靶向大肠杆菌DksA蛋白的小分子化合物的虚拟筛选及其体外抗菌活性的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303029靶向大肠杆菌DksA蛋白的小分子化合物的虚拟筛选及其体外抗菌活性的研究武周慧，王瑜，杜衡，王之文，肖爽，甄思慧，李磊，王真*(北京农学院 动物科学技术学院/兽医学(中兽医)北京市重点实验室，北京 102206)摘要：大肠杆菌DksA蛋白是RNA聚合酶结合转录因子，前期研究发现其与大肠杆菌的多重耐药性相关。为 获 得 靶 向 大 肠 杆 菌 DksA 蛋 白 的 小 分 子 化 合 物，并 鉴 定 其 体 外 抗 菌 活 性，本 研 究 利 用 Openeye 中 的apopdb2receptor工具处理并生成基于DksA蛋白晶体结构(1TJL)模型、冷冻电镜结构(7KHE)模型和AlphaFold预测结构(AF)模型3个模型的3D结构，分析3个3D结构间的差异以及生成3个结构的叠合图，采用MOE中的SiteFinder插件搜寻各结构表面可能存在的化合物的结合口袋(Pocket)，并分析pocket位置及其属性等指标。结果显示，DksA蛋白的3个3D结构高度重叠，3个结构表面均包含2个pocket，其中pocket1在3个模型中均优于pocket2，因此基于3个结构模型选择pocket1虚拟筛选(VS)小分子化合物。采用VS软件中的FRED对3个DksA蛋白3D结构的pocket1与38 969个化合物进行分子对接，采用Chemgauss4打分函数通过亲和力对接打分得到对接分值(Docking score，该值为负值且值越小表示化合物与蛋白的相互作用越强，亲和力也越强)后经第一轮VS与DksA蛋白具有高亲和力的化合物；采用Stardrop软件分析小分子化合物属性和成药性属性，并计算成药性分值(Drug score)及类药五原则分值(Lipinski score)，经第二轮VS成药性属性较好的化合物；采用MOE插件中的蛋白-配体相互作用指纹图谱(PLIF)经第三轮VS化合物与DksA蛋白的相互作用位点。结果显示，第一轮VS获得551个与DksA蛋白亲和力较高(-11 kcal/moldocking score0.2以及lipinski score0.4的340个与DksA蛋白有高亲和力和成药属性较好的化合物。第三轮VS结果显示，340个化合物中有296个化合物与DksA蛋白存在相互作用，并且获得了296个具有潜在活性靶向大肠杆菌DksA蛋白的化合物。其中95个化合物结合ppGpp和DksA蛋白的结合位点(Lys98、Arg129、Lys139)，表明这些化合物间接影响细菌的耐药性和致病性。选择综合评分排名前40的化合物，通过菌悬液定量抑菌试验分别测定这些化合物在体外对大肠杆菌的抑菌率。结果显示，9个化合物对大肠杆菌标准株E的抑菌率达50%以上，其中有5个化合物(7、10、12、19和25)对大肠杆菌标准株E的抑菌率达80%以上。选择上述筛选出的9个化合物利用VS软件FRED与3种模型3D结构的DksA蛋白进行分子对接、亲和力打分和相互作用模式分析。结果显示，9个化合物与3种模型3D结构DksA蛋白的氨基酸通过氢键相互作用，docking score均较理想，且其周围分布着带正电荷的氨基酸。采用肉汤微量稀释法测定该9个化合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，分析化合物对大肠杆菌的抗菌活性。结果显示，其中4个化合物在低浓度时即可对大肠杆菌标准菌株和临床分离株起到杀菌作用。即化合物7、10、12和25对大肠杆菌标准株的MIC值分别为50 滋mol/L100 滋mol/L，对其的MBC值分别为100 滋mol/200 滋mol/L；对大肠杆菌临床分离株的MIC值分别为50 滋mol/L100 滋mol/L，对其的MBC值分别为100 滋mol/L200 滋mol/L。本研究借助VS技术首次筛选到4个具有显著抗菌活性的化合物，并经体外抗菌试验验证了这4个化合物的抗菌与杀菌活性，为开发防治多重耐药性大肠杆菌感染的新型靶向药物奠定了基础。关键词：大肠杆菌；DksA蛋白；多重耐药性；抗菌活性；虚拟筛选中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1116-11收稿日期：2023-03-25基金项目：北京农学院学位与研究生教育改革与发展项目(5056516030/003)；北京市优秀人才培养资助项目(2017000026833ZK18)；北京农学院青年科学基金资助项目(QNKJ202107)作者简介：武周慧(1997-)，女，河南新乡人，硕士研究生，主要从事病原菌防治技术研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorVirtual screening and antibacterialantibacterial activity of smallmolecular inhibitors targeting the DksA protein ofWU Zhou-hui,WANG Yu,DU Heng,WANG Zhi-wen,XIAO Shuang,ZHEN Si-hui,LI Lei,WANG Zhen*(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine,Animal Science and Technology College,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:The DksA protein of()is an RNA polymerase binding transcription factor,which has beenfound to be related to multiple-drug resistance in.To obtain small molecule inhibitors targetingDksA and identifytheirantibacterial activity,the apopdb2Receptor tool of Openeye was used to process and generate 3D structures based onthe DksA protein crystal structure(1TJL)model,the cryo-electron microscope structure(7KHE)model and the AlphaFold predictionstructure(AF)model.The differences between the three 3D structures were analyzed and the superimposed diagram of the threestructures were generated.The SiteFinder plugin in MOE was used to search for the binding pockets of compounds that might existon the surface of each structure,and indicators such as the location and properties of the pockets were analyzed.The resultsshowed that the three 3D structures of DksA protein were highly overlapping,with each surface containing two pockets.Amongthem,pocket1 was superior to pocket2 in all three models.Therefore,based on the three models,pocket1 was selected for thevirtual screening(VS)of small molecule compounds.The pocket1 of the 3D structure of three DksA proteins was molecularlydocked with 38 969 compounds by FRED in VS software.Using the Chembauss4 scoring function,the docking score(which is anegative value and the smaller the value,the stronger the interaction between the compound and the protein,and the stronger theaffinity)was obtained through affinity docking scoring,and the compounds with high affinity to DksA proteins were screened inthe first round of VS;Stardrop software was used to analyze the compound properties and druggability of small molecules andcalculate the drug score and the five principles of drug-like score(Lipinski score),and the compounds with better pharmaceuticalproperties were screened in the second round of VS;the protein-ligand interaction fingerprint(PLIF)method in MOE plug-in wasused to study the interaction sites and force types between the compound and DksA protein in the third round of VS.The resultsshowed that,in the first round of VS,551 compounds with high affinity to DksA protein(-11 kcal/moldocking score0.2 and lipinski score0.4 were obtained,which have high affinity to DksA protein and good druggability.In the third round of VS,296 out of 340 compounds hadinteractions with the DksA protein,resulting in 296 compounds with potential activity targeting the DksA protein in,and 95compounds participated in binding sites of ppGpp and DksA(Lys98,Arg129,Lys139),indicating indirect affecting of these compoundsto bacterial resistance and pathogenicity.Forty compounds with top comprehensive score were selected,and the antibacterial rateof the compounds againstwas determined by quantitative bacteriostatic test of bacterial suspension.The resultsshowed that nine compounds had an antibacterial rate of over 50%against the standard strain E of,among which five(7,10,12,19,and 25)had an antibacterial rate of over 80%against the standard strain E of.Nine compoundsabove-mentioned were applied for molecular docking,affinity scoring,and interaction mode analysis with three 3D structures ofDksA protein using VS software FRED.The results showed that 9 compounds interacted with the amino acids of DksA protein inthree 3D structures through hydrogen bonding,and the docking score was ideal,and there were positively charged amino acidsdistributed around them.The minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of ninecompounds againstwere determined by broth microdilution method to analyze the antibacterial activity of the compounds.The results showed that four compounds can exert bactericidal effects on standard strains and clinical isolates ofat lowconcentrations.the MIC values of the four compounds 7,10,12,and 25 againststandard strain(E)were 50滋mol/L-100滋mol/L,respectively,and the MBC values were 100滋mol/L-200滋mol/L,respectively.And forclinical isolate strain(E-10),the MIC values were 50滋mol/L-100滋mol/L,respectively,and the MBC were 100滋mol/L-200滋mol/L,respectively.In ourstudy,four compounds with significant antibacterial activity were screened for the first time by VS technology and theirantibacterial and bactericidal activities were verified throughantibacterial tests,which laid a foundation for thedevelopment of novel targeted drugs for the prevention and treatment of multiple-drug resistantinfection.Key words:;DksA protein;multiple-drug resistance;antibacterial activity;virtual screening武周慧，等.靶向大肠杆菌DksA蛋白的小分子化合物的虚拟筛选及其体外抗菌活性的研究第 11 期1117大肠杆菌(，)作为人类和动物的肠道共生菌，也是一种条件致病菌，能够感染多种动物和人1，不仅对动物养殖造成重大经济损失，还对食品安全、公共卫生和人类健康造成严重的危害2。由于抗生素的频繁使用甚至滥用，导致细菌的耐药性不断增加，抗菌药物的研发速度远远低于耐药菌的传播速度，细菌耐药性已成为全球关注的问题3-4。因此，安全、不易产生耐药性和副作用小的新型抗菌药物研究尤为重要。RNA聚合酶结合转录因子DksA是一种保守的RNA聚合酶结合蛋白，普遍存在于许多胃肠道病原体中，如大肠杆菌、沙门菌、变形杆菌等。DksA通过与宿主细胞RNA聚合酶的结合阻断聚合酶与宿主DNA的相互作用5-6，抑制转录起始复合物的形成，增强五磷酸鸟苷和四磷酸鸟苷(p)ppGpp效应，从而调节大肠杆菌和沙门菌的许多全局调节因子的表达或活性7，ppGpp与细菌致病基因的诱导表达和抗生素的耐药性相关8。同时DksA参与多种生物学功能，如对rRNA表达的负调控9，通过破坏转录复合物的稳定性修复大肠杆菌DNA等10。基因与大肠杆菌的多重耐药性相关，缺失该基因可导致大肠杆菌耐药表型发生变化11。近年来，基于蛋白质结构的虚拟筛选(Virtualscreening，VS)技术已广泛应用于抗菌药物靶点的研发12。通过VS进行的分子对接试验已被证明能够快速有效地发现新的抗菌化合物13，分子对接和分子动力学模拟也是最常用的分子建模方法14。VS可分为基于受体和配体的方法15-16，基于受体的方法通常是以给定的蛋白质结构来寻找其结合口袋(Pocket)17；基于配体的方法主要是通过对活性化合物库进行VS，有研究利用该方法发现了天然蒽醌有抗多重耐药大肠杆菌的潜力18-19，Xu等从213 279种化合物中筛选出4种抗大肠杆菌脑膜炎毒力因子IbeA有效的抑制剂20。细菌生存所必需的一些保守酶也可作为筛选有前景的抗菌化合物的潜在靶标，如发现乳香酸类化合物具有抑制大肠杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶(MurA)的潜力21。本研究基于配体的方法通过VS技术和体外抗菌活性研究相结合的策略，以大肠杆菌DksA蛋白为靶标筛选与其具有高亲和力和较好成药性的化合物，通过分析化合物和DksA蛋白的相互作用模式研究它们之间相互作用的结合位点及其作用机制，选择综合打分靠前的化合物进行体外抗菌活性研究，为多重耐药菌感染的治疗提出新方案和有效的治疗药物。1材料与方法1.1菌株及主要试剂大肠杆菌ATCC25922标准株E和大肠杆菌临床分离株E-10均由本实验室保存；LB培养基购自北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药化学试剂有限公司；化合物和恩诺沙星均购自上海陶术生物科技有限公司。1.2DksA蛋白的3D结构及其pocket的分析大肠杆菌DksA蛋白的3个结构模型分别来自晶体结构(1TJL)模型、冷冻电镜结构(7KHE)模型和AlphaFold预测结构(AF)模型，1TJL和7KHE下载自PDB数据库(PDBID：1TJL和 7KHE)，AF预 测 结 构 模 型 由 Al-phaFold软件构建22。通过MOE软件中的QuickPrep插件分别对3个结构模型的质子化以及结构进行优化处 理。利 用 Openeye(Release 3.2.0.2)(https:/ apopdb2receptor 工 具 生 成 基 于1TJL模型、7KHE模型和AF模型DksA蛋白的3D结构，计算 均方根 偏差(Root mean square deviation，RMSD)评估DksA蛋白的3D结构，并分析3个3D结构间的差异及生成3个3D结构的叠合图，当 RMSD为0时表明结构一致完全重合，RMSD小于3时表明结构高度相似。采用MOE中的SiteFinder插件24搜寻各结构模型表面可能存在的小分子化合物的pocket，并分析pocket位置及其属性等指标。根据蛋白质-配体结合(Protein-ligand binding，PLB)值选择3个模型中均最优的pocket。1.3化合物库的处理与多构象的生成用于VS的Targetmol化合物库(T001)中包含38 969个化合物，包含19 592个经典已知活性的化合物和19 377个天然产物单体化合物，该库由上海陶术生物科技有限公司提供。对化合物库的化合物经分子清洗处理，去除盐离子、金属离子、小片段等，再通过能量最小化处理获取化合物的3D结构，并在生物大分子的模拟计算(AMBER10-EHT力场)加氢、加电荷。通过openeye软件中的插件omega2(Ver 3.0.1.2)25对化合物库进行多构象生成，平均每个小分子产生约36个构象。1.4以DksA蛋白为靶标VS小分子化合物中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1118通过Dell T7910工作站(Ubuntukylin 15.10 操 作 系 统)，利 用 VS 软 件 FRED(Ver3.2.0.2)对选定的pocket进行38 969个化合物的分子对接，采用Chemgauss4打分函数通过亲和力对接打分(Binding affinity docking score)得到对接分值(Dock-ing score)，筛选与DksA蛋白具有高亲和力的化合物，用于评估化合物与蛋白相互作用的强度，dock-ing score为负值且值越小表示化合物与蛋白的相互作用越强，亲和力越强。同时基于Stardrop软件提供的口服非中枢神经系统药物评分函数计算各个化合物的成药性分值(Drug score)和基于Stardrop软件所提供的类药五原则(Rule of five，也称为Lipinski rules)评分函数计算得到类药五原则分值(Lipinski rulesscore，简称为Lipinski score)。采用Stardrop软件(Ver 6.5.0)计算和分析小分子化合物属性和成药性属性，化合物属性筛选指标包括氢键受体数量(HBA)、氢键供体数量(HBD)、相对分子质量(MW)和脂水分布系数(logP)；成药性属性筛选指标包括水溶性(logS)、人体小肠吸收(HIA)、hERG(Human ether-a-go-go related gene)抑制率、表面可及性面积(TPSA)、药物相互作用风险(细胞色素P450酶系2D6，CYP2D6、细胞色素P450酶系2C9，CYP2C9)、P-糖蛋白(P-gp)、药物血浆蛋白结合率(PPB)和血脑屏障(BBB)等，以及drug score和lipinskiscore。lipinski score是评估一个化合物或者一个具有药理学活性或生物学活性的化合物能否成为口服药物的经验法则26。drug score和lipinski score是对以上所描述化合物属性的数学统计结果，通过对二者的筛选得到成药性属性较好的化合物，drug score分值范围在0.21，lipinski score分值范围在0.41，值越高表示该化合物的成药性属性越好。采用口服非中枢神经系统药物评分函数分析并去除部分存在一定风险的化合物，最终得到各方面最优的化合物。采用MOE插件中的蛋白-配体相互作用指纹图谱(Protein ligand interface fingerprint，PLIF)方法分析化合物和DksA蛋白(基于AF模型)的相互作用位点，以进一步筛选化合物。1.5VS的活性化合物对大肠杆菌体外抗菌活性的分析选择TargetMol库综合评分排名前40的化合物溶解于DMSO中，均要达到上海陶术生物科技有限公司产品目录中各化合物的最大溶解度，在试验前用LB液体培养基将DMSO稀释至浓度不大于0.1%(0.1%DMSO不影响大肠杆菌的生长)。取100 滋L大肠杆菌E株菌悬液(2伊106cfu/mL)与100 滋L上述各化合物(浓度为800 滋mol/L)加至96孔板中，设含0.1%DMSO的大肠杆菌为阳性对照，恩诺沙星为药物对照，每个样品重复3个孔。置37 孵育12 h后稀释涂板并记数，通过计算抑菌率确定40个活性化合物的抗菌活性。1.6具有抗菌活性的化合物与3个模型3D结构DksA蛋白的对接打分和作用模式分析利用VS软件FRED(Ver 3.2.0.2)将1TJL模型、7KHE模型和AF模型3D结构的DksA蛋白的pocket1与对大肠杆菌标准菌株E具有显著抗菌活性的化合物进行分子对接，通过亲和力对接打分得到这些化合物分别与3个模型3D结构DksA蛋白的docking score，获得这些化合物与DksA蛋白的分子对接模型、相互作用力类型、氨基酸作用位点和周围电荷分布(本研究只展示化合物和AF模型3D结构DksA蛋白的作用模式)。1.7活性化合物对大肠杆菌最小抑菌浓度(Mini-mum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC)的测定采用肉汤微量稀释法测定上述筛选出来的各化合物对大肠杆菌标准菌株E和临床分离株E-10的MIC27，以含0.1%DMSO的大肠杆菌为阳性对照，以恩诺沙星为药物对照。取100 滋L大于MIC值的细菌培养物10倍倍比稀释后涂布LB平板37 培养12 h16 h后活菌计数，试验重复3次。观察LB平板无细菌生长且药物浓度最小，即为该化合物对大肠杆菌标准菌株E和临床分离株E-10的MBC。1.8数据的统计与分析采用GraphPad Prism8.0.2软件处理数据并绘图，采用SPASS 28.1.1软件和 检验对数据统计与分析。*：0.05表示差异显著；*：0.01、*：0.001、*：-6 kcal/mol，drug score 为 0 0.8，lipinski score 为0.51(图2)。进一步提高亲和力的筛选条件，当docking score阈值设为-7 kcal/mol时(为更精确筛选到与DksA蛋白具有高亲和力的化合物，且3个模型DKsA蛋白3D结构中只要任意一个3D结构满足该条件即可)。筛选得到的docking score在-11 kcal/mol-7 kcal/mol的551个化合物，用于后续的成药属性及作用位点分析。表明，基于1TJL模型、7KHE模型和AF模型3D结构的DksA蛋白分别与化合物对接筛选获得的化合物的相应亲和力均存在差异。2.3基于化合物属性和成药性属性评价的第二轮VS结果采用Stardrop软件(Ver 6.5.0)计算和分析小分子化合物属性(HBA、HBD及MW)和成药属性筛选指标(logS、HIA、logP、hERGpIC50、TPSA、BBB、P-gp)等，以及基于评分函数计算各化合物的drugscore和lipinski score。期望值(Desired value)和重要性(Importance)是对上述分值的统计结果(图3A)。对第一轮VS得到的551个化合物进行成药性属性分析，通过去除drug score0.2以及lipinski score0.4后共计获得具有很好水溶性和理想的脂溶性属性的372个化合物(图3B)。进一步采用lipinski rules分析并去除372个化合物部分存在2C9药物酶代谢风险、较高的2D6酶代谢风险、心脏毒性风险等的化合物，最终获得340个化合物(图3C)。上述结果表明，通过分子对接、计算和分析小分子化合物属性和成药性属性，筛选出 符合-11 kcal/moldocking score0.4和drug score0.2的高亲和力和成药属性均较好的340个化合物。2.4化合物与DksA蛋白相互作用位点分析的第三轮VS结果基于DksA蛋白AF模型的3D结构，采用MOE插件中的PLIF方法分析化合物与DksA蛋白的相互作用位点。结果显示，在340个高亲和力和成药属性好的化合物中，通过PLIF方法获得296个具有潜在活性、且与DksA蛋白存在相互作用的化合物。在基于AF模型3D结构的DksA蛋白中，有27个氨基酸位点参与化合物的相互作用，其中高 频氨基酸为Arg129、Asp110、Leu95、Lys105、Arg125等(图4A)。其中95个化合物和DksA蛋白的结合位点是Lys98、Arg129和Lys139，这3个位点与ppGpp相互作用，这些化合物可能和DksA竞争性结合ppGpp。95个化合物中有81个化合物结合Arg129，28个化合物结合Lys98，13个化合物结合Lys139(图4B)。上述结果表明，采用PLIF方法筛选得到296个具有潜在活性且与DksA蛋白存在相互作用的化合物中95个化合物可能通过与DksA蛋白Lys98、Arg129和Lys139位点竞争性结合ppGpp，间接影响细菌的耐药性和致病性。2.5筛选出的活性化合物对大肠杆菌体外抗菌活性的分析结果综合VS打分、亲和力筛选和成药属性分析，本研究选择了综合分值排名前40的化合物(140)进行体外抗菌活性研究，以400 滋mol/L浓度测试各化合物对大肠杆菌标准株E的抑菌率，以恩诺沙星为药物对照。结果显示，9个化合物(5、6、7、8、10、12、19、25和40)对大肠杆菌标准株E的抑菌率达50%以上，与恩诺沙星相比，5个化合物(7、10、12、19和25)对大肠杆菌标准株E抑菌率达80%以上(图5)。上述结果表明，5个化合物对大肠杆菌均具有显著的抑菌活性。Docking score(kcal/mol)AF10.80.60.40.20-12-10-8-6Docking score(kcal/mol)1TJL10.80.60.40.20-12-10-8-6ABDocking score(kcal/mol)7KHE10.80.60.40.20-12-10-8-6Lipinski score10.80.60.40.2000.20.40.60.81CD*:0.05;*:0.01;*:0.001;*:1+0-3.5臆5low medium臆6nolow-臆-0.5臆10臆5臆500臆5ImportanceBALeu12Cys114Ile14Tyr31Met32Trp47Arg91Leu95Lys98Lys105Glu109Asp110Phe111Gly112Tyr113Glu143Glu115Gly118Arg125Ala128Arg129Pro130Thr131Ala132Asp133Leu134Lys139Leu12Cys114Ile14Tyr31Met32Trp47Arg91Leu95Lys98Lys105Glu109Asp110Phe111Gly112Tyr113Glu143Glu115Gly118Arg125Ala128Arg129Pro130Thr131Ala132Asp133Leu134Lys139Ile14Trp47Arg91Leu95Lys98Glu143Arg125Ala128Arg129Thr131Ala132Asp133Leu134Lys139Ile14Trp47Arg91Leu95Lys98Glu143Arg125Ala128Arg129Thr131Ala132Asp133Leu134Lys13940393837363534333231302928272625242322212019181716151413121110987654321100959085808070605050403020100中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1122A-I:Compounds 5-8,10,12,19,25 and 40图69个化合物和DksA蛋白(基于AF模型3D结构的DksA蛋白)重要氨基酸之间相互作用的模式图和docking score(红色表示氧原子，蓝紫色表示氮原子)武周慧，等.靶向大肠杆菌DksA蛋白的小分子化合物的虚拟筛选及其体外抗菌活性的研究第 11 期11232.6具有抗菌活性的化合物与3个模型3D结构DksA蛋白的对接打分和作用模式分析结果通过体外抑菌试验结果，选取3个模型3D结构DksA蛋白的pocket1与对大肠杆菌标准株E抑制率达50%以上的9个化合物(5、6、7、8、10、12、19、25和40)进行分子对接，并经对接打分和相互作用位点分析。结果显示，9个化合物与DksA蛋白(均是基于AF模型3D结构的DksA蛋白)的氨基酸通过氢键相互作用，其周围分布着带正电荷的氨基酸，且docking score较为理想。其中化合物5与DksA蛋白氨基酸的Arg125和Leu134存在相互作用；化合物6与DksA蛋白氨基酸的Leu95和Ala128存在相互作用；化合物7和19与DksA蛋白氨基酸的Lys98、Arg129存在相互作用；化合物8、10、12、25和40均与DksA蛋白氨基酸的Arg129存在相互作用。基于3个模型3D结构DksA蛋白的dockingscore见图6A图6I；通过分析发现Lys98和Arg129是7个化合物(7、8、10、12、19、25和40)与DksA蛋白结合的氨基酸位点，同时也是DksA蛋白和ppGpp的结合位点，这7个化合物可能影响ppGpp与DksA蛋白的结合，进而间接影响细菌的耐药性和致病性。上述结果表明，上述9个化合物与大肠杆菌DksA蛋白的亲和力均较强，且与其相应的氨基酸存在相互作用。ABCDEFGHI2.7活性化合物对大肠杆菌MIC和MBC的测定结果采用微量肉汤法测定9个化合物和恩诺沙星对大肠杆菌标准株E和临床分离株E-10的MIC。结果显示，化合物5、6和8对大肠杆菌标准株E的MIC为200 滋mol/L；化合物7和恩诺沙星对大肠杆菌标准株E的MIC为50 滋mol/L；化合物10、12和25对大肠杆菌标准株E的MIC均为100 滋mol/L；化合物7、10和恩诺沙星对大肠杆菌临床分离株E-10的MIC均为50 滋mol/L，化合物12和25对大肠杆菌临床分离株E-10的MIC均为100 滋mol/L；化合物7、10、12、25和恩诺沙星对大肠杆菌标准株E的MBC分别为100滋mol/L、200 滋mol/L、200 滋mol/L、200 滋mol/L和100 滋mol/L，对大肠杆菌临床分离株E-10的MBC分别为100滋mol/L、100滋mol/L、200 滋mol/L、200 滋mol/L和100 滋mol/L。表1中列出了筛选出来的9个化合物各种评价指标及对大肠杆菌标准菌株和临床分离株的MIC和MBC，表中“/”表示没有测出该化合物对大肠杆菌的MIC或MBC值。上述结果表明，有4个化合物(表1中的红色字)表19个化合物的各种评价指标及对大肠杆菌MIC、MBC的测定结果5:L-2-Hydroxyglutaricacid disodium6:Hydroxy-Dynasore7:O-Phenanthrolinemonohydrate8:BTZO-110:Pteroic acid12:NSC385219:Tirapazamine25:Alosetronhydrochloride40:TPTZStructure148.1338.3180.2240.3312.3174.2178.1294.4312.3Lipinskiscore111111111Drugscore0.3680.5080.4720.5520.4370.6840.4090.4380.3