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色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌治疗作用的研究 一、趋势判断和需求分析国内外现状、水平和发展趋势（含知识产权状况和技术标准状况）；经济建设和社会发展需求；科学技术价值、特色和创新点。膀胱癌是危及人类健康的重大疾病，全世界范围内统计其发病率占全身肿瘤的第8位，在男性其标准发病率9.9/10万；在女性，其标准发病率为2.3/10万，占第25位。死亡率在男性为4.2/10万，占全身肿瘤死亡率的第9位，在女性为1.1/10万，占第16位。在我国,膀胱癌也是泌尿外科的最常见恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的3.2%，1995年，北京市城区膀胱癌发病率大约为7/10万人，上海市城区发病率为8.6/10万人1，且今后发病率仍有上升趋势。作为危害人类健康的常见恶性肿瘤，膀胱癌发病机制和治疗方面的研究始终是临床基础研究的重点之一。 目前膀胱癌的治疗仍以手术切除为主，辅以膀胱灌注化疗和免疫治疗、全身化疗、放疗和生物治疗等措施, 但这些治疗方法效果都不满意，主要是治疗后易复发，复发率高达80%，其中大约16%-25%复发的肿瘤其恶性程度增加，有10%发展为浸润性或转移性癌，因此,寻找一种新的、更有效的生物治疗方法，是当前临床迫切需要解决的问题。在膀胱癌的这些辅助性治疗方法中，无论是化疗还是免疫治疗，主要机制是通过直接杀死肿瘤细胞、阻断肿瘤细胞分裂或诱导细胞调亡的方式来抑制肿瘤生长。做为一种实体性肿瘤生长，肿瘤细胞的增殖固然重要，而新生血管的形成在肿瘤的生长和复发、转移过程中也发挥非常重要作用。在正常状态下，人体内的脉管系统在血管生长因子和抑制因子网络式的相互作用下处于平衡状态；病理状态下，尤其是发生恶性肿瘤时，这种平衡向血管生成的方向发展。当肿瘤生长达到肿瘤组织超过2mm时就会有新生血管形成，如果没有新生血管生成，肿瘤生长明显受到抑制，甚至停止2，3。抗血管生成疗法是不同于目前常规疗法的新的肿瘤治疗策略，具有高效低毒和不易产生耐药性的特点4。有关血管生长因子和血管生长抑制因子在肿瘤中所起作用，以及通过抗血管生成治疗肿瘤已经成为当前肿瘤研究的一个热点。 近来研究发现，色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor, PEDF）是一种对肿瘤有抑制作用的细胞因子。这种细胞因子是Tombran-Tink等在实验中发现的，由人视网膜色素上皮细胞分泌的一种蛋白质，分子量为50 KD5，属于serpin卵白蛋白/PAT-2亚群，其基因全长16 kb，位于染色体17p13.1-pter 6 。 多项研究表明，PEDF是一种天然的高效的新生血管抑制剂7，并通过诱导肿瘤细胞分化起到抑制肿瘤生长的作用。Tombran-Tink等将PEDF基因定位于染色体17p13.1,肿瘤发生与该区域关系密切，提示该基因可能是抑癌基因或肿瘤相关基因5。对肿瘤细胞进行编码PEDF的腺病毒转染，在血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）存在的情况下，PEDF明显阻止了血管内皮细胞管腔形成和迁移。对患有CNV/AMD患者的体外实验也发现，PEDF大量减少的情况下，内皮细胞有明显迁移;而对照组含有正常水平PEDF,则抑制了内皮细胞的迁移6。Crawford等发现PEDF在神经母细胞瘤中是肿瘤细胞分化调控的主要的抗血管生成的抑制剂7 。肝癌患者血管增生和肿瘤发展中，PEDF作为VEGF的拮抗因子，起到了抑制作用。对裸小鼠的在体实验以及鼠的肺癌模型也同样证明了PEDF对肿瘤的抑制作用。其机制乃因PEDF减少肿瘤微血管的密度，因而可被用于抑制肿瘤新生血管形成，从而抑制肿瘤的生长，在肿瘤的治疗前景上非常乐观8。 我们最近对PEDF在膀胱癌中表达情况的初步研究发现，PEDF在膀胱癌组织中表达明显低于正常膀胱组织，而且PEDF表达情况与膀胱癌的恶性程度以及癌组织中微血管密度呈负相关，提示PEDF在膀胱癌的发生、发展中具有一定的作用，PEDF的正常表达可能抑制膀胱癌细胞的生长、增殖，PEDF有可能成为膀胱癌生物学治疗的一种有效的新方法。目前国内、外尚未见此项研究的相关报道。因此我们设想，扩大样本量，应用分子生物学技术检测膀胱癌组织及非癌膀胱组织中PEDF的表达水平，进一步研究PEDF在膀胱癌中的表达情况，并结合临床资料分析PEDF表达与膀胱癌分期、分级、转移及预后的关系；通过研究膀胱癌组织中PEDF与VEGF表达的相关性，PEDF与血小板反应素-1表达的相关性，探讨膀癌组织中PEDF表达与肿瘤血管形成的相关性及可能的作用机制；通过研究PEDF表达与金属蛋白酶-9（MMP-9）的相关性，探讨PEDF表达与膀胱癌浸润的相关性；通过研究PEDF表达与已知的对肿瘤生长有明确调节作用的肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素1（IL-1）、血栓调节蛋白（thrombomodulin）和白介素8（IL-8）等细胞因子表达的相关性，探讨PEDF表达对膀癌细胞调节的可能机制，从而探讨PEDF在膀胱癌发生、发展过程中的可能作用机制；在此基础上，以连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，进一步探讨PEDF表达对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌的治疗效果,为膀胱癌的生物学治疗探索一种有效的新方法。参考文献2 吴阶平， 吴阶平泌尿外科学，山东科学技术出版社，2004.5：898-917二、研究内容和技术关键研究的总体目标：(1) 研究PEDF表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展及转移过程中可能的作用机制。(2) 研究PEDF对膀胱癌细胞的治疗效果，为临床治疗膀胱癌的生物治疗探索一种新的有效方法研究的创新点：本课题研究的内容和思路不同于以往的其他研究，应用分子生物学方法从研究PEDF表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系入手，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展和转移中可能的作用机制。在此基础上，以连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，探讨PEDF对膀胱癌的治疗作用。目前，本项研究国内、外尚未见报道。本研究的顺利完成，将为膀胱癌的生物学行为的研究开辟了新的途径，也将为膀胱癌的生物学治疗探索一种新的有效方法。研究的主要内容：(1) 膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和相关细胞因子表达的检测及相关性研究： 应用分子生物学技术研究膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF表达状况，并检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-、IL-1、血栓调节蛋白（thrombomodulin）和IL-8的表达状况；采用免疫组化技术检测膀胱癌组织和非癌膀胱组织中的微血管密度（microvascular density，MVD），分析PEDF与VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-、IL-1、血栓调节蛋白和IL-8表达的相关性，PEDF与MVD的相关性；并结合临床资料分析研究PEDF表达与膀胱癌患者5年生存率之间的关系；阐明PEDF表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展中的可能机制。(2) PEDF对膀胱癌细胞株的治疗： 以连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株,以空载转染膀胱癌细胞株作为对照，观察检测VEGF、TNF-的表达情况及膀胱癌细胞的凋亡、增殖情况。(3) PEDF对裸鼠膀胱癌模型的治疗： 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白（购自吉泰生物科技有限公司）直接注射于裸鼠皮下肿瘤组织内作为治疗组，以未注射PEDF组为阴性对照组。观察各组的MVD、VEGF 及肿瘤增殖情况，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展中的作用机制，评估PEDF对膀胱癌的治疗效果，为进一步过度到临床应用提供依据。需要解决的技术关键：(1) 连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株的转染成功率。(2) PEDF定量检测：我们已有对前列腺癌、肾癌、膀胱癌等组织标本的PEDF定量分析的基础，已形成较成熟技术条件、设备和研究经验。(3) 膀胱癌裸鼠模型的构建。我们已有成功构建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的经验。研究方法：方法（1）膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和相关细胞因子表达的检测及相关性研究：实验组对照组标本膀胱癌组织非癌膀胱组织A期B期C期D期癌旁膀胱组织正常膀胱组织炎性膀胱组织例数30303030120120120 应用SYBR Green I 实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）技术,对膀胱癌、非癌膀胱组织中PEDF进行定量测定。 Western blot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9。 ELISA法检测TNF-、IL-1、血栓调节蛋白、IL-8浓度。 免疫组化方法检测标本MVD。 整理临床资料：膀胱癌患者性别、年龄、组织病理、分期、分级、是否转移、5年生存率。 数据统计分析(使用SPSS统计分析软件)：PEDF与VEGF表达的相关性。PEDF与TSP-1表达的相关性PEDF与MMP-9表达的相关性PEDF与TNF-、IL-1、血栓调节蛋白、IL-8浓度的相关性。PEDF与组织MVD相关性。PEDF与膀胱癌分期的相关性。PEDF与膀胱癌恶性程度（分级）的相关性。PEDF与膀胱癌转移的相关性。PEDF与膀胱癌5年生存率的相关性。方法（2）PEDF对膀胱癌细胞株的治疗：以连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞,以空载转染膀胱癌细胞作为对照，检测VEGF、TNF-浓度，观察细胞的增殖、凋亡情况，分析相关性。 以RT- PCR法扩增PEDF基因。 将扩增后的PEDF基因连接入腺病毒载体，转染膀胱癌细胞。并以空载转 染为对照。 Western blot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9表达。 观察膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡情况。 统计分析。方法（3）PEDF对裸鼠膀胱癌模型的治疗：以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下肿瘤内作为治疗组，以未注射PEDF为阴性对照组。观察两组膀胱癌组织MVD、VEGF表达情况、肿瘤增殖情况，评价 PEDF对膀胱癌的治疗效果。 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下构建膀胱癌裸鼠模型。 将PEDF蛋白注射于裸鼠瘤体内。 应用免疫组化方法检测MVD；应用Western blot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9；观察肿瘤增殖、凋亡情况。分析PEDF与VEGF的相互作用关系及其对肿瘤生长的作用机制。技术路线：(1) 膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF及相关细胞因子表达的检测及相关性研究：膀胱癌标本120例癌旁膀胱组织标本120例RT-PCR检测PEDF mRNA 表达Western blot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9ELISA法检测TNF-、IL-1、血栓调节蛋白、IL-8浓度免疫组化方法检测标本微血管密度（MVD）结合临床资料，数据统计分析正常膀胱组织标本120例炎性膀胱组织标本120例(2) PEDF对膀胱癌细胞株的治疗：将PEDF转染膀胱癌细胞株，检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-浓度，观察肿瘤细胞的增殖、凋亡情况。RT PCR法扩增PEDF基因连接入腺病毒载体转染膀胱癌细胞株空载体观察细胞凋亡、增殖情况ELISA法检测TNF-Western blot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9表达结果分析(3) PEDF对裸鼠膀胱癌模型的治疗：观察PEDF与VEGF、MVD相关性及其对膀胱癌细胞的抑制作用构建膀胱癌裸鼠模型注射PEDF蛋白观察微血管密度（MVD）VEGF、TSP-1、MMP-9定量测定肿瘤凋亡、增殖、侵袭情况未注射（对照）结果分析 先后开展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基础研究（包括分子生物学研究）和临床研究，如：裸鼠膀胱癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表达与膀胱癌的关系、VEGF表达与膀胱癌的关系等，熟练掌握了泌尿生殖系统肿瘤分子生物学和细胞学研究的技术方法，如RT-PCR、southern 、northern杂交、DNA测序、拥有独立的泌尿外科免疫、病理、分子生物学和细胞学实验室，实验室设备完善，技术方法先进，拥有PCR-扩增仪、酶标仪、各种电泳槽、凝胶成像设备、细胞房及各种基础实验设备等,为本课题的顺利进行提供了有力的技术和仪器设备保证。细胞培养、腺病毒载体构建等技术，积累了较丰富的研究经验。 最近我们开展了对膀胱癌、前列腺癌组织中PDEF表达的初步研究，掌握了对肿瘤组织包括膀胱癌组织中PDEF表达的检测方法，对本课题的顺利进行提供了便利条件。例如：已完成对膀胱肿瘤与正常膀胱组织PEDF表达情况的对照性研究，初步结果显示如下:(1) 定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果可见：PEDF在正常膀胱组织中高表达, 而在膀胱癌组织中表达明显降低（见图1）。 (2) 图1：正常膀胱组织与膀胱癌组织PEDF定量PCR注：N1，N2，N3：正常膀胱组织T1，T2，T3：膀胱癌组织GAPDH：内参照M：为标记分子量(2)在膀胱癌组织中PEDF低表达与微血管增殖相关（见图2）。预期成果：（1）明确测定出PEDF在膀胱癌中的表达情况以及其与相关细胞因子表达之间的关系。（2）PEDF在膀胱癌发生、发展过程中起重要作用。（3）PEDF对膀胱癌的治疗有效，为最终过渡到临床应用提供强有力的实验依据。成果以论文的形式表达，并申请“PEDF治疗裸鼠膀胱癌模型技术”的专利；拟发表论著57篇，其中国内权威杂志45篇，SCI收录杂志2篇。申请成果鉴定。本课题实施过程中，形成一整套细胞因子检测方法、膀胱癌细胞株培养及腺病毒转染膀胱癌细胞技术、裸鼠膀胱癌模型的建立及PEDF治疗裸鼠膀胱癌模型等方法，将为复旦大学泌尿外科研究所的分子生物学实验室和细胞学实验室提供新的研究条件和技术，并为以后此类研究的开展奠定扎实基础。本课题研究过程中，拟培养硕士研究生2名，博士研究生2名，技术员一名。六、预期效果和风险分析课题成果对社会发展所起的作用；经济效益和产业化前景（预计年产值、年利润、年节汇、年创汇、年节能等）；对环境影响程度及资源综合利用情况；可能的技术风险；可能的市场风险。本课题通过对对膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF表达和相关细胞因子的检测，探讨PEDF表达对膀癌细胞调节的可能机制，从而探讨PEDF在膀胱癌发生、发展过程中的可能作用机制；在此基础上，以连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，进一步探讨PEDF表达对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌的治疗效果。本课题的的顺利完成，不仅为膀胱癌发病机制的研究提供了新的线索，而且，为膀胱癌的生物学治疗探索了一种有效的新方法，并为最终过渡到临床应用提供强有力的实验依据，具有较好的经济效益和社会效益。本课题的进行不会造成对环境的污染，并充分利用现有的综合资源包括：泌尿外科研究所的的实验室、仪器设备、已积累的组织标本和病例资料、已经进行的与本课题有关的预实验基础等。可能的技术风险主要是：连接有PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株的转染成功率和PEDF对裸鼠膀胱癌模型的治疗效果。 3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。B比率分析法和比较分析法不能测算出各因素的影响程度。C采用约当产量比例法，分配原材料费用与分配加工费用所用的完工率都是一致的。C采用直接分配法分配辅助生产费用时，应考虑各辅助生产车间之间相互提供产品或劳务的情况。错 C产品的实际生产成本包括废品损失和停工损失。C成本报表是对外报告的会计报表。C成本分析的首要程序是发现问题、分析原因。C成本会计的对象是指成本核算。C成本计算的辅助方法一般应与基本方法结合使用而不单独使用。C成本计算方法中的最基本的方法是分步法。XD当车间生产多种产品时，“废品损失”、“停工损失”的借方余额，月末均直接记入该产品的产品成本 中。D定额法是为了简化成本计算而采用的一种成本计算方法。F“废品损失”账户月末没有余额。F废品损失是指在生产过程中发现和入库后发现的不可修复废品的生产成本和可修复废品的修复费用。F分步法的一个重要特点是各步骤之间要进行成本结转。()G各月末在产品数量变化不大的产品，可不计算月末在产品成本。错G工资费用就是成本项目。()G归集在基本生产车间的制造费用最后均应分配计入产品成本中。对J计算计时工资费用，应以考勤记录中的工作时间记录为依据。()J简化的分批法就是不计算在产品成本的分批法。()J简化分批法是不分批计算在产品成本的方法。对 J加班加点工资既可能是直接计人费用，又可能是间接计人费用。J接生产工艺过程的特点，工业企业的生产可分为大量生产、成批生产和单件生产三种，XK可修复废品是指技术上可以修复使用的废品。错K可修复废品是指经过修理可以使用，而不管修复费用在经济上是否合算的废品。P品种法只适用于大量大批的单步骤生产的企业。Q企业的制造费用一定要通过“制造费用”科目核算。Q企业职工的医药费、医务部门、职工浴室等部门职工的工资，均应通过“应付工资”科目核算。 S生产车间耗用的材料，全部计入“直接材料”成本项目。 S适应生产特点和管理要求，采用适当的成本计算方法，是成本核算的基础工作。()W完工产品费用等于月初在产品费用加本月生产费用减月末在产品费用。对Y“预提费用”可能出现借方余额，其性质属于资产，实际上是待摊费用。对 Y引起资产和负债同时减少的支出是费用性支出。XY以应付票据去偿付购买材料的费用，是成本性支出。XY原材料分工序一次投入与原材料在每道工序陆续投入，其完工率的计算方法是完全一致的。Y运用连环替代法进行分析，即使随意改变各构成因素的替换顺序，各因素的影响结果加总后仍等于指标的总差异，因此更换各因索替换顺序，不会影响分析的结果。()Z在产品品种规格繁多的情况下，应该采用分类法计算产品成本。对Z直接生产费用就是直接计人费用。XZ逐步结转分步法也称为计列半成品分步法。A按年度计划分配率分配制造费用，“制造费用”账户月末(可能有月末余额/可能有借方余额/可能有贷方余额/可能无月末余额)。A按年度计划分配率分配制造费用的方法适用于(季节性生产企业)