黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的影响及机制研究.pdf

实验研究 中国中医眼科杂志 2024 年 2 月第 34 卷第 2 期黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的的影响及机制研究影响及机制研究芦凌羽1，2，王林洪1，2摘要 目的探讨黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞的激活作用及其机制。方法大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，随机分为模型组（MG）和黄芩苷组（BG），另将健康大鼠设对照组（CG），每组12只。BG组大鼠给予黄芩苷水溶液（50 mg/kg）每日灌胃，CG、MG组大鼠给予同体积的蒸馏水灌胃，连续给药12周。12周后测量大鼠血糖，然后麻醉取右眼眼球，苏木精-伊红（HE）染色观察视网膜形态，免疫组织化学法检测视网膜小胶质细胞簇分化抗原68（CD68）蛋白表达，免疫荧光法检测信号转导和转录激活因子3（STAT3）蛋白表达，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测白细胞介素-6（IL-6）、STAT3 mRNA的相对表达量。结果（1）视网膜形态：与CG组相比，MG组大鼠视网膜神经节细胞（RGC）丢失明显增多，而BG组RGC数量增加；MG组视网膜厚度较CG组薄，而BG组较MG组厚。（2）小胶质细胞：CG组小胶质细胞局限在内核层；MG组小胶质细胞数量增多，且分布在视网膜的每一层中；BG组小胶质细胞数量较MG组少，且小胶质细胞迁移受限。MG组大鼠视网膜小胶质细胞CD68表达高于CG组（t=7.348，P=0.000），BG组CD68表达低于MG组（t=2.449，P=0.019），差异均有统计学意义。（3）STAT3、IL-6：CG组视网膜STAT3表达主要分布在内丛状层，而MG组视网膜各层均有大量STAT3阳性表达，BG组视网膜各层中STAT3表达明显弱于MG组。MG组大鼠视网膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达高于CG组（tSTAT3=9.935、tIL-6=17.501，均P=0.000），BG组视网膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达低于MG组（tSTAT3=8.432、tIL-6=9.944，均P=0.000），差异均有统计学意义。结论黄芩苷能抑制糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活，其机制可能与IL-6/STAT3信号通路有关。关键词 黄芩苷；糖尿病视网膜病变；小胶质细胞；IL-6/STAT3信号通路中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1002-4379（2024）02-0101-05Effects and Mechanisms of Baicalin on Activation of Retinal Microglial Cells in Diabetic Rats LU Lingyu,WANG Linhong.Tangshan Eye Hospital,Tangshan 063016,ChinaAbstract OBJECTIVES To explore the impact of baicalin on the activation of retinal microglial cells in diabetic rats and its underlying mechanism.METHODS Diabetes model was induced in rats via intraperitoneal injection of streptozotocin,and they were randomly assigned to the model group(MG)and baicalin group(BG).Healthy rats constituted the control group(CG),with 12 rats in each group.The BG rats were orally administered a baicalin solution(50 mg/kg)daily,while CG and MG rats received an equivalent volume of distilled water orally for 12 weeks.After 12 weeks,blood glucose levels were measured,and the right eyeballs were enucleated for histological examination using hematoxylin-eosin(HE)staining to observe retinal morphology.Immunohistochemistry was used to detect the expression of cluster of differentiation 68(CD68)protein in retinal microglial cell clusters.Immunofluorescence was employed to assess the expression of signal transducer and activator of DOI:10.13444/ki.zgzyykzz.2024.02.001作者单位：1 唐山市眼科医院，唐山 0630162 华北理工大学附属医院，唐山 063016通讯作者：王林洪，E-mail：101中国中医眼科杂志2024 年 2 月第 34 卷第 2 期transcription 3(STAT3)protein.Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)was conducted to measure the relative expression levels of interleukin-6(IL-6)and STAT3 mRNA.RESULTS(1)Retinal morphology:Compared to the CG group,MG rats showed a significant increase in loss of retinal ganglion cells(RGC),while BG rats exhibited an increase in RGC count.Retinal thickness was reduced in the MG group compared to the CG group,while the BG rats had a thicker retina than the MG rats.(2)Microglial cells:In the CG group,microglial cells were localized in the inner nuclear layer.MG rats had an increased number of microglial cells distributed throughout every layer of the retina,whereas BG rats had fewer microglial cells compared to the MG rats,and microglial cell migration was restricted.CD68 expression in retinal microglial cells was higher in the MG group than in the CG group(t=7.348,P=0.000),and lower in the BG group than in the MG group(t=2.449,P=0.019),with all statistically significant differences.(3)STAT3,IL-6:In the CG group,retinal STAT3 expression was mainly distributed in the inner plexiform layer.MG rats exhibited abundant positive expression of STAT3 in every retinal layer,while BG rats showed significantly weaker STAT3 expression compared to the MG group.The expression of STAT3 and IL-6 mRNA in the MG group was higher than in the CG group(tSTAT3=9.935,tIL-6=17.501,both P=0.000),and lower in the BG group than in the MG group(tSTAT3=8.432,tIL-6=9.944,both P=0.000),with all statistically significant differences.CONCLUSIONS Baicalin can inhibit the activation of retinal microglial cells in diabetic rats,and its mechanism may be related to the IL-6/STAT3 signaling pathway.Keywords baicalin;diabetic retinopathy;microglial cells;IL-6/STAT3 signaling pathway小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞1，其被激活后大量表达白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6），而IL-6介导慢性炎症反应2，在许多炎症反应中表达升高3，并将信号转导和转录激活因子 3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）通路激活，导致炎症反应加强，可促进视网膜变性及细胞凋亡的发生。IL-6/STAT3是经典的炎症信号通路，而该通路可进一步促进小胶质细胞的激活，形成了一个正反馈循环，加重了视神经变性及神经节细胞的凋亡4。近年来，中药在慢性疾病的治疗中被广泛应用5，黄芩苷是从中药黄芩中提炼出来的黄酮类化合物，有抗炎、抗氧化作用6。有研究7表明，天然黄酮类化合物有改善糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的作用，并且对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠神经病变也有预防作用。本研究旨在讨论黄芩苷对小胶质细胞激活的影响，及作用机制是否与IL-6/STAT3信号通路有关。1材料与方法1.1实验动物60只雄性 SD大鼠，6周龄，体重 200250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2021-0001。所有大鼠在恒温恒湿的环境饲养，自由进食，室温2022，昼夜循环照明，定期检查大鼠眼部健康状况。本研究实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的 实验动物管理条例 相关规定。1.2药品、试剂与仪器链 脲 佐 菌 素（上 海 柯 意 哲 科 学 实 验 室，SS9500），黄芩苷（西安圣青生物科技有限公司，S31635），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色剂（南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 有 限 公 司，20210102），冰 醋 酸（天 津 市 化 学 试 剂 公 司，20201122），STAT3 引物、IL-6 引物（上海弗元生物科技有限公司，GS0830、KT1340），鼠抗簇分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）抗 体、鼠 抗STAT3 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，SC20020、SC8019），实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，BL698A）。多功能智能显微镜、光学显微镜（日本OLYMPUS公司，BX-64、CKX53），石蜡切片机、烤片机（科迪仪器设备有限公司，KD-202A、KDTHII），PCR 仪（美国贝克曼库尔特公司，ABI7500）。1.3糖尿病大鼠模型建立选取40只大鼠，单次腹腔注射STZ建立糖尿病102中国中医眼科杂志2024 年 2 月第 34 卷第 2 期模型。将STZ溶于柠檬酸钠溶液中，以60 mg/kg的剂量腹腔注射，其余20只大鼠腹腔注射等剂量柠檬酸钠溶液。连续3 d测定大鼠空腹血糖，将每次血糖均16.7 mmol/L的大鼠判断为糖尿病模型建立成功8。若造模过程中出现死亡或者血糖不达标的大鼠不计算在内，继续选取同批大鼠进行造模，确保最后造模成功的大鼠总数为40只。1.4分组与给药将造模成功的大鼠随机分为模型组（model group，MG）和黄芩苷组（baicalin group，BG），另将对照的20只大鼠设为对照组（control group，CG），每组20只。BG组大鼠给予黄芩苷水溶液（50 mg/kg）每日清晨灌胃，CG组、MG组大鼠给予同体积的蒸馏水灌胃，连续给药12周。在整个研究过程中，密切观察大鼠的生理状态，剔除生理状态差、体重差异大以及在实验中死亡的大鼠后，在12周时发现BG组剩余17只、MG组剩余14只、CG组剩余19只，于每组中再次采用随机抽样的方法各选取12只大鼠进行实验。1.5标本取材所有大鼠在12周时先禁食12 h，然后测量血糖并记录。麻醉后立即摘取大鼠右眼眼球，浸入固定液中固定 30 min 后取出眼球，在眼球左右对称开口，再次放入固定液中固定24 h，进行石蜡切片，用于组织病理学实验。1.6HE染色切片常规脱蜡后水化，分别使用苏木素和伊红进行染色，然后进行梯度浓度乙醇和二甲苯浸泡，最后向切片滴入中性树胶封片，静置于通风处24 h。自然风干后放入切片盒中，使用光学显微镜检查视网膜形态，选取合适视野进行拍摄。1.7免疫组织化学法测量CD68蛋白表达切片常规脱蜡后水化，进行抗原修复，封闭10 min。重复洗涤3次后，滴加鼠抗CD68抗体（稀释比例1 200），放入4 冰箱24 h。次日洗涤3次后，加入试剂B，放置入湿盒中20 min，再次洗涤3次。然后加入试剂C，室温下反应10 min，洗涤3次。显色后放入苏木素中30 s进行复染，洗涤后再加至梯度浓度乙醇和二甲苯中浸泡。最后滴加中性树胶风干，在显微镜下拍照。以细胞核呈现棕黄色的细胞为阳性表达，使用 Image-Pro Plus 软件测量光密度值。1.8免疫荧光法测量STAT3蛋白表达切片常规脱蜡后水化，进行抗原修复，封闭10 min。重复洗涤3次后，滴加鼠抗STAT3抗体（稀释比例1 200），放入4 冰箱24 h。次日洗涤3次后，滴加羊抗鼠二抗（稀释比例1 200），室温下避光孵育60 min，再次洗涤后，进行染色，于显微镜下观察并拍照。1.9RT-qPCR法测定IL-6、STAT3 mRNA的相对表达量提取视网膜组织中RNA，RNA通过逆转录酶合成cDNA，进行逆转录。按照说明书配置及设计引物（表1），将试剂在管内混匀，每个样本设置3个副孔，放入 PCR 仪中，进行扩增。首先 94 反应3 min，然后94 反应20 s60 反应20 s72 反应30 s，循环40次，最后72 反应5 min。以-肌动蛋白（-actin）作为内参照蛋白，以相对定量法2-Ct计算IL-6、STAT3 mRNA的相对表达量。1.10统计学方法本研究采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量 资 料 以 均 数 标 准 差（x s）表 示。方 差 分 析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用 LSD-t 检验。当 P0.05 时，认为差异有统计学意义。2结果2.1黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜形态的影响与 CG 组相比，MG 组大鼠视网膜神经节细胞（retina ganglion cell，RGC）丢失明显增多，而经黄芩苷治疗后的BG组大鼠RGC数量增加；MG组大鼠视网膜厚度较 CG 组薄，而 BG 组大鼠视网膜厚度较MG组厚（图1）。2.2黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的影响CG组小胶质细胞局限在内核层；MG组小胶质表1qRT-PCR实验相关引物信息基因IL-6STAT3-actinF（5-3）AGCCCACCAGGAACGAAAGGACCCGCCAACAAATTAAGAGCAGGAGTACGATGAGTCCGR（5-3）GGAAGGCAGTGGCTGTCAATGGTGTCCAGTTTACCACGAACGCAGCTCAGTAACAGTCC注：RT-qPCR 实时荧光定量PCR；IL-6 白细胞介素-6；STAT3 信号转导和转录激活因子3；-actin-肌动蛋白。103中国中医眼科杂志2024 年 2 月第 34 卷第 2 期细胞数量增多，且分布在视网膜的每一层中；BG组小胶质细胞数量较MG组少，且小胶质细胞迁移受限（图2）。3组间大鼠视网膜小胶质细胞CD68表达比 较（表 2），差 异 有 统 计 学 意 义（F=28.000，P=0.000）。MG 组 CD68 表达高于 CG 组（t=7.348，P=0.000），BG 组 CD68 表达低于 MG 组（t=2.449，P=0.019），差异均有统计学意义。2.3黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜STAT3、IL-6表达的影响CG 组视网膜 STAT3 表达主要分布在内丛状层，而MG组视网膜各层均有大量STAT3阳性表达，BG组视网膜各层中STAT3表达明显弱于MG组（图3）。3 组间大鼠视网膜 STAT3 mRNA、IL-6 mRNA的表达比较（表 2），差异均有统计学意义（FSTAT3=57.365、FIL-6=209.75，均 P=0.000）。MG 组 视 网 膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA 表达高于 CG 组（tSTAT3=9.935、tIL-6=17.501，均P=0.000），BG组视网膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达低于MG组（tSTAT3=8.432、tIL-6=9.944，均P=0.000），差异均有统计学意义。3讨论在健康的视网膜中，小胶质细胞通过释放神经保护因子和抗炎因子参与视网膜防御免疫系统。然而，如果持续面对炎症刺激，长期激活的小胶质细胞会释放过量的细胞因子而导致神经炎症9，致使神经节细胞凋亡。因此，针对小胶质细胞的药物治疗以减轻慢性神经炎症，可能是保护神经节细胞的一种有效的方法。黄芩苷是一种多靶点药物，具有抗氧化和抗炎等多种保护作用。IGNACIO S等10发现，使用黄芩苷干预肌萎缩侧索硬化症模型小鼠，使CD68等小胶质细胞标志物的表达下调。还有研究11表明，黄芩苷可能是调节中枢神经系统炎症反应和细胞凋亡的药物。因此，为了评估黄芩苷是否可以抑制小胶质细胞的激活，本研究对小胶质细胞标记物CD68进行免疫组织化学染色以定量定位观察，发现CG组大鼠视网膜上只有在视网膜内核层中可以检测到小胶质细胞，而MG组大鼠除了内核层中小胶质细胞增多外，其余各层中也出现了小胶质细胞。值 2A 2B 2C 注：2A 对照组（CG）；2B 模型组（MG）；2C 黄芩苷组（BG）；棕色为CD68阳性表达；蓝色为细胞核。图2黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的影响（免疫组织化学染色，200）1A 1B 1C 注：1A 对照组（CG）；1B 模型组（MG）；1C 黄芩苷组（BG）；黑色箭头示核固缩以及空泡样变；RGC 视网膜神经节细胞；HE 苏木精-伊红。图1黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜形态的影响（HE染色，200）表2黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达的影响（x s，n=12）组别CG组MG组BG组F值P值CD680.090.010.120.01*0.110.01#28.0000.000STAT3 mRNA1.000.492.190.10*1.180.09#57.3650.000IL-6 mRNA1.000.523.780.18*2.430.17#209.750.000注：*与 CG 组比较，P0.05；#与 MG 组比较，P0.05；CG 对照组；MG 模型组；BG 黄芩苷组；CD68 簇分化抗原68；STAT3 信号转导和转录激活因子3；IL-6 白细胞介素-6。104中国中医眼科杂志2024 年 2 月第 34 卷第 2 期得注意的是，黄芩苷治疗后的BG组大鼠视网膜各层中的小胶质细胞显著减少，几乎阻止了DR导致的小胶质细胞激活，表明经黄芩苷干预后，在一定程度上可抑制小胶质细胞的激活。IL-6是激活的小胶质细胞高表达的炎症因子，而IL-6与其受体复合物的结合可导致STAT3的激活，并激活细胞内外2条促凋亡信号通路。研究12表明，受体结合后通过直接的凋亡作用或者采用间接干扰生长因子，如胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）和胰岛素受体的细胞内物质，来诱导神经元死亡。而这些细胞内物质的最可能来源是视网膜小胶质细胞，引起促炎细胞因子的分泌增加，进一步使视网膜炎症反应加剧，导致视网膜变性及神经节细胞的凋亡13。在本实验中可发现，经黄芩苷治疗后的 BG 组大鼠视网膜中STAT3 mRNA及IL-6 mRNA的表达量较MG组大鼠下降，表明黄芩苷抑制了STAT3和IL-6的表达。综上所述，本研究发现黄芩苷可抑制DR大鼠模型视网膜的小胶质细胞的激活，降低了各项炎症指标，该作用机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。本研究可为DR药物研发提供新的方向。参考文献1KETTENMANN H,HANISCH UK,NODA M,et al.Physiology of microgliaJ.Physiol Rev,2011,91(2):461-553.2SHENG T,WANG B,WANG SY,et al.The Relationship Between Serum Interleukin-6 and the Recurrence of Hepatitis B Virus Related Hepatocellular Carcinoma after Curative ResectionJ.Medicine(Baltimore),2015,94(24):e941.3CULIG Z.Cytokine disbalance in common human cancers-ScienceDirectJ.Biochim Biophys 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