-dien-3-one2W72Orchinol3W73Apigenin23.1.2 ALD 疾病靶点及复方鲜石斛颗粒治疗 ALD潜在作用靶点的获取以“Alcoholic liver disease”为关键词,在 GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeN-ET 数据库中进行检索,获取疾病靶点基因信息,共得到 ALD 的相关靶点9 651 个。将上述复方鲜石斛颗粒的 900 个作用靶点与 ALD 的 9 651 个相关靶点导入 jvenn 绘图平台进行映射,获得 720 个复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的潜在作用靶点,绘制韦恩图,见图 2。结果显示,复方鲜石斛颗粒可能通过多个潜在作用靶点协同发挥防治 ALD 的作用。3.1.3 中药-活性成分-靶点-疾病网络图的绘制及分析利用 Cytoscape3.6.0 软件对已知的中药、活性成分与潜在作用靶点信息、疾病进行中药-活性成分-靶点-疾病网络图的绘制,见图 3。图 2 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of targets of Compound Fresh Dendrobium Granules in the treatment of ALD109赵勉,等:基于网络药理学探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病的作用机制及实验验证 第 9 期图 3 中药-活性成分-靶点-疾病网络图Fig.3 TCM-active ingredients-target-disease network diagram 通过软件自带的 Network Analyzer 功能对整个网络图进行拓扑分析,计算网络中 Degree 值和 BC值的平均值,分别是 10.863 和 0.071,选择拓扑参数大于两项均值的活性成分,共筛选出 23 个符合条件的活性成分,如表 3 所示。推测这些成分可能是复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的关键活性成分。表 3 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的关键药效成分Table 3 Key medicinal ingredients of Compound Fresh Dendrobium Granules in the treatment of ALD编号活性成分来源DegreeBCW7Coumingidine葛根710.446 378W13Mandenol三七530.392 86W3Genistein葛根520.338 173W12Dalbergenone葛根480.314 163W14DFV三七310.238 55W13-Methoxydaidzein葛根290.194 273W25Panaxydol三七260.201 046W20Ditertbutyl phthalate三七230.178 11W9Robustadial A葛根220.147 67W16Quercetin三七220.170 393W27Panaxatriol三七210.162 64W34Gigantol铁皮石斛200.129 99W11Coumestrol葛根180.120 451W29Dithiocyclopentene三七180.139 163W465-Formyl-1-methyl-3-(3-methylphenoxy)methyl-1H-pyrrole-2-carboxylic acid 铁皮石斛160.103 376W30Chrysotoxene铁皮石斛140.089 918W45Dendrocandin A铁皮石斛140.089 918W473,4-Dimethoxybenzyl-D-glucopyranoside铁皮石斛140.089 918W32Naringenin铁皮石斛130.083 152W544-(3,5-Dimethoxyphenethyl)phenol铁皮石斛130.083 152W21(-)-Dicentrine三七120.091 237W33Erianin铁皮石斛120.076 36W10Puerarol葛根110.071 79209南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期3.1.4 PPI 网络图的绘制 把从 Jvenn 绘图平台获得的 720 个潜在作用靶点导入到 String 数据库当中,设置蛋白物种为“Homo sapiens”进行检索,点击“Continue”,将最小相互作用阈值设置为 Highest Confidence(0.9),隐藏彼此间无连接的蛋白,其余设置均为默认,之后将网络数据以 TSV 文件格式进行下载,之后导入到 Cytoscape3.6.0 软件中,进行网络拓扑分析与可视化处理,如图 4 所示。综合 De-gree 值与 BC 值两方面分析,选取数值最高的 20 个靶点,如表 4 与图 5 所示。在这些靶点中,TP35、PIK3R1、MAPK1、SRC、MAPK3、AKT1 有相对较高的数值,可能为复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的最主要核心靶点,上述网络分析体现了复方鲜石斛颗粒多成分、多靶点的综合调节特点。注:Degree 值越大,节点越大,颜色越深。图 4 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的 PPI 网络Fig.4 PPI network for the treatment of ALD with Compound Fresh Dendrobium Granules309赵勉,等:基于网络药理学探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病的作用机制及实验验证 第 9 期表 4 复方鲜石斛颗粒关键靶基因的网络拓扑参数Table 4 Network topological parameters of key target genes of Compound Fresh Dendrobium Granules靶基因DegreeBC靶基因DegreeBCTP53660.138 2 HSP90AA1450.062 28PIK3R1510.027 20ESR1390.052 03MAPK1500.039 07AKT3360.012 17SRC490.042 46AKT2360.012 17MAPK3490.036 39EGFR350.029 88AKT1490.053 11HRAS340.016 06PIK3CB460.013 14 HSP90AB1340.023 69STAT3460.045 73PTK2310.017 52PIK3CD450.012 24MAPK8310.021 28PRKACA450.104 12EP300310.057 78图 5 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 排名前 20 的关键靶基因网络图Fig.5 Network diagram of the top 20 key target genes for Compound Fresh Dendrobium Granules in the treatment of ALD3.1.5GO 功能与 KEGG 功能富集分析将获得的 720 个潜在作用靶点导入 DAVID 数据库中,获得GO 功能与 KEGG 通路数据,以P0.05,FDR0.05为筛选条件,共 789 个 GO BP(生物过程)条目,93个 GO CC(细胞组分)条目,204 个 GO MF(分子功能)条目,194 个 KEGG 通路条目。将 BP、CC、MF中靶点富集最多的 10 个条目及 KEGG 中排名靠前的通路运用微生信平台以高级气泡图的形式直观地展示出来,GO 富集分析见图 6。生物过程主要涉及蛋白质磷酸化、信号转导、RNA 聚合酶 II 启动子转录的正调控、炎症反应等;细胞组分主要涉及细胞核、细胞外区域、细胞质、等离子体膜等;分子功能主要涉及 ATP 结合、蛋白质结合、酶结合等。图 6 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 潜在作用靶点的GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of potential targets of Compound Fresh Dendrobium Granules in the treatment of ALDKEGG 通路富集分析见图 7,从图中可以看出,P 值较小、包含的基因数较多的代谢通路主要包括代谢过程、癌症途径、神经活性配体-受体相互作用、PI3K/Akt 信号通路、MAPK 信号通路、cAMP 信号通路、钙信号通路等。图 7 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的潜在作用靶点的KEGG 通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Compound Fresh Dendrobium Granules in the treatment of ALD409南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期3.2 实验验证结果3.2.1 实验小鼠行为状况变化对所有组小鼠进行行为状况观察可见,空白组小鼠毛发光滑整洁,没有脱落现象,活泼好动,精神状态良好。其余 4 组小鼠在被喂食含乙醇的液体高脂流食后,精神普遍倦怠,行动迟缓,个别小鼠出现轻微的毛发脱落和体质量下降过多。各组小鼠平均体质量变化见图 8,模型组平均体质量下降最为严重,空白组体质量趋势相对平稳,阳性药组与给药组体质量下降趋势大致相同,均高于模型组。3.2.2 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠肝组织的影响 各组小鼠肝组织切片油红 O、HE 染色结果如图 9所示。油红 O 染色结果显示,与空白组相比,模型组中有更深的油红 O 染料附着,有更多脂质浸润及脂滴形成;与模型组相比,阳性药对照组、高低剂量给药组与低剂量给药组油红 O 染色附着更浅,脂质浸润及脂滴堆积情况较轻,高剂量组的脂质浸润及脂滴堆积情况优于阳性药对照组与低剂量组。从HE 染色结果可知,与空白组相比,模型组胞浆中出现大量的脂肪空泡,并且伴有炎症细胞浸润,且有脂滴堆积。与模型组相比,阳性药对照组、高低剂量给药组与对肝组织均起到不同程度的改善作用,肝组织的脂肪空泡及脂滴堆积均减少,炎症细胞浸润情况有所改善。图 8 各组小鼠平均体质量变化趋势图Fig.8 Trend chart of average body weight changes of mice in each group图 9 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠肝组织的影响(油红 O100、HE200)Fig.9 Effect of Compound Fresh Dendrobium Granules on liver tissue of ALD mice(Oil red 100,HE 200)3.2.3 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠血清 ALT、AST及肝组织 TG、TCHO 含量水平的影响 结果如图 10所示,与空白组相比,模型组小鼠血清中 ALT 与AST 活性水平及肝组织中 TG、TCHO 含量明显升高(P0.01,P0.001)。与模型组相比,阳性对照组血清 ALT、AST 活性水平降低(P0.05),而其肝组织中 TG、TCHO 含量显著降低(P0.01,P0.001);此外,与模型组相比,高、低剂量组血清 ALT、AST 活性水平及肝组织中 TG、TCHO 含量呈不同程度的降低(P0.05,P0.01,P0.001)。509赵勉,等:基于网络药理学探讨复方鲜石斛颗粒防治酒精性肝病的作用机制及实验验证 第 9 期注:与空白组比较,#P0.05,#P0.01,#P0.001;与模型组比较,P0.05,P0.01,P0.001。xs,n=6。图 10 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠血清 ALT、AST 水平和肝组织 TG、TCHO 水平的影响Fig.10 Effects of Compound Fresh Dendrobium Granules on serum ALT and AST levels and liver tissue TG and TCHO levels in ALD mice3.2.4 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠肝组织中炎症与脂质代谢相关 mRNA 表达的影响IL-1、CX-CL10、Srebp-1c、CPT1 mRNA 表达结果如图 11 所示,与空白组相比,模型组 IL-1、CXCL10、Srebp-1c 的基因表达水平显著升高(P0.01),而 CPT1 基因表达水平显著降低(P0.01)。与模型组相比,阳性药组、高、低剂量组的 Srebp-1c、IL-1、CXCL10 mRNA 表达水平降低(P0.05,P0.01),而 CPT1基因表达水平显著升高(P 0.05,P 0.01,P 0.001),表明复方鲜石斛颗粒可以通过抑制炎症和调控脂质代谢改善肝损伤。注:与空白组比较,#P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01,P0.001。xs,n=6。图 11 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠肝组织中炎症与脂质代谢相关基因 mRNA 表达的影响Fig.11 Effect of Compound Fresh Dendrobium Granules on mRNA expression of inflammation and lipid metabolism related genes in liver tissue of ALD mice3.2.5复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠肝组织中PI3K/Akt 信号通路蛋白表达的影响经 Western blot 检测分析(图 12),与对照组相比,模型组 p-AKT、p-mTOR、p-p65 蛋白表达水平明显上升(P0.01),经复方鲜石斛颗粒干预后,p-AKT、p-mTOR、p-p65 蛋白表达水平明显下降(P0.05,P609南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期0.01),结果表明,石斛复方制剂能显著调节 PI3K/Akt 信号通路核心靶点的蛋白表达水平(图 13)。注:与空白组比较,#P0.05,#P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=6。图 12 复方鲜石斛颗粒对 ALD 小鼠肝组织中 PI3K/Akt 信号通路蛋白表达的影响Fig.12 Effect of Compound Fresh Dendrobium Granules on protein expression of PI3K/Akt signaling pathway in liver tissue of ALD mice图 13 复方鲜石斛颗粒治疗 ALD 的可能机制(PI3K/AKT 信号通路)Fig.13 Possible mechanism of Compound Fresh Dendrobium Granules in treating alcoholic liver disease(PI3K/AKT signaling pathway)4 讨论本研究利用网络药理学构建“中药-活性成分-靶点-疾病