MEK1_2-ERK1_2通路参与硒在高皮质醇水平下对山羊子宫内膜炎症反应的抑制作用.pdf

DOI:10.16网络首发时间：2 0 2 3-10-302024,54(02):267-275中国兽医科学2024,54(02)ChineseVeterinaryScience6656/j.issn.1673-4696.2024.0025中图分类号：S852.612文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96(2 0 2 4)0 2-0 2 6 7-0 9MEK1/2-ERK1/2通路参与硒在高皮质醇水平下对山羊子宫内膜炎症反应的抑制作用张敏1,2,袁长宁1,2,郑方玲1,2,李俊12,郭龙1,2,刘康军1,2,董俊升1,2,王亨1,2,李建基1,2,崔璐莹1,2*（1.扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009;2.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州225009)摘要：为揭示硒在高皮质醇水平下对山羊子宫内膜炎症通路MEK1/2-ERK1/2的影响，采用空怀奶山羊建立子宫内膜炎模型，观察皮质醇和硒对山羊生理指标、子宫内膜组织病理学变化、子宫分泌物以及MEK1/2-ERK1/2通路的影响。结果显示，连续注射7 d皮质醇后，山羊血清皮质醇可维持较高水平；连续补饲酵母硒2 1d可维持山羊血清较高的硒水平。灌注大肠杆菌后，山羊的呼吸频率、心率、体温和外周血白细胞数、子宫分泌物中多形核白细胞(PMN)数量以及MEK1/2-ERK1/2通路关键因子表达均升高，子宫组织病理损伤加重。注射皮质醇后，山羊生理指标、子宫分泌物中PMN数量均下降，子宫组织损伤加重；MEK1和MEK2基因表达下降（P0.05）,M EK 1/2-ER K 1/2 通路关键蛋白表达水平下降（P0.05）。与皮质醇和大肠杆菌共处理组的山羊相比，日粮中补饲酵母硒的山羊的生理指标、子宫分泌物PMN数量进一步下降，子宫组织损伤减轻，MEK1/2-ERK1/2通路被抑制（P0.05）。结论：日粮中补饲酵母硒可减轻高皮质醇水平下大肠杆菌诱导的山羊子宫内膜的炎症反应，其调控机制可能与MEK1/2-ERK1/2通路有关。关键词：MEK1/2-ERK1/2通路；酵母硒；皮质醇；山羊；大肠杆菌MEK1/2-ERK1/2 pathway participates in the inhibition ofinflammation of goat endometrium with high cortisol levelZHANG Min2,YUAN Changning-2,ZHENG Fangling-2,LI Jun-2,CUO Long2,IU Kangjun-2,DON Junsheng*,ANG Heng*,I Jianji-,CUI Luying.*(1.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses/Collegeof Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;2.Joint International Rese arch Laboratory ofA griculture and A gri-product Safety of the Ministry of Education,Yangzhou 225009,China)Abstract:To investigate the effect of selenium on the MEK1/2-ERK1/2 pathway in goat endometriumunder a high cortisol level,the uterine infection model of dairy goats was established by intrauterineinfusion of Escherichia coli.Additionally,the animal received intramuscular injection of cortisoland dietary supplementation with yeast selenium.The changes in the physiological indicators,the收稿日期：2 0 2 3-0 9-0 6；修回日期：2 0 2 3-0 9-17基金项目：国家自然科学基金项目（32 0 7 2 937 318 0 2 2 53,32 10 2 7 35）；江苏现代农业产业技术体系建设专项（JATS2023499）；江苏省基础研究计划青年基金项目（BK20210808）；江苏省333高层次人才培养工程资助项目；江苏省（扬州大学）研究生科研与实践创新计划项目（KYCX22_3555,SJCX21_1642）；高等学校学科创新引智计划项目（D 18 0 0 7）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）作者简介：张敏（1999-），女，山东泰安人，硕士生，Tel：[phone],E-m a i l：17 8 52 412 7 93 16 3.c o m。*通讯作者：崔璐莹（198 7-）,女，副教授,博士，硕士生导师，主要从事反台动物围产期疾病发病机理与防控技术的教学与研究工作,E-mail:。268第54卷中国兽医科学endometrial histology,the uterine secretion,and the MEK1/2-ERK1/2 pathway were detected.As a result,the administration of cortisol for 7 consecutive days maintained a high serum cortisol level.Thesupplementation of selenium for 21 days stably elevated the serum selenium level.Goats received E.colitreatment presented increased respiratory rate,heart rate,body temperature,peripheral white bloodcell counts,and polymorphonuclear neutrophil(PMN)amount in uterine secretions,the endometrial damage,andthe activation of MEK1/2-ERK1/2 pathway.Cortisol treatment ameliorated the changes in thephysiological indicators,inflammation markers,and tissue injury,and reduced the gene and proteinexpressions related to MEK1/2-ERK1/2 pathway(P0.05).In goats received dietary supplementation withyeast selenium,there was a further inhibition in the physiological indicators,the PMN amount inuterine secretions,the uterine tissue damage,and the MEK1/2-ERK1/2 activation(P0.05).In conclusion,dietary supplementation with yeast selenium alleviated endometrial inflammation of goats under highcortisol levels,and its regulatory mechanism may be related to MEK1/2-ERK1/2 pathway.Key words:MEK1/2-ERK1/2 pathway;selenium yeast;cortisol;goat;Escherichia coli*Corresponding author:CUI Luying,E-mail:反台动物产后子宫感染严重影响其生产性能并造成巨大的经济损失1。农场中,奶牛子宫内膜炎的发病率高达30%40%2 。山羊产后子宫感染病例中约50%为子宫内膜炎3。细菌是产后子宫感染的常见致病源,其中大肠杆菌是主要致病菌之一,通过内毒素脂多糖(LPS)发挥致病作用,引起子宫组织损伤和炎症反应4。围产期奶牛稳态的动态失衡、分娩应激、代谢应激以及疼痛应激等引起内源性皮质醇（cortisol,COR)水平升高,持续高水平的皮质醇导致免疫机能下降,增加产后子宫感染的风险5。硒（selenium，Se)具有抗氧化和增强机体免疫力的作用6 。反台动物在围产期长期处于硒缺乏的临界水平，会增加患子宫内膜炎、胎衣不下、乳房炎和卵巢囊肿的风险6 。适当补硒有助于提高产后子宫的抗感染能力，降低子宫内膜炎的发病率7 产后子宫主要通过先天免疫抵抗细菌感染，其中以炎症反应为主。本实验室前期研究发现皮质醇可通过抑制NF-kB和MAPK/ERK通路，抑制LPS或大肠杆菌诱导的子宫内膜炎症反应8-9。Cui等10 研究发现，高水平皮质醇条件下，硒通过NF-kB和MAPK/ERK途径抑制LPS诱导的子宫内膜上皮细胞炎性反应。但硒在高水平皮质醇下对上述机制的体内探究尚无报道。丝裂原活化蛋白激酶激酶-细胞外信号调节激酶（MEK1/2-ERK1/2)信号转导通路参与调节细胞凋亡、增殖、迁移、分化和代谢等过程。丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（MEK1/2)是MEK1/2-ER-K1/2信号转导通路的主干节点蛋白12 。ERK1/2是MEK1/2-ERK1/2信号通路的下游蛋白。在MEK1/2-ERK1/2激酶级联反应中，MEK1/2通过磷酸化酪氨酸和苏氨酸两个调节位点激活下游底物ERK1/2,进而调节多转录因子,影响多种生理功能13。目前,MEK1/2-ERK1/2通路在反台动物子宫内膜炎症反应中的作用鲜有报道为了探索硒对高水平皮质醇下子宫内膜炎症反应影响的机制，本研究利用空怀奶山羊模拟产后子宫感染模型，通过观察山羊体温、呼吸、心率、外周血白细胞数、子宫分泌物以及子宫内膜的病理变化，检测MEK1/2-ERK1/2通路关键因子的变化，以期为硒防治动物产后子宫内膜炎提供理论依据。1材料与方法1.1实验动物与菌株选取18 只健康奶山羊，饲养于扬州大学兽医学院大动物房内，饲养环境适宜，实验期间为其提供优质干草、精料，自由饮水。实验所用大肠杆菌O55为本实验室先前于患有子宫内膜炎患病山羊的分泌物中分离所得1.2主要试剂皮质醇（氢化可的松）为华中药业股份有限公司产品；苏木精、伊红、中性树胶和30%制胶液均为北京索莱宝科技有限公司产品;Diff-Quik染色液购自南京建成科技有限公司；石蜡为上海懿洋仪器有限公司产品；舒泰购自法国维克公司；Trizol裂解液购自天根生化科技有限公司；TransZolup、R NA Ex-tractionAgent均购自北京全式金生物技术有限公司；SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，为碧云天生物技术有叫269张第2 期敏等：MEK1/2-ERK1/2通路参与硒在高皮质醇水平下对山羊子宫内膜炎症反应的抑制作用限公司产品；MEK1/2抗体、P-MEK1/2抗体，均为江苏亲科生物研究中心有限公司产品；ERK1/2抗体、P-ERK1/2抗体，为美国Cell Signaling Technology公司产品；山羊抗家兔二抗，为美国Jackson公司产品；山羊抗小鼠二抗，为日本MBL公司产品。1.3实验分组及动物模型的制备实验分为空白对照组（I组）、冰醋酸损伤组（II组）、冰醋酸十皮质醇组（II组）、冰醋酸十大肠杆菌组（IV组）、冰醋酸+大肠杆菌+皮质醇组（V组）、冰醋酸十皮质醇+大肠杆菌+硒组（VI组）。正式实验前2 1d起，所有动物正常饲喂山羊饲料，第VI组山羊额外补饲酵母硒（每千克饲料加1mg）,每日1次,并于第0 天检测所有动物的血清硒浓度。检测结果显示加硒组血清硒浓度显著升高,并以此日作为实验第1天。从第1天起，空白对照组（I组）山羊子宫内灌注生理盐水，其余组别的山羊子宫内灌注30mL/L的冰醋酸，每日1次，每次2 0 mL,连续灌注3d;II组、V组、VI组山羊肌内注射皮质醇（每千克体重注射1mg），每日2 次；然后在第3天，IV组、V组、VI组山羊子宫内灌注大肠杆菌O（10 10CFU/mL,20mL），每日1次，并于灌注0.5h后用生理盐水冲洗子宫,其他组山羊子宫内灌注生理盐水；第4天采集山羊颈静脉血用于检测血清硒浓度，然后用宫腔镜采集子宫组织。1.4细菌分离鉴定及细胞学检查将采集的山羊子宫分泌物接种于血琼脂培养基中，待生成菌落后挑取可疑菌落进行血平板划线分离以获取单纯菌落。将分离所得的菌落均匀涂布于洁净载玻片，然后进行HE染色，显微镜观察并记录染色后菌落的形态特征，经质谱检测确认为子宫灌注的菌落。用灭菌棉拭子采集山羊子宫分泌物，制作抹片进行Diff-Qick染色、镜检1.5血清硒和皮质醇含量的检测分别于第0 和4天采集山羊外周血，分离血清。采用消解法检测第0 和4天的血清硒含量；采用免疫放射分析法检测第4天血清中的皮质醇含量。1.6山羊体温、呼吸频率、心率和外周血白细胞数检测以子宫灌注大肠杆菌55为第0 小时，分别于第0、12 和2 4小时检测山羊直肠温度，观察呼吸频率，听诊心率,用血细胞仪检测外周血白细胞(WBC)数，检测时应尽量使山羊处于相对安静稳定的状态，避免人为或环境因素对检测结果造成影响。1.7组织病理学检查将子宫内膜组织置于40 g/L多聚甲醛中固定，经修剪、冲洗、乙醇梯度法脱水后浸蜡包埋并修剪，用切片机制成石蜡切片，石蜡切片置于载玻片，烤片脱蜡等操作后进行HE染色，最后封片晾干镜检。1.8免疫组织化学观察石蜡切片由30 mL/L过氧化氢室温孵育2 0 min，0.01mol/L枸橡酸钠溶液（pH=6.0)99水浴5min，50g/LBSA封闭液封闭30 min。加一抗或PBS（阴性对照)于4孵育过夜。清洗后滴加HRP标记的抗家兔IgG,室温孵育30 min。加SABC(过氧化物酶）试剂盒室温孵育30 min。滴加DAB工作液，镜检，待切片组织出现棕黄色后停止染色并清洗。最后复染封片。1.9荧光定量PCR低温研磨子宫内膜组织；依次加TransZolup溶液、RNAExtractionAgent后,用核酸提取仪提取组织RNA。采用一步法反转录成cDNA，然后用荧光定量PCR检测MEK1和MEK2基因的表达量，引物见表1。表1扩增基因的引物序列Table 1 The primer sequences of gene amplified基因名称Genenames引物序列(5-3)Primersequences靶基因大小/bpProductsizes序列号No.inNCBIF:AAGCCAACCGTGAGAAGATGACC-actin130XM_005694067.1R:CCAGAGTCCATGACAATGCCAGTGF:CAAGCCGTCCAACATCCTAGTGAACMEK1209XM_005685130.3R:ATCTCCCGACCGCCATCTCAACF:GTCTCCGGAGCGACTACAAGMEK2186XM_018050856.1R:GGTGAGATGCTGGGAGGTTC1.10Western-blot检测低温研磨子宫内膜组织后加人RIPA裂解液裂解；4、12 0 0 0 r/min离心10 min取上清；获取总蛋白。用BCA法检测样品蛋白质量浓度并调整质量浓度；进行SDS-PAGE,转膜;50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭1.5h，T BST 漂洗，一抗4过夜孵育，TBST漂洗，二抗室温孵育2 h,TBST漂洗；滴加ECL化学发光液于化学发光成像仪中采集图像，并270第54卷中国兽医科学用ClinxImageAnalysis 进行分析。1.11数据分析采用SPSS25.0分析实验数据，单因素方差分析各组间差异,结果以均值土标准差（mean土SD)表示。P0.05表示差异显著，P0.05）,而IV、V、VI 组的PMN数量均升高约6 0倍以上(P0.05)。在冰醋酸和大肠杆菌处理的基础上，添加皮质醇后PMN数量下降（P0.05），添加Se后PMN数量进一步下降(P0.05)。2.2山羊血清硒和皮质醇含量的变化如图2 所示：补饲酵母硒的山羊，其第0 和4天的血清硒水平高于（P0.05),各组血清硒水平均处于正常范围；注射皮质醇后,III、V 和VI组的皮质醇质量浓度上升至40 0 ng/mL以上(P0.05);第12和2 4小时子宫灌注大肠杆菌的山羊的体温、呼吸频率、心率和外周血细胞数上升（P0.05),注射皮质醇山羊的4项指标表现出不同程度的下降，添1507NNd100-abCIVVI50-dddIIVVVI组别Group图1山羊子宫分泌物的细胞学检查(bar=50m）Figure 1Changes in the uterine secretion cytology of goats(bar=50 m)I：空白对照组；II：冰醋酸损伤组;II:冰醋酸+皮质醇组;IV：冰醋酸十大肠杆菌组；V：冰醋酸+大肠杆菌十皮质醇组;VI:冰醋酸+皮质醇+大肠杆菌十硒组。组间字母不同表示差异显著（P0.05)。下同。I:Control;II:GAA;III:GAA+Cortisol;IV:GAA+E.coli;V:GAA+Cortisol+E.coli;VI:GAA+Cortisol+E.coli+Se.The difference of lettersbetween groups indicated significant difference(P0.05).The same as follows.2.57B6002.0IVaaaVVI1.5-400-bbb1.0bb6b200-0.504时间/dTimeIVVVI组别Group图2 山羊血清硒和皮质醇含量的变化Figure 2 Concentration changes of serum selenium and cortisol in goatsA：血清硒浓度的变化；B：皮质醇质量浓度的变化；虚线：正常范围。A:Changes of the concentration of serum selenium in goats;B:Changes of the mass concentration of serum cortisol in goats;Black dotted line:Nor-mal range.271张敏等：MEK1/2-ERK1/2通路参与硒在高皮质醇水平下对山官内膜炎症反应的抑制作用第2 期AB4260-aaaaabab(uru)/率和ab40IVcd40-Vd30VId20-38-12-0122401224时间/hTime时间/h TimeCD30a150-aabaaa工bcaa20(r-uu)/率工100-abb b b8070-工10500122401224时间/h Time时间/h Time图3 L山羊体温、呼吸频率、心率和外周血白细胞数的变化Figure3Changes in the rectal temperature,respiratory rate,heart rate and peripheral WBC count in goats after intrauterineinfusion with E.coliA：体温；B：呼吸频率；C：心率；D：外周血白细胞数。A:Rectal temperature;B:Respiratory rate;C:Heart rate;D:Peripheral WBC count.加Se后进一步下降（P0.05）2.4山羊子宫内膜组织的病理学变化如图4所示：I组子宫内膜无明显病理变化；I组子宫内膜有出血点，上皮轻度脱落，腺体扩张，有极少量PMN浸润；I组与II组相比PMN数量减少；IV组与II组相比上皮严重脱落,大量中性粒细胞浸润；V组较IV组上皮脱落加重，中性粒细胞浸润减轻：VI组上皮脱落程度和中性粒细胞浸润大幅减轻2.5山羊子宫内膜中ERK1/2蛋白的表达变化如图5所示：与I组(空白对照组)相比，II、I I组山羊子宫内膜中ERK1/2蛋白表达无变化(P0.05)；子宫灌注大肠杆菌后山羊子宫内膜中ERK1/2蛋白表达显著升高（P0.05）；注射皮质醇后ERK1/2蛋白表达下降；添加Se后ERK1/2蛋白表达进一步下降(P0.05)；山羊子宫灌注大肠杆菌O55后MEK1/2-ERK1/2信号通路相关基因MEK1和MEK2的表达上升（P0.05）,注射皮质醇后MEK1和MEK2的表达均下降（P0.05），添加Se后MEK1和MEK2的基因表达进一步下降(P0.05）；山羊子宫灌注大肠杆菌O55后MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平上升（P0.05）；注射皮质醇后MEK1/2和ERK1/2蛋白的磷酸化水平下降（P0.05）；添加Se进一步降低了MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平（P0.05)。3讨论健康状态下，子宫通过物理屏障和局部先天免疫抵御病原体的侵人，但围产期奶牛处于能量负平衡状态，机体防御机能减弱，分后子宫天然屏障272第54卷中国兽医科学50umIV50L图4山羊子宫内膜组织的病理学变化Figure 4Pathological changes of endometrial tissue in goats0.80.6-DHIJOQON0.4aaa0.250umIIVVVI组别Group图5山羊子宫内膜中ERK1/2蛋白表达量的变化Figure 5 Changes of the protein expression of ERK1/2 in goat endometriumAB1520aa1510bCC1051IVVVIIIVVVI组别Group组别Group图6 山羊子宫内膜组织中MEKI和MEK2基因表达水平的变化Figure 6 Changes in the relative expression levels of MEKl and MEK2 genes in goat endometriumA：M EK I m R NA 相对表达量B：M EK 2 m R NA 相对表达量。A:The relative expression of MEK1 mRNA;B:The relative expression of MEK2 mRNA.273张敏等：MEK1/2-ERK1/2通路参与硒在高皮质醇水平下对I内膜炎症反应的抑制作用第2 期IVVVI2.5ERKa2.0-aIVp-ERK1.5aVbVIMEK1.0bbP-MEK0.5-GAPDH0p-MEK1/2/MEK1/2p-ERK1/2/ERK1/2组别Group图7 山羊子宫内膜组织中MEK1/2-ERK1/2通路相关蛋白表达水平的变化Figure 7Changes in the expressions of MEK1/2-ERK1/2 pathway-related proteins in endometrial tissues of goats遭到破坏、子宫内膜出血、上皮脱落，导致细菌更易侵人繁殖，引起子宫内膜炎。化学刺激或物理破坏也可造成子宫内膜黏膜损伤和上皮脱落14,Zhang等15 使用30 mL/L冰醋酸刺激大鼠子宫模拟产后子宫损伤。本研究对山羊子宫灌注30 mL/L冰醋酸后，体温、呼吸频率、心率和WBC数无明显变化；组织病理学检查发现子宫内膜存在出血，上皮轻度脱落，说明山羊子宫损伤模型构建成功。郑亦婧等16 通过子宫灌注大肠杆菌O55构建了山羊子宫内膜炎模型。因此，本研究在损伤模型的基础上灌注大肠杆菌55，并从山羊子宫分泌物中分离出相同菌株；同时,动物体温、呼吸频率、心率和外周血PMN数量上升，子宫内膜上皮脱落，大量中性粒细胞浸润；这表明大肠杆菌性子宫内膜炎模型构建成功。本实验通过肌内注射皮质醇，模拟山羊因产后应激导致的皮质醇升高。连续注射7 d皮质醇后,血清皮质醇可维持较高水平。皮质醇减少了子宫分泌物中PMN数量以及中性粒细胞浸润，抑制了子宫内膜的炎症反应,这与Lugay17和Cui等9 的研究结果一致，但皮质醇导致子宫上皮脱落加重，子宫免疫机能下降,增加了感染的风险。由于子宫分泌物的黏稠性，无法量化测定分泌物中的细菌数量，故本实验未测定载菌量。酵母硒属于有机硒,其主要成分为硒代氨基酸，具有安全性高、毒性低、吸收率高的特点18 。丁文杰等19 研究发现，酵母硒无须形态转化即可被机体吸收,且较其他形态的硒具有更高的抗氧化能力。补饲酵母硒可以提高反台动物的生产性能。有研究表明，日粮中添加0.2 mg/kg酵母硒可以较好地促进肉羊生长，改善肉质2 0 ,奶牛连续饲喂5mg/kg酵母硒56d,其血清中的谷胱甘肽过氧化物酶活性升高、总抗氧化能力增强2 1。本研究中，山羊日粮中补饲酵母硒后,其血清硒水平升高约2 倍；继续补Se，可维持较高的血清硒水平;该结果与郑健等2 0 研究中的血清最优硒浓度一致。奶牛围产期补饲酵母硒可以改变分娩当天乳汁营养成分并降低产后2 1d乳汁中的促炎代谢物含量2 2 。小鼠日粮补饲硒可以减少炎性细胞因子的产生，减轻LPS诱导的子宫内膜炎症反应2 3。本研究结果显示,山羊补饲酵母硒进一步改善了体温、呼吸频率、心率和外周血白细胞数等指标；大幅缓解了山羊子宫内膜的炎症和损伤。Nishina等2 4 研究发现,MAPK级联反应（酪氨酸激酶-MEK1/2-ERK1/2)与神经元活化有关。游道锋2 5 研究结果证实，MEK1/2-ERK1/2信号通路介导炎症反应。Linke等2 6 发现,MEK1/2-ERK1/2信号通路参与慢性鼻一鼻窦炎的炎症过程。有研究表明，负相调控MEK1/2-ERK1/2信号通路的关键因子有助于防治骨关节炎2 7 。本研究结果显示，子宫灌注大肠杆菌O5造成子宫炎症的同时,MEK1/2-ERK1/2信号通路活化,这与上述研究结果一致。目前，皮质醇和硒调控山羊子宫内膜MEK1/2-ERK1/2信号通路的报道较少。Prevoo等2 8 研究发现,皮质醇等糖皮质激素通过糖皮质激素受体和受体酪氨酸激酶c-Met诱导MEK1/2活化,最终导致多重耐药蛋白2的功能增强。Nishina等2 9 研究发现,硒唑化合物通过酪氨酸激酶-MEK1/2-ERK1/2级联反应参与神经元分化和抑制细胞调亡。本研究中发现，注射皮质醇后MEK1和MEK2的表达量下降，p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达量也下降。补饲酵母硒进一步降低了相关基因和蛋白的表达。由此说明，山羊日粮补饲酵母硒抑制了高水平皮质醇下MEK1/2-ERK1/2通路的活化。综上，山羊日粮补饲酵母硒可缓解大肠杆菌引起的子宫内膜损伤；抑制高水平皮质醇下大肠杆菌引起的山羊子宫内膜的炎症反应,其调控机制可能与MEK1/2-ERK1/2通路有关。274第54卷中国兽医科学参考文献(References)1PICCARDI M,ROMERO G,VENERANDA G,et al.Effect ofpuerperal metritis on reproductive and productiveperformance in dairy cows in Argentina 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