覆盖作物不同生育期土壤和叶际微生物的动态变化研究.pdf

21昭 通 学 院 学 报第 45 卷 第 5 期Vol.45 No.5Journal of Zhaotong University2023 年 10 月Oct.2023高原特色农业研究覆盖作物不同生育期土壤和叶际微生物的动态变化研究许留兴#，罗昌芬#，蒙元燕#，刘丽，张小龙，郑晋静，何绍申，季成佳，祁启树，武 丹，蔡荣靖（昭通学院 农学与生命科学学院，云南 昭通，657000）摘要：为研究植物生长环境中的微生物变化，以田间种植的 5 种冬季覆盖作物为研究对象，研究覆盖作物不同生育期土壤和叶际微生物变化情况，探明其变化机理。采用传统微生物分离方法（稀释平板计数法）对覆盖作物不同生育期土壤和叶际的可培养微生物进行了数量统计。结果显示：在不同覆盖作物种植下土壤微生物数量均逐渐增加，在蜡熟期略微下降，其中小黑麦的微生物数量最多。叶际微生物变化特征不明显。研究的禾本科覆盖作物中，种植小黑麦最有利于增加土壤和环境微生物数量，对改善环境和改善土质均具有重要意义。关键词：覆盖作物；土壤和叶际微生物；生育期中图分类号：S31文献标志码：A文章编号：2095-7408（2023）05-0021-06收稿日期：2023-05-05基金项目：云南省基础研究计划项目（202301AU070035）；云南省地方本科高校（部分）基础研究联合专项（202301BA070001-120）；昭通鲲鹏人才项目。作者简介：#对本文贡献等同，为共同第一作者。许留兴（1991），男，贵州六盘水人，副教授，博士，主要从事牧草栽培与青贮研究。罗昌芬（1999），女，云南昭通人，主要从事植物微生物研究。蒙元燕（1993），女，布依族，贵州黔南人，助理研究员，硕士，主要从事叶际微生物研究。覆盖作物指的是在农业生产间隙种植，使土壤在时间或空间上减少或避免裸露的一种作物，被认为是一种新型的保护性耕作方式1。研究发现，覆盖作物可提供高达 65.3%的地面覆盖，有效避免了砂壤土风蚀潜力增加的负面影响、优化了土壤板结，增加了微生物多样性等问题2。我国从20 世纪 50 年代开始种植覆盖作物，南方种植面积增长较快3，随后由于化肥工业的发展和除草剂的使用，覆盖作物种植面积逐渐减少，但是长期大量施用化肥导致的土壤问题，如土壤板结4、土壤微生物数量减少等5，成为全球农业面临的一个重要挑战6。近年来，由于国家政策补贴以及各地开展的绿肥公益项目，覆盖作物重新受到了重视7。从 1967 年，研究者发现意大利黑麦草是免耕玉米生产体系中适宜的越冬覆盖作物，自此覆盖作物的研究及应用越来越活跃8。在化肥过度使用背景下，种植覆盖作物改善环境和土壤质量成为了目前研究热点9。研究表明，覆盖作物种植可以增加叶际微生物多样性，尤其增加了土壤有益微生物的数量10还能有效抑制杂草的生长11。魏静12等研究得出，在作物的整个生长周期中，种植覆盖作物的土壤微生物量均显著高于未种植覆盖作物的土壤。上世纪后期，美国13、加拿大14和荷兰15等国家也种植覆盖作物来改善土壤生态和提高生产力16。虽然覆盖作物的种植仍存在一定的局限，例如种植不当或管理不当，容易导致作物减产等问题17，但是其在增加土壤微生物和叶际微生物数量、实现农业可持续发展18方面仍具有重要的应用价值。研究覆盖作物不同生育期微生物的变化，可以明确微生物的变化趋势，对于覆盖作物的收割时间和作物的栽培时间选取，以达到作物产量最大化、耕地利用、生态环境最优化具有重要的指导意义。研究覆盖作物不同生育期土壤和叶际微22第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年（总第 210 期）生物变化情况，探明其变化机理，其在化肥工业发展大量使用化肥造成的土壤污染情况下，实现土壤微生物数量的增加、叶际微生物多样性增加，以期能为后续相关研究提供基础数据和理论支撑。1 实验部分1.1 试验地概况试验地位于昭通市昭通学院农学与生命科学学院试验基地（中国，云南，27。33 N，103。77E）。海拔为1912 m，属于亚热带季风性气候，冬季气温较低，夏季气候凉爽，干湿两季分明。1.2 实验材料、试剂、仪器和设备表 1 试验材料、试剂、仪器和设备材料试剂仪器设备小麦、燕麦、黑麦、大麦和小黑麦的叶际和根际土壤培养基MRS培养基、阿须贝氏培养基、高氏合成1号培养基、营养琼脂（NA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、无菌水、酒精和生理盐水培养皿、试管、涂布器、移液枪、酒精灯和振荡器101-2A 电热鼓风干燥箱、SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台、YC-330GL 医用冷藏箱、LI-9162 电热恒温培养箱、DH-420AB 电热恒温培养箱、SW-CJ-1D 净化工作台和 DGL-100B 立式蒸汽灭菌器1.3 试验方法1.3.1 材料准备于云南石丰种业有限公司购进小麦（Triticum aestivum L.）种子，河南世纪天缘生态科技有限公司购进燕麦（Avena sativa L）、意大利黑麦草（Lolium perenne L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）和小黑麦（Secale cereale L.）种子，2021 年 9 月-2022 年5 月在试验地进行播种和田间管理。将五种覆盖作物分别播种于试验地，每个处理 3 个重复，每小区12 m2（3 m 4 m）。播种前，土壤要求细碎平整，撒播，播深 4 cm-5 cm，播种密度小麦种子、小黑麦种子、大麦种子和燕麦种子 330 万株/hm2；意大利黑麦草种子的播种量为 23 kg/hm2。本实验采用灌溉的方式为喷灌，每周定期浇水一次；施肥（复合肥 N:P2O5:K2O=2:1:1）：于 2021 年 10 月 22 日（N：182 g/m2，P2O5：91 g/m2和 K2O：91 g/m2）和2022 年 3 月 2 日（N：109.2 g/m2，P2O5：54.6 g/m2和 K2O：54.6 g/m2）施肥两次。1.3.2 样品预处理对种植于昭通学院试验地不同生育期（苗期：11 月 14 日，拔节期：1 月 3 日，乳熟期：4 月 3日和蜡熟期：5 月 14 日）覆盖作物（小麦、燕麦、意大利黑麦草、大麦和小黑麦）的叶际和根际土壤分别进行采样，样品放置-20 冷藏备用。每种覆盖作物不同生育期分别随机采样 3 份，采样时工具应用 75%酒精消毒，除去表层 2 cm，取地上部分近 10 cm-20 cm 约 10 g 的土壤，叶际的采样工具同样用 75%酒精消毒，取覆盖作物距地面4-5 cm 以上全部植株约 10 g，放入无菌袋中然后放置-20 冰箱中暂存，作为本实验的供试材料。1.3.3 微生物数量测定叶际和土壤微生物分离：取 10 g 样品放置90 ml 生 理 盐 水（0.9%，pH7.0）150 r/min 振 荡30 min，将叶际微生物洗脱，得到 10-1稀释的洗脱液备用。采用稀释涂布平板法分离测定覆盖作物各生育期可培养微生物数量，振荡后，用移液枪吸取上述洗脱液 1 mL 放入装有 9 mL 无菌水的试管中得到 10-2样品稀释液，按照此方法 10 倍稀释，最后吸取合适浓度的稀释液 25 L 分别涂布在营养琼脂培养基（好氧细菌）、MRS 琼脂培养基（乳酸菌）、LB 培养基（大肠杆菌）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（真菌、酵母菌和霉菌）、高氏一号培养基（放线菌）、阿须贝氏培养基（固氮菌）上，重复三次。37 有氧培养 24 h 后，统计营养琼脂培养基上好氧微生物菌落数量；28 有氧培养 96 h后，统计马铃薯葡萄糖琼脂培养基上酵母菌和霉菌菌落数量；37 厌氧培养 48 h 后，统计 MRS 培养基上乳酸菌菌落数量；28 有氧培养 168 h 后统计放线菌和固氮菌的菌落数量；37 有氧培养48 h 后，统计结晶紫中性红胆盐琼脂培养基上大肠杆菌菌落数量。计算微生物的公式为：每 g 土23第 5 期覆盖作物不同生育期土壤和叶际微生物的动态变化研究许留兴，罗昌芬，蒙元燕，等壤样品所含的菌落数=菌落平均数 10 稀释倍数，最后结果转换为 lg cfu/g FW（cfu 为菌落形成单位，FW 为鲜重）。1.4 数据分析采用Excel 2016软件对试验数据进行统计整理，用 SPSS（IBM SPSS Statistics V26.0）对数据整理分析和差异显著性检验，显著性水平为 0.05 和 0.01。2 结果与分析2.1 不同作物类型和不同生育期对叶际可培养微生物数量的影响由表 2 和表 3 可知，作物类型和生育期交互仅对叶际真菌和酵母菌数量有显著影响（P0.05）；覆盖作物类型对除放线菌、酵母菌和固氮菌外的微生物数量有显著影响（P0.05），其中对细菌、乳酸菌、大肠杆菌、真菌和霉菌数量有极显著影响（P0.01）。小黑麦的真菌数量显著高于小麦、燕麦、意大利黑麦草和小黑麦（P0.05），但意大利黑麦草的固氮菌数量最多。不同生育期对酵母菌数量有显著影响（P0.05）。表 2 作物类型和生育期对叶际细菌、乳酸菌、大肠杆菌和放线菌数量的影响作物类型和生育期细菌(lg cfu/g FM)乳酸菌(lg cfu/g FM)大肠杆菌(lg cfu/g FM)放线菌(lg cfu/g FM)作物类型小麦2.600.83c1.931.45b1.361.25b0.81.02a燕麦3.210.23b3.141.48a3.840.74a0.160.55a意大利黑麦草4.180.14a3.380.28a4.100.30a0.220.75a大麦3.030.31b3.500.17a3.860.21a0.160.55a小黑麦4.230.19a3.060.99a4.260.18a0.31.04a生育期苗期3.670.63a3.171.30a3.591.01a0.470.81a拔节期3.271.12a2.711.42a3.381.76a0.130.49a开花期3.510.65a3.360.41a3.541.16a0.170.67a蜡熟期3.350.56a2.771.17a3.421.12a0.541.16a显著性作物类型0.0000.0040.0000.266生育期0.5200.3430.9660.420交互0.4140.7480.0510.293注：表中所列不同小写字母表示不同作物类型或生育期差异显著（P0.05）；覆盖作物类型对土壤细菌、大肠杆菌、真菌、霉菌和固氮菌数量具有极显著影响（P0.01），对放线菌数量具有显著影响（P0.05）；生育期对乳酸菌和霉菌数量具有极显著影响（P0.01），对放线菌数量具有显著影响（P0.05）。小黑麦的根际土壤细菌、大肠杆菌、真菌和霉菌数量分别是小麦的1.21、1.08、1.07和1.07倍，是燕麦的1.34、1.20、1.11和1.10倍，是意大利黑麦草的1.23、1.12、1.20和 1.07 倍，是大麦的 1.32、1.18、1.13 和 1.10 倍。开花期根系土壤微生物数量均最多，苗期细菌、大肠杆菌、真菌和霉菌数量最少，拔节期放线菌和固氮菌数量最少。表 4 作物类型和生育期对土壤细菌、乳酸菌、大肠杆菌和放线菌的影响作物类型和生育期细菌(lg cfu/g FM)乳酸菌(lg cfu/g FM)大肠杆菌(lg cfu/g FM)放线菌(lg cfu/g FM)作物类型小麦6.040.10b5.100.29ab5.600.08b4.260.18a燕麦5.450.29c4.990.23ab5.080.11d4.140.22a意大利黑麦草5.950.08b4.920.17b5.410.22c3.551.15b大麦5.510.29c5.090.31ab5.130.09d3.970.27ab小黑麦7.300.11a5.230.34a6.040.07a4.260.22a生育期苗期6.000.67a5.020.25b5.360.38a3.970.25ab拔节期6.010.73a5.000.34b5.480.42a3.771.07b开花期6.160.72a5.310.13a5.510.35a4.370.16a蜡熟期6.030.75a4.930.25b5.460.36a4.030.25ab显著性作物类型0.0000.0870.0000.013生育期0.9240.0010.7110.046交互0.3370.8560.9180.428表 5 覆盖作物不同生育期土壤的真菌、霉菌、酵母菌和固氮菌菌落变化作物类型和生育期真菌(lg cfu/g FM)霉菌(lg cfu/g FM)酵母菌(lg cfu/g FM)固氮菌(lg cfu/g FM)作物类型小麦4.530.15b4.610.10b0.901.63a3.431.10a燕麦4.390.15c4.560.13b1.531.89a3.890.25a意大利黑麦草4.100.22d4.610.19b1.501.85a1.851.94b大麦4.290.23c4.630.13b1.851.94a3.960.26a小黑麦4.860.11a4.940.24a2.151.90a3.870.24a生育期苗期4.310.28a4.510.15c1.701.88a3.201.31ab拔节期4.430.36a4.650.17b1.721.91a2.861.79b开花期4.550.28a4.840.20a1.961.90a3.980.29a蜡熟期4.440.29a4.680.20b0.961.65a3.561.01ab显著性作物类型0.0000.0000.5510.000生育期0.2220.0000.4810.090交互0.7110.3840.1680.0633 讨论3.1 覆盖作物和生育期对叶际微生物数量的影响本研究发现叶际微生物在覆盖作物不同生育期变化特征不明显，不同作物类型对酵母菌有显著影响，与前人的研究类似，其原因是受环境因素的影响。叶际微生物生存条件恶劣，易受天气、温度、湿度和紫外线等因素的影响，叶际微生物25第 5 期覆盖作物不同生育期土壤和叶际微生物的动态变化研究的数量随环境的变化而变化13。但覆盖作物叶际仍存在大量微生物，虽然酵母菌、固氮菌和放线菌在作物叶际的存在数量较少，但乳酸菌（青贮饲料中的关键微生物之一）、大肠杆菌（人畜共患致病菌）和霉菌（引起青贮饲料霉变的重要微生物之一）等重要微生物却一直存在于作物的整个生育期。3.2 覆盖作物和生育期对土壤微生物数量生物的影响对比冬闲田，覆盖作物能够减少冬季地表裸露，提高土壤微生物数量19。此外，冬季覆盖作物，可以通过增加农田作物多样性并丰富土壤中的根际沉积物，从而为微生物活动提供大量新鲜有机质和养分来源，有利于增加土壤微生物数量20。在本研究中，覆盖作物对细菌、大肠杆菌、真菌、霉菌和固氮菌和放线菌数量具有显著影响，覆盖作物均增加了土壤微生物数量，且随着覆盖作物的生长，土壤可培养微生物的数量也会随之增加，基本呈逐渐上升的趋势。这与前人研究结果一致21。3.3 综合分析叶际微生物是影响环境的重要因素之一9，土壤微生物是衡量土壤肥力的重要参考指标22，因此，覆盖作物对土壤和叶际微生物数量的影响受到广泛关注23。叶际和土壤微生物发挥着重要的生态功能24，叶际微生物之所以能与植物长期共存，这归因于微生物的不同策略以及与植物的相互作用，从而形成独特的共栖、互惠、拮抗等植物-微生物共生体系。叶际微生物群落结构随着环境的变化而变化，可以作为衡量生态环境的指标之一25。本研究发现，覆盖作物叶际微生物主要以细菌和真菌为主，土壤微生物多以细菌为主。与甄莉娜26等人的研究结果一致，这可能是由于大部分真菌和放线菌具有较强自养能力，能够在养分缺乏的环境中获得营养物质，而细菌的生存依赖于有机物的含量。此外，尽管叶片和根系是植物与外界进行营养和能量交替最密集且敏感的场所，但土壤环境相对稳定，受外界环境干扰较小，因此拟合出的R2整体变化较平缓（表6）。表 6 覆盖作物不同生育期土壤和植物各微生物数量拟合方程环境微生物种类拟合方程植物细菌y=-0.072x+3.63，R2=0.2746乳酸菌y=-0.055x+3.14，R2=0.0512大肠杆菌y=-0.035x+3.57，R2=0.2092放线菌y=0.025x+0.265，R2=0.0242真菌y=-0.06x+4.52，R2=0.4225霉菌y=-0.046x+3.185，R2=0.5343酵母菌y=-0.176x+0.79，R2=0.306固氮菌y=0.307x+0.63，R2=0.5248土壤细菌y=0.024x+5.99，R2=0.1735乳酸菌y=0.004x+5.055，R2=0.0009大肠杆菌y=0.033x+5.37，R2=0.4296放线菌y=0.078x+3.84，R2=0.1629真菌y=0.051x+4.305，R2=0.4504霉菌y=0.07x+4.495，R2=0.4455酵母菌y=-0.198x+2.08，R2=0.3484固氮菌y=0.22x+2.85，R2=0.34894 结论覆盖作物根际土壤可培养微生物数量均多于叶际。土壤微生物随着作物生育期呈现规律性增加，蜡熟期微生物数量较少。小黑麦的土壤微生物数量显著高于其他作物，种植小黑麦有利于增加土壤细菌、大肠杆菌、真菌和霉菌数量。参考文献：1 隋鑫,霍海南,鲍雪莲,等.覆盖作物的种植现状及其对下茬作物生长和土壤环境影响的研究进展 J.应用生态学报,2021,32(8):2666-2674.2 Blanco-Canqui H,Sindelar M,Wortmann CS,et al.Aerial interseeded cover crop and corn residue harvest:Soil and crop impactsJ.Agronomy Journal,2017,109(4):1344-1351.3 严磊.覆盖作物根系对砂姜黑土压实的响应及缓解研究 D.桂林:桂林理工大学,2020.4 曹锐.覆盖作物栽培对土壤质量的影响 J.水土保持应用技术,2019,3(1):10-12.5 张红珍.农药化肥使用不当的危害及提高农产品质量安全的方法 J.现代农业科技,2022,2(4):203-204.6 Oliveira M C,Osipitan O A,Begcy K,et al.Cover crops,hormones and herbicides:priming an integrated weed manage ment strategyJ.Plant Science,2020,301(1):1-12.7 王红岩.魔芋与玉米间作下覆盖作物对魔芋生长及土壤理化性状与微生物结构的影响 D.天津:天津农学院,2020.许留兴，罗昌芬，蒙元燕，等26第 45 卷2023 年（总第 210 期）昭 通 学 院 学 报8 Mitchell W H,Teel M R.Winter-annual cover crops for no-tillage corn productionJ.Agronomy Journal,1977,69(4):569-573.9 刘宇星,董醇波,邵秋雨,等.叶际微生物与植物健康研究进展 J.微生物学杂志,2022,42(2):88-98.10 Castellano H A,Strauss S L.Impact of cover crops on the soil microbiome of tree ropsJ.Microorganisms,2020,8(4):328.11 Mirsky S B,Curran W S,Mortensen D A,et al.Timing of cover crop management effects on weed suppres sion in no-till planted soybean using a roller crimperJ.Weed Science,2011,59(3):380-389.12 魏静,郭树芳,翟丽梅,等.覆盖作物翻压对华北平原春玉米产量和土壤养分的影响 J.中国土壤与肥料,2020,10(1):172-178.13 刘志,崔丽华.覆盖作物在美国玉米带的应用 J.水土保持应用技术,2008,6(4):11-12.14 Martens J R T,Hoeppner J W,Entz M H.Legume cover crops with winter cereals in southern Manitoba:establishment,productivity,and microclimate effectsJ.Agronomy Journal,2001,93(5):1086-1096.15 Kruidhof H M,Bastiaans L,Kropff M J.Ecological weed management by cover cropping:Effects on weed growth in autumn and weed establishment in springJ.Weed Research,2008,48(6):492-502.16 刘晓冰,宋春雨,Herbert S J,等.覆盖作物的生态效应 J.应用生态学报,2002,3:365-368.17 巴晓博,隋鑫,鲍雪莲,等.覆盖作物-玉米间作对土壤碳氮含量及相关酶活性的影响 J.土壤通报,2022,53(3):577-587.18 蹇述莲,李书鑫,刘胜群,等.覆盖作物及其作用的研究进展 J.作物学报,2022,48(1):1-14.19 Wang Lihong,Hu Yuegao,Yang Guangli,et al.Carbon fixation by winter cover crops in South China and the efects of W CC on rice yieldsJ.Ecology and Environment,2006,15(3):616-619.20 Robinson C A,Cruse R M,Ghaffarzadeh M.Cropping systems and nitrogen effects on mollisol organic carbonJ.Soil Science Society of American Journal,1996,60(1):264-269.21 周陈,李许滨,杨明开,等.冬小麦不同生育期土壤微生物及养分动态变化 J.西北农业学报,2008,17(3):113-116.22 张青,王辰,孙宗湜,等.土壤微生物生物量及多样性影响因素研究进展 J.北方园艺,2022,8(2):116-121.23 赵丽丽,张新民.中国土壤微生物领域研究现状与前沿热点分析 J.农业图书情报学报,2022,34(2):75-87.24 傅小伟,项曼秋,王安.叶菜类蔬菜叶际微生物菌落的动态变化分析 J.北方农业学报,2018,(14):48-52.25 Zhang G B,Bai Z,Hoefel D,et al.The impacts of cypermethrin pesticide application on the non-targetmicrobial community of the pepper plant phyllosphereJ.Science of Total Environment,2009,407(6):1915-1922.26 甄莉娜,李侠,李朕,等.煤矸石山不同植被根际可培养微生物数量的动态变化J.草地学报,2021,29(6):1224-1233.Dynamic Changes of Soil and Phyllosphere Microorganisms in Different Growth Stages of Cover CropsXU Liu-xing#,LUO Changfen#,MENG Yuanyan#,LI Liu,ZHANG Xiaolong,ZHENG Jinjing,HE Shaoshen,JI Chengjia,QI Qishu,WU Dan,CAI Rongjin(School of Agronomy and Life Science,Zhaotong University,Zhaotong 657000,China)Abstract:Five winter cover crops were planted in the field as the research object to study the changes of soil and phyllosphere microorganisms in different growth periods of cover crops,and to explore the change mechanism.The number statistics of culturable microorganisms in soil and phyllosphere of cover crops at different growth stages were carried out by using the traditional microbial separation method(dilution plate counting method).The results showed that the number of soil microorganisms decreased slightly in dough stage compared to seedling,jointing,and flowering stages,among which the number of microorganisms in triticale was the highest.The variation characteristics of phyllosphere microorganisms were not obvious.Among the cover crops studied,planting triticale was the most beneficial to increase the number of soil and phyllosphere microorganisms,which was great significance for improving the environment and soil quality.Key words:cover crops;phyllosphere microorganisms;growth period