基于HRM技术开发水稻糊化温度基因ALK功能标记.pdf

中国水稻科学(Chin J Rice Sci),2024,38(1):106110 106 http:/ DOI:10.16819/j.1001-7216.2024.221203 基于 HRM 技术开发水稻糊化温度基因 ALK 功能标记 王军1,3 周晶2 陶亚军1,3 李文奇1,3 朱建平1,3 范方军1,3 王芳权1,3 许扬1,3 陈智慧1,3 蒋彦婕1,3 李霞1,3 杨杰1,3,*(1江苏省农业科学院 粮食作物研究所/农业农村部淮河下游种质创制重点实验室，南京 210014；2扬州大学 生物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；3扬州大学/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，江苏 扬州 225009;*通信联系人，email:)Development of HRM-based Functional Marker for Gelatinization Temperature Gene ALK in Rice WANG Jun1,3,ZHOU Jing2,TAO Yajun1,3,LI Wenqi1,3,ZHU Jianping1,3,FAN Fangjun1,3,WANG Fangquan1,3,XU Yang1,3,CHEN Zhihui1,3,JIANG Yanjie1,3,LI Xia1,3,YANG Jie1,3,*(1 Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Germplasm Innovation in Downstream of Huaihe River,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Nanjing 210014,China;2 College of Bioscience and Biotechnology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;3 Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;*Corresponding author,email:)Abstract:【Objective】Gelatinization temperature is an important parameter in rice eating quality which is mainly controlled by the ALK gene.Fast and high-throughput gene functional markers for ALK can improve selection efficiency in quality improvement.【Method】According to single nucleotide polymorphism in the functional region of ALK alleles,we developed the gene functional marker based on high resolution melting(HRM)technology.【Result】Through PCR amplification and sequencing test,we selected gene markers ALKH4 and ALKH5 in two functional regions of ALK.ALKH4 and ALKH5 were employed to genotype 81 indica varieties and 279 japonica varieties.The results showed that only 16 japonica varieties and 19 indica varieties carrying G-GC genotype were identified as well as 51 japonica varieties carrying A-GC genotype;while 212 japonica varieties and 62 indica varieties fell into G-TT genotype.【Conclusion】The HRM-based functional markers ALKH4 and ALKH5 could distinguish different genotypes of gelatinization temperature ALK locus in a fast and high-throughput manner,and have significance in breeding practice.Key words:rice;gelatinization temperature;ALK;functional marker;HRM technology 摘 要：【目的】糊化温度是影响稻米蒸煮食味品质的重要指标，ALK 是控制水稻糊化温度的主效基因，开发可快速高通量鉴定 ALK 基因型的功能标记有助于提高水稻品质改良的效率。【方法】根据 ALK 基因 4198 位、4329位和 4330 位存在的单碱基差异，设计基于 HRM 技术检测的基因功能标记。【结果】通过 PCR 检测结合测序分析，筛选了 ALK 基因 2 个功能区域的功能标记 ALKH4、ALKH5。利用 ALKH4、ALKH5 对 81 份籼稻品种、279份粳稻品种进行了 ALK 基因型检测，结果发现，16 份粳稻和 19 份籼稻为 G-GC 基因型；51 份粳稻为 A-GC 基因型；212 份粳稻和 62 份籼稻为 G-TT 基因型。【结论】基于 HRM 技术开发的基因功能标记 ALKH4、ALKH5 可以快速高通量鉴定控制糊化温度 ALK 不同基因型，具有重要的应用价值。关键词：水稻；糊化温度；ALK；功能标记；HRM 技术 随着生活水平的提高，人们对稻米品质的要求越来越高。水稻品质主要包括外观品质、加工品质、食味品质和营养品质，其中稻米的食味品质是品质改良的关键，一般通过直链淀粉含量、糊化温度、胶稠度以及淀粉黏滞性等稻米理化特性指标对蒸煮食味品质进行综合评价1。糊化温度是指淀粉颗粒加热时吸水膨胀，自然的晶体结构被破坏和双折射性丧失，发生非均质改变的不可逆过程时所需要的临界温度，是稻米蒸煮食味品质中仅次于直链淀粉含量的重要指标2。不同水稻品种稻米的糊化温度可分为高、中、低三级，含有中、低级糊化温度的稻米蒸煮后米饭质地柔软、食味特性较好。稻米糊化温度遗传机制较为复杂且易受灌浆期温度等环境因素的影响，ALK 是决定稻米糊化温度的主效基因，该基因编码了可溶性淀粉合成酶 SSa（SS-3）3-5。高振宇等最早通过图位克隆法克隆了 ALK 基因，该基因包含 8 个外显子和 7 个内含子，根据不同品种间 ALK 基因序列差异收稿日期：2022-12-09；修改稿收到日期：2023-02-16。基金项目：江苏省重点研发计划项目(BE2020339)；江苏省种业振兴揭榜挂帅项目(JBGS2021008)。王军等：基于 HRM 技术开发水稻糊化温度基因 ALK 功能标记 107 及碱消法分析结果，推测 ALK 基因编码区内的碱基替换可能引起了支链淀粉晶体层结构的改变，从而导致糊化温度的变化6-7。进一步研究发现，ALK基因第 8 外显子的 3 个 SNP（4198A/T、4329G/T、4330C/T）组合差异对 SSa 功能和淀粉的糊化特性至关重要8-10，等位变异主要分为 A-GC、G-TT 和 G-GC 三种单倍型，其中 G-GC 控制稻米的高糊化温度，A-GC 和 G-TT 主要控制中低糊化温度10-12。高分辨率熔解曲线(High-Resolution Melting，HRM)分析是在实时荧光定量 PCR 基础上发展起来的一项新技术，是基于核酸的物理性质，通过饱和染料监控 DNA 溶解曲线变化14-15，由于其不受突变碱基位点和种类限制，无需序列特异性探针，且具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点，已经成为基因型分析的重要手段16-19。本研究根据ALK 基因 4198 位、4329 位和 4330 位上的序列差异开发了基于 HRM 检测技术的 ALK 基因功能标记，通过 PCR 产物测序的方法对该标记的检查结果进行了验证，并利用该标记对不同来源的水稻品种进行了 ALK 基因型检测分析。利用 HRM 基因功能标记可实现快速、高通量的 ALK 基因型检测，从而提高水稻中低糊化温度育种改良的效率。1 材料与方法 1.1 供试材料 供试水稻材料包括粳稻品种（系）279 份，主要包括江苏省、浙江省、上海市、山东省近年来育成的粳稻新品种（系）；不同地区籼稻品种 81 份，供试水稻材料的名称及类型见附表 1。1.2 ALK 基因功能标记的设计和合成 根据高振宇等6的研究结果，在ALK基因 4198位的SNP（A/G）和4329位、4330位的SNP（GC/TT）的两侧各选取200300 bp的序列，用Primer Premier 5.0 软件设计包含这 2 个变异位点引物，同时设计引物对 ALK 基因进行测序验证，进一步明确功能标记的准确性。本研究所合成引物及相关信息见表 1，引物由上海生工生物工程公司合成。1.3 DNA 提取 在水稻分蘖盛期剪取新鲜幼嫩叶片，采用CTAB 的方法提取水稻基因组 DNA。1.4 HRM 检测 在 qPCR 管中配制 20 L 的反应体系，包括模板 DNA（约 15 ng/L）1.5 L，正反向引物（10 mol/L）各 0.4 L，2ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 L，灭菌双蒸水 7.7 L。在 LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 上进行扩增和溶解曲线分析。反应条件如下：1）预变性，95下 30 s；2）循环反应，95下 10 s；60下 30 s；共 40 个循环；3）溶解曲线，95下 15 s；60下 60 s；95下 15 s。反应结束利用 LightCycler 480 荧光定量分析仪的Tm Calling 和 Gene Scanning 软件进行基因型分析。1.5 ALK 基因测序和序列比对 为明确 ALK 的基因型，对 12 个水稻品种进行PCR 扩增，产物进行了测序。PCR 体系为 50 L,利用试剂盒回收目标条带，由上海生工生物工程公司测序。利用测序引物双向测序，将序列拼接后进行序列比对。2 结果与分析 2.1 基于 HRM 技术的 ALK 基因功能标记的筛选 利用测序引物 ALKC-1 对 9311、明恢 78、W030、常农粳 5 号、常农粳 6 号、华粳 4 号、镇稻 88、苏表 1 基于序列差异设计的功能标记和测序引物 Table 1.Functional markers and sequencing primers designed based on nucleotide polymorphism.引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence(5-3)片段大小 Expected size/bp 扩增位点 Amplification site ALKH-1F TGGCGTACGGCACCGTCCC104A/G ALKH-1R GTCGAACGTCCACCCGAGGALKH-2F GCCGCACAAGCTCATCGAG104TT/GCALKH-2R TGAGGTCCTGCGACATGCCALKH-3F TCGGCGGGCTGAGGGA69A/G ALKH-3R CGAACGTCCACCCGAGGCALKH-4F CACCGTCCCCGTCGTG 73A/G ALKH-4R GGTGTCCTCGAACGGGTCALKH-5F CGTACCGCAAGTACAAGGAG66TT/GCALKH-5R AGCTGAGGTCCTGCGACAALKH-6F TCGAGACGTACCGCAAGTACAA82TT/GCALKH-6R GCGTGGTCCCAGCTGAGGALKC-1F GGTGGGGTTCTCGGTGAAG687测序 SequencingALKC-1R GCATCAATGGACATAACAAACAC108 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第 38 卷第 1 期(2024 年 1 月)粳 8 号、徐稻 3 号、盐粳 11、扬中稻 1 号和镇稻9469 共 12 个品种的 ALK 基因的 4198 位、4329 位和 4330 位的基因型测序。结果表明，6 个品种在ALK 基因的 4198 位为 A 碱基，6 个品种为 G 碱基；5 个品种在 4329、4330 位为 TT 基因型，7 个品种为 GC 基因型（附表 1）。以这 12 个品种为试验材料，进行基于 HRM 技术的 ALK 基因功能标记的筛选。当扩增片段长度为100 bp 时，ALKH1 不能区分 ALK 基因 4198 位的单碱基差异（图 1-A），而 ALKH2 能较好地区分 ALK基因 4329 位、4330 位相邻的 2 个碱基（图 1-D）。当扩增片段减少到 70 bp 时，ALKH3、ALKH4 能够显著区分4198位的单碱基（图1-B、C）；ALKH5、ALKH6 也能较好地区分 4329 位、4330 位的不同基因型（图 1-E、F）。结合溶解曲线分析结果，选择ALKH4 和 ALKH5 作为 ALK 基因的功能标记。2.2 ALK 基因功能标记的基因型鉴定 为了进一步检验 ALK 基因功能标记的效果，利用 ALKH4、ALKH5 对以扬辐粳 8178 为母本（4198、4329和4330位基因型为G-TT），泗稻17-543（4198、4329 和 4330 位基因型为 A-GC）为父本杂交自交获得的 24 个 F2分离群体进行基因型检测。结果表明，ALKH4、ALKH5 不仅能够检测不同的纯合基因型，而且能够鉴定杂合基因型（图 2）。2.3 ALK 基因功能标记的验证 为了进一步验证ALK4、ALK5检测的准确性，利用测序引物对随机挑选含有不同基因型的品种和单株 ALK 基因功能位点进行扩增，扩增产物测序结果和基因功能标记检测结果完全一致，部分测序结果见图 3。因此，利用基因功能标记 ALK4、ALK5可以准确鉴定 ALK 基因的不同基因型。2.4 不同品种 ALK 基因型分析 为了明确不同水稻品种 ALK 基因型，利用ALKH4、ALKH5 对 279 份粳稻品种（系）和 81 份籼稻品种进行检测。结果发现，279 份粳稻品种（系）中，G-GC 基因型的材料只有 16 份，占粳稻材料总份数的 5.7%；含有 A-GC 基因型的材料 51 份，占粳稻材料总份数的 18.3%；含有 G-TT 基因型的材料 212 份，占粳稻材料总份数的 76.0%（附图 1）。81 份籼稻品种中，含有 G-GC 基因型的材料只有19 份，占籼稻材料总份数的 23.5%；含有 G-TT 基因型的材料 62 份，占籼稻材料总份数的 76.5%。360份水稻材料的 ALK 基因型见附表 1。3 讨论 高效、准确和规模化地鉴定目标基因型是提高育种效率的前提，传统基于 PCR 扩增的分子标记检测技术鉴定准确，但较难实现规模化。HRM 技术是目前仅次于 SNP 芯片分析的中高通量的 SNP 分型技术，而且 HRM 分析不只可以针对 SNP，对小 图1 12份水稻品种ALK基因HRM功能标记的多态性分析 Fig.1.HRM polymorphism analysis of ALK functional markers amplification products of 12 rice varieties.图 2 24 个 F2分离群体的的 ALK 基因型鉴定 Fig.2.ALK genotype identification in 24 F2 plants.王军等：基于 HRM 技术开发水稻糊化温度基因 ALK 功能标记 109 片段缺失插入多态性、重复序列的差异等多种标记的开发和利用更有应用价值。在基于 HRM 技术的水稻重要性状基因功能标记开发研究方面，陈竹锋等20根据稻瘟病抗性基因 Pi2 及其复等位基因的序列，利用 HRM 技术开发与 Pi2 完全共分离的分子标记，建立了中高通量辅助选择体系。Luo 等21针对 Pita 基因中的 G/T SNP 位点及 Pik、Pikm、Pikp基因中共同存在的 C/T SNP，分别开发设计得到Pita及Pik的功能型HRM标记Pita-G/T、Pik2-C/T，在水稻种质基因筛选中得到了很好的应用。罗文龙等22在基于凝胶电泳功能标记的基础上，开发基于HRM 技术的功能标记 Wx-a/b 和 BAD2-E7，10 min内即可完成最多 96 个样品的基因型分析。根据碱消值大小的差异，稻米糊化温度分为高糊化温度（74）、中糊化温度（7074）和低糊化温度（70）23。中、低糊化温度的稻米往往具有较好的蒸煮品质；高糊化温度的稻米蒸煮时需要更多的水分和更长的时间，更适合制作米粉罐头或者耐储糕点。关于糊化温度的遗传研究，目前已经明确 ALK 是控制糊化温度的主效基因，同时也存在多个微效基因3-4。本研究针对 ALK 基因核心功能区域的 SNP 位点，通过缩短扩增片段长度，筛选到基于 HRM 技术的能够高效鉴定 ALK 不同基因型的功能标记。在此基础上，建立了快速高通量只需一次扩增的鉴定体系，大大提高了鉴定效率。利用该标记对不同粳稻、籼稻 ALK 基因型分析发现，G-TT 基因型占大多数，A-GC 基因型占少数，极少为 G-GC 基因型。为了探求不同 ALK 基因型分布及其不平衡的原因，进一步利用 RVA 仪对部分基因型的水稻品种进行成糊温度测定。含有 G-TT 基因型的水稻品种都表现出低成糊温度的表型，含有 G-GC 基因型的水稻品种成糊温度都较高，含有 A-GC 基因型的水稻品种成糊温度差异较大(附表 2)，可能是由于A-GC 基因型一般表现为中低糊化温度表型，2022年盐粳 11 号和镇稻 9469 灌浆期连续高温也可能是导致这 2 个品种糊化温度偏高的原因。育种家长期对低糊化温度表型选择导致 ALK 的 G-TT 基因型成为水稻尤其是粳稻品种的优势单倍型，也进一步证明了 ALK 基因是控制水稻糊化温度的主效基因。因此，水稻品质育种改良中，利用 ALK 基因功能标记进行基因型选择，完全可以获得中低糊化温度表型的水稻材料，避免了表型鉴定的繁琐过程，大大提高了选择效率。在线辅助信息：附图 1、附表 1 和附表 2 放在中国水稻科学网站（http:/）。参考文献：1 包劲松.稻米淀粉品质遗传与改良研究进展J.分子植物育种,2007(6):1-20.Bao J S.Progress on inheritance and improvement of rice starch qualityJ.Molecular Plant Breeding,2007(6):1-20.(in Chinese with English abstract)2 高维维,陈思平,王丽平,陈立凯,郭涛,陈志强.稻米蒸煮品质性状与分子标记关联研究J.中国农业科学,2017,50(4):599-611.Gao W W,Chen S P,Wang L P,Chen L K,Guo T,Chen Z Q.Association analysis of rice cooking quality traits with molecular markersJ.Scientia Agricultura Sinica,2017,50(4):599-611.(in Chinese with English abstract)AD 分别为连粳 18201、润扬稻 1892、扬辐粳 1 号和 F2单株。红色框示 ALK 基因 4198 位、4329 位和 4330 位碱基。AD,Lianjing 18201,Runyangdao 1892,Yangfujing 1 and F2 plant,respectively.Red box indicates 4198 bp,4329 bp and 4330 bp of ALK gene.图 3 部分水稻品种 ALK 基因功能位点序列 Fig.3.Sequence of ALK gene functional domains for partial rice varieties.110 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第 38 卷第 1 期(2024 年 1 月)3 Fan C C,Yu X Q,Xing Y Z,Xu C G,Luo L J,Zhang Q F.The main effects,epistatic effects and environmental interactions of QTLs on the cooking and eating quality of rice in a 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