T6SS在调控细菌竞争性优势过程中的作用及分子机制.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45，No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202304004T6SS在调控细菌竞争性优势过程中的作用及分子机制杜付熙1,2覮，陈慧敏1,2覮，尚珂1,2，余祖华1,2，李静1,2，贾艳艳1,2，廖成水1,2，丁轲1,2，张春杰1,2，程相朝1,2*，陈松彪1,2*(1.洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学动物科技学院 功能微生物与畜禽健康实验室，河南 洛阳 471003)中图分类号：S852.4文献标识码：B文章编号：1008-0589(2023)10-1085-08收稿日期：2023-04-09基金项目：河南省自然科学基金(232300421263)；河南科技大学博士研究启动基金(13480104)覮 共同第一作者：杜付熙(1998-)，男，河南商丘人，硕士研究生，主要从事动物病理学研究；陈慧敏(1987-)，女，河南驻马店人，硕士，主要从事动物病理学研究.*通信作者：E-mail：；.*Corresponding author;覮Equal contributors细菌为了在宿主体内生存、繁殖和扩散，必须分泌一些毒力因子。革兰氏阳性细菌(G+)具有单一胞浆膜，胞浆膜外是一层由肽聚糖组成的细胞壁；革兰阴性细菌(G-)则有两层生物膜，分为内膜(胞浆膜)和外膜，内膜和外膜之间为一层肽聚糖层和外周质间隙。毒力蛋白质的分泌需要跨膜，蛋白质跨膜所依赖的分泌通路称为分泌系统1。截至目前，已经在细菌中发现了5种主要类型的分泌系统：型分泌系统(Type secretory system，T1SS)、型分泌系统(Type secretory system，T3SS)、型分泌系统(Type secretory system，T4SS)、型分泌系统(Type secretory system，T5SS)和型分泌系统(Type secretory system，T6SS)2-4。T6SS是一种接触性毒素分泌装置，拥有复杂多样的物学功能，受到众多学者广泛关注。T6SS的研究最早于1996年，Manning等在霍乱弧菌中首次发现溶血素协同调节蛋白(Hemolysin coregulated protein，Hcp)5，推测Hcp可能横跨细胞外膜，推测存在一种新型的分泌机制。1998年，Wang等人在大肠杆菌中发现Hcp分泌蛋白同源类似物的Rhs蛋白家族6。IcmF(Intracellular multiplication locus F)具有防止吞噬小泡和溶酶体结合的功能，能够帮助细菌在巨噬细胞内复制，2003年Das等研究发现Rhs组份在系统进化上与IcmF相关同源蛋白(IcmF-associated homolo-gous proteins，IAHP)存在一定联系7，推测IAHP编码一个分泌装置。2005年，Kayin等人发现Hcp位于IAHP基因簇内部，证实了IAHP基因簇编码了一种新型的蛋白分泌系统8。直至2006年，Pukatzki等使用盘基网柄菌()作为模型生物筛选霍乱弧菌分离株的新毒力因子时发现了T6SS9。进一步通过计算机模拟共分析出T6SS核心成分由13种保守蛋白质构成10，大部分是T6SS特有蛋白11。此外，T6SS基因座中还存在15个高度保守辅助蛋白，包括特定的转录因子和转录后调节因子12。T6SS主要作为细菌间竞争的一种装置，通过将有毒的抗菌蛋白注射到竞争的细菌体中，在细菌的竞争中发挥重要作用13-14。大多数具有T6SS的相关细菌生存同一环境中且均具有较强生长竞争优势，通过对铜绿假单胞菌15、沙门菌16以及霍乱弧菌17等T6SS的研究发现，这种竞争优势是细菌通过T6SS向竞争细菌或真核细胞注射毒性效应蛋白，抑制竞争细菌的生长或直接将其杀死而实现的(表1)。然而，细菌注射的这些毒性效应蛋白不具有宿主特异性，也会对自身细胞产生毒性。因此，细菌在合成毒性效应蛋白的同时，在编码这些毒性效应蛋白附近也会存在起解毒作用的免疫蛋白基因，二者共表达效应-免疫蛋白对，以实现自我保护，但具体作用机制仍不明确。因此，本文系统阐述了细菌T6SS的基本结构和功能、T6SS介导细菌间“通讯”作用方式及T6SS调控细菌竞争性优势的分子机制，为进一步研究T6SS在细菌致病过程中的作用机制提供理论指导。1T6SS的基本结构概述T6SS是一种类似“噬菌体”的针状结构蛋白分泌系统，可以将细菌产生的毒性蛋白注入其他细菌或真核细胞中29。一些生物编码一个T6SS，而另一些则编码多个T6SS。例如，铜绿假单胞菌携带3个由染色体岛H1、H2和H3编码的T6SS基因簇30，而霍乱弧菌只携带1个31。T6SS是蛋白分泌系统的一种类型，所有的T6SS基因簇均编码一组保守的蛋白质。如图1所示，T6SS结构与噬菌体较为相似，主要分为3部分：管状结构、基座复合体和跨膜复合体32。管状结构包括鞘管顶端的VgrG-PAAR针尖复合体、VipA-VipB外鞘和Hcp内管33；基座复合体是T6SS组装的基础，由TssE-TssF-TssG-TssK组成，呈楔形；跨膜复合体由固定在外膜上的脂蛋白TssJ与内膜上的TssM-TssL蛋白复合物结合形成。T6SS组装过程中跨膜复合体和基座复合体将T6SS固定在细胞膜上，Hcp蛋白在外鞘中不断堆叠形成内管结构并开始堆叠延伸，当延伸的管状结构遇到位于细胞另一侧内膜上的TagA蛋白时，延伸终止。之后VipA-VipB复合物收缩将Hcp管、顶端的VgrG-PAAR以及VgrG-PAAR携带的效应蛋白推送到靶细胞，从而完成T6SS的分泌34-36。2T6SS的功能2.1T6SS介导的细胞毒性作用T6SS将效应蛋白注射到其他细菌或真核细胞中发挥细胞毒性作用37。图1细菌T6SS的组装结构简图(根据文献32修改)表1介导细菌间竞争的相关T6SS效应蛋白菌株Strains铜绿假单胞菌霍乱弧菌迟钝爱德华氏菌假结核耶尔森菌嗜水气单胞菌洋葱新病原细菌鳗弧菌粘质沙雷菌肺炎克雷伯菌鮰爱德华氏菌塞氏柠檬酸杆菌副溶血性弧菌产气单胞菌邦戈尔沙门菌效应子EffectorTse3Tse1CspVVgrG3EvpPTssSTce1CccRYezPVgrG1TecARpoSTfe1VgrG4EvpPVgrG1HcpTseCTseV3生化功能Biochemical functionalities裂解细胞壁Disintegrating cell wall溶解细胞壁Lytic cell wall增强杀灭其他细菌的能力Enhance the ability to kill otherbacteria降解其他细菌肽聚糖Degrades peptidoglycan fromsurrounding bacteria抑制炎性小体Inhibits the inflammasome增强细菌免疫逃避Enhance the bacterial immuneevasion水解核酸酶Hydrolyzing nuclease腺苷化FtsZ蛋白Adenylation of FtsZ保护病原体免受活性氧侵害发挥毒性作用Protects pathogens from ROS andexerts a toxic effect破坏肌动蛋白细胞骨架Disrupt the actin cytoskeleton破坏肌动蛋白细胞骨架Disrupt the actin cytoskeleton调节鳗弧菌的生存和应激能力Regulates survival and stressresponses in vibrio anguillarum造成细胞质膜电位丧失Causes a loss of plasma membranepotentialDUF2345结构域毒害细菌和酵母The DUF2345 domain poisonsbacteria and yeast促进巨噬细胞凋亡和坏死Promotes apoptosis and necrosis ofmacrophages裂解细胞Lytic cells在细菌细胞质中有毒力并引起细胞裂解Toxic in the bacterial cytosol andcauses cell lysis抗巨噬细胞吞噬作用Resist phagocytosis by macrophages切割细胞DNACutting the DNA of cell文献References34344220545562642318192122242526272816TssATaq ATssE,TssF,TssGVipA,VipBHcpTssLTssJTssMTssKVgrGPAAR中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年10862010年首次在铜绿假单胞菌中鉴定出具有水解肽聚糖特性的细胞毒性效应蛋白TSE1和TSE338。TSE1和TSE3具有溶菌活性，TSE1具有酰胺酶活性，通过降解肽聚糖五肽交联桥的肽键而裂解细胞壁；而TSE3具有糖苷水解酶活性，通过水解肽聚糖多糖主链的茁-1,4糖苷键而使细胞壁出现孔洞甚至解体，进而杀死细菌39。T6SS中对原核细胞有作用的毒力蛋白较多，对真核细胞有作用的毒力蛋白则相对较少，主要是几种VgrG蛋白，包括霍乱弧菌中诱导细胞凋亡的VgrG1蛋白40、铜绿假单胞菌中促进非吞噬细胞对细菌内化的VgrG2b蛋白和泰兰伯克霍尔德氏菌中帮 助细 菌在细 胞间传 递的VgrG5蛋白41。Casper等分别将野生型和T6SS缺失型鼠伤寒沙门菌与大肠杆菌共孵育，发现T6SS缺失后能够显著降低沙门菌的竞争能力42。Yu等进一步发现T6SS不仅可以杀伤周围的细菌，而且还能够帮助细菌逃避外来菌的杀伤43。在真核细胞试验中也发现T6SS失活后会降低沙门菌对其他真核细胞的细胞毒性44。2.2T6SS介导细菌对酸碱度和温度的适应性细菌感染宿主后，宿主会激活自身防御机制产生一系列调控因子，调节细菌周围环境pH降低，从而抑制细菌生长。细菌外膜蛋白R(Outer membrane proteinsR，Omp R)是EnvZ/OmpR双组分调控系统的一种调节蛋白，该系统通过调控相关基因的表达来响应细菌外界渗透压和pH的变化45。Zhang等研究发现假结核耶尔森菌缺失后显著降低细菌在酸性环境中的存活率，进一步研究证实Omp R可以与T6SS启动子结合，从而调控T6SS的表达，最终介导细菌在酸性环境中生存46。还有研究表明细菌还能够利用T6SS来调控其对温度变化的适应性，Storey等发现在周围温度变化时，霍乱弧菌可以通过T6SS效应蛋白CspV来增强对其他细菌的杀伤力47。2.3T6SS参与宿主免疫信号通路的调节炎症小体是由胞浆内模式识别受体(Pattern recognition recep-tors，PRR)参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分48-50。炎症小体能够识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和宿主来源的危险信号分子(Danger-associatedmolecular patterns，DAMP)51-53。目前发现的炎性小体主要有5种：NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF炎性小体，以及黑素瘤缺乏因子2(Absent In Melanoma 2，AIM2)炎性小体54-55。其中NLRP3炎性小体是当下的研究热点，目前已经确定NLRP3炎性小体参与多种病原的宿主防御反应56-58。Chen等发现迟缓爱德华菌利用T6SS抑制NLRP3炎性小体，进一步证实T6SS效应蛋白EvpP通过抑制JNK活化来影响凋亡相关斑点样蛋白ASC(Apoptosis-associated speck-like protein con-taining a CARD)寡聚化，从而抑制NLRP3炎性小体的激活，最终促进细菌在宿主体内的定植59。可见T6SS效应蛋白EvpP通过抑制NLRP3炎性小体的表达来促进细菌在体内大量增殖。2.4T6SS介导细菌的免疫逃逸假结核耶尔森菌T6SS会向宿主细胞传递一种微肽TssS，以增该菌毒力60。TssS是一种Mn2+金属结合蛋白，其在细菌破坏宿主先天免疫系统的过程中发挥重要作用。研究发现缺失TssS蛋白的假结核耶尔森菌的毒力明显降低，但其诱导的宿主先天免疫反应明显增强，表明TssS在宿主抗菌免疫过程中具有拮抗作用。进一步研究证实这种免疫拮抗作用是由Mn2+激活干扰素刺激因子(Sting)介导，TssS通过与Mn2+的结合使细胞质内Mn2+含量减少，从而抑制Sting介导的先天免疫应答能力，最终导致宿主对细菌的清除能力下降。可见，T6SS介导细菌的免疫逃逸机制。2.5T6SS介导细菌对宿主的侵入霍乱弧菌进入机体肠道后会激活酸反应通路以保障其在胃酸环境中存活61。在小肠中，霍乱弧菌会穿过许多化学屏障和物理障碍，如粘液蛋白、胆汁和宿主微生物群。在与上皮层密切接触后，霍乱弧菌通过分泌毒素协同调节菌毛(Toxinco-regulatedpilus，TCP)表达凝集，分泌霍乱肠毒素，导致机体水分大量外排，使霍乱弧菌重回环境中62。目前尚不清楚不同的霍乱弧菌如何在如此广泛的环境中与不同的竞争者竞争。Qin等推测T6SS分泌的高度特异性效应因子在其中起重要作用，从结构上讲，T6SS是一种分子递送装置，细菌通过它将效应蛋白穿入邻近真核细胞和细菌，导致目标细胞的裂解，当霍乱弧菌穿过小肠时，体内肌动蛋白发生交联，这种机制会用于将该菌固定在接近的免疫细胞，使霍乱弧菌建立感染63。3T6SS调控细菌间“通讯”的作用方式3.1T6SS介导OMV分泌来进行细菌“通讯”外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMV)可作为介导杜付熙，等.T6SS 在调控细菌竞争性优势过程中的作用及分子机制第 10 期1087微生物群落中细菌相互作用的纳米载体64-65。Li等发现了一种配体-受体相互作用的OMV募集机制(图2)，包括T6SS分泌的脂多糖结合效应因子TeoL和外膜受体CubA与CstR66。进一步证明杀虫贪铜菌的T6SS1通过分泌TeoL与LPS相互作用，与LPS相互作用的TeoL进一步结合外膜受体CubA和CstR，使OMV与受体细胞结合。这种机制使细菌能够招募不同物种的OMV，并使细菌在铁获取、细菌间竞争和水平基因转移(horizontal gene transfer，HGT)方面获得优势。3.2T6SS介导Tce1蛋白的分泌来进行细菌“通讯”Song等发现T6SS分泌的效应物可通过接触和非接触两种方式介导细菌间“通讯”67。假结核耶尔森菌使用T6SS-3分泌一种非接触依赖性抗菌效应因子 1(T6SS contact-independent antibacterial effector1，Tce1)，Tce1蛋白具有水解核酸酶功能，进入靶细胞时，需要借助靶细胞外膜的Omp F和BtuB蛋白协同发挥作用。假结核耶尔森菌通过Tce1在细菌体外作用于其他细菌，并促进自身在小鼠肠道定植。Tce1是Ca2+和Mg2+依赖的DNA水解酶类的效应蛋白，Tce1的毒性被同源免疫蛋白Tci1抑制，T6SS-3能够通过接触作用，直接将Tce1注射到相邻细胞。同时，T6SS-3也可以在与临近细胞无接触的情况下，将Tce1分泌至细胞外环境中，介导假结核耶尔森菌对临近细胞的杀伤(图3)。3.3T6SS介导CccR蛋白分泌进行细菌“通讯”细菌已经进化出多种分泌系统，将效应蛋白传递到邻近细胞的细胞质中，但其中许多效应蛋白的作用仍然未知68。Wang等发现了假结核耶尔森菌的另外一种效应蛋白CccR，其可以作为一种毒力蛋白和转录因子69。假结核耶尔森菌T6SS分泌CccR效应蛋白，CccR进入附近的同一物种或其他物种的细胞中。CccR包含N端FIC结构域和C端DNA结合结构域。在假结核耶尔森菌中，CccR通过DNA结合域与CccR启动子结合抑制CccR的表达，并影响其他基因的表达。在大肠杆菌细胞中，CccR通过细胞分裂蛋白FtsZ的腺苷化介导种间细菌竞争，并通过传递到邻近细胞时作为转录调节因子介导细菌间“通讯”(图4)。因此，T6SS分泌的CccR具有双重作用，当临近细菌为同种细菌时，CccR可调节相邻细菌细胞的基因表达；当临近细菌为不同种细菌时，CccR则抑制竞争细菌的生长。4T6SS调控细菌竞争性优势的分子机制细菌可以感受邻近细胞T6SS的攻击，并激活自身的应激反应70。最典型的例子就是铜绿假单胞菌在被霍乱弧菌攻击后，会快速激活自身T6SS对抗霍图4假结核耶尔森菌CccR蛋白对临近细胞调控的示意图(根据文献69修改)CccRCccRT6SST6SST6SS异种细胞同种细胞调控铁获取、细胞和能量转换抑制CccR表达Ftsz腺苷化Ftsz聚合体FtszATP图3假结核耶尔森菌Tce1通过不同接触方式介导细菌“通讯”(根据文献67修改)耶尔森菌T6SS-3T6SS-3接触非接触图2杀虫贪铜菌TeoL蛋白招募OMV的机制(根据文献66修改)TeolT6SS1LPSOMVCubaCstr中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1088乱弧菌的TseL(具有磷脂酶活性的T6SS效应器)71。铜绿假单胞菌TagQRST-PpkA-PPPA-Fha1的信号级联反应可感知霍乱弧菌T6SS的攻击，进而诱导铜绿假单胞菌对霍乱弧菌的反击。这种新型的免疫应激反应类似于细菌的先天免疫反应，从而促进铜绿假单胞菌在细菌竞争中的存活。此外，由于许多T6SS系统攻击其他细菌细胞壁，这会引起细菌细胞膜应激反应，以此防御这些外来T6SS系统的攻击72。细胞膜面对压力会保持膜的完整性，以抵抗T6SS效应器造成的破坏。霍乱弧菌Tseh是一种依赖于PAAR的特异性杀伤T6SS的效应器，研究表明Tseh可以破坏细胞壁，当霍乱弧菌与大肠杆菌竞争时，Tseh会破坏大肠杆菌的细胞壁，此时为了应对外界压力，大肠杆菌的两条细胞膜应激反应通路RCS和BaeSR双组份系统被激活，RCS通过激活渗透调节基因和增加乳酸菌胞外多糖帮助大肠杆菌抵御Tseh介导的攻击，此外RCS还能够诱导生物被膜合成和黏蛋白的形成73。同种菌之间也存在竞争关系。表达T6SS的两株鼠伤寒沙门菌SL1344(S1)和ATCC14028(S2)混合培养 后，S1 可 以 感 知 S2 的 T6SS，并 激 活 RpoS、SoxR/SoxS和PhoP/PhoQ协调应激反应，这种协调反应会上调、和基因的表达，而、和基因参与生物膜基质的产生过程、外排泵系统的上调、抗生素耐受和对细胞上皮的侵入过程73。以上结果表明T6SS在同种细菌和不同细菌之间均发挥着重要作用。5小结与展望T6SS是近年发现的一种新型细菌分泌系统，在细菌致病过程中发挥重要作用74-75。其中，T6SS所参与的调控细菌竞争性优势的功能引起国内外学者广泛关注。T6SS通过不同的“通讯”方式增强宿主菌的竞争力：淤 T6SS分泌脂多糖效应分子TeoL招募OMV，帮助细菌在铁获取、细菌间竞争和水平基因转移方面获得优势；于 T6SS分泌效应分子Tse4和Tce1，对临近细胞直接产生杀伤；盂 T6SS还能够辨别临近细胞的“异己”。若与细菌自身种类相同，T6SS能够通过分泌效应分子CccR调节临近细胞的基因表达，若不与细菌自身种类相同，T6SS则会通过其效应分子CccR抑制其的生长。那么，是否能够利用T6SS的特性，使其成为新型“减抗替抗”绿色产品？T6SS的研究虽然已取得很大进展，但目前对T6SS的认知仍有诸多不足76。例如，T6SS如何识别“自我”还是“非已”？T6SS除了在Ca2+、Cu2+和Fe2+转运过程中有重要作用77-79，是否还在其他离子转运过程中发挥作用？T6SS在感受到其他细菌的攻击后会迅速产生反击，但是T6SS是如何感受到这种攻击的？这种攻击的传递方式是否每次都会导致T6SS的反击，以及T6SS持续性激活对细菌本身有何影响？随着活细胞实时成像技术日益成熟，这些问题将会很快解决。利用T6SS开发新型抗菌、抗虫生物制剂也将逐渐走进市场。参考文献：王一亭，夏芃芃，汪业军，等.细菌型分泌系统的研究进展J.中国预防兽医学报，2016，38(12)：998-1003.杜付熙，王文婕，尚珂，等.鼠伤寒沙门菌T6SS效应蛋白Clpv对巨噬细胞极化的影响J.微生物学报，2023，63(7)：2620-2632.SINGH R P,KUMARI K.Bacterial type VI secretion system(T6SS):an evolved molecular weapon with diverse functionalityJ.Biotechnol Lett,2023,45(3):309-331.岑雪，丁雪燕，娄昆鹏，等.细菌分泌系统研究进展J.中国预防兽医学报，2019，41(3)：317-322.WILLIAMS S G,VARCOE L T,ATTRIDGE S R,et al.Vibriocholerae Hcp,a secreted protein coregulated with HlyAJ.In-fect Immun,1996,64(1):283-289.WANG YONG-DONG,ZHAO SHENG.Rhs elements comprisethree subfamilies which diverged prior to acquisition byJ.J 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