不同果型西瓜单倍体诱导技术优化.pdf

中中 国国 瓜瓜 菜菜2024，37（1）：18-24试验研究收稿日期：2023-09-05；修回日期：2023-10-14基金项目：国家重点研发计划项目（2020YFD1000300）；国家西甜瓜产业技术体系（CARS-25）；湖南省教育厅科研项目（19B271）作者简介：戴玉娟，女，在读硕士研究生，主要研究方向为西瓜分子育种。E-mail：通信作者：戴思慧，女，教授，主要研究方向为瓜果蔬菜学。E-mail：西瓜（Citrullus lanatus）是中国重要的园艺作物，也是夏季主要的消暑果品之一，在全世界广泛种植。传统的西瓜育种周期长，很难产生突破性品种，获得纯合自交系需要 6 代以上，而双单倍体育种只需要 2 代。利用单倍体技术还能迅速获得个体完全纯合的双单倍体群体，为遗传分析、分子标记和数量性状分析提供理想材料。但西瓜单倍体的自然发生率低1，雌核离体培养是一个有效的途径。目前单倍体诱导技术已在黄瓜2-3、南瓜4-5、大葱6、洋葱7等蔬菜作物上广泛应用，在西瓜8-13上的应用也有报道，并已建立完整的诱导体系。Zou 等9以中果型西瓜品种早佳为供体，通过雌核发育途径获得了西瓜单倍体植株，胚状体诱导率最高为20.67%，并选取了 50 株再生植株进行倍性鉴定，单倍体率为 96%，二倍体率为 4%，未发现四倍体与嵌合体。龚思等10以中果型西瓜早佳的未受精子房为试材，对影响西瓜未受精子房离体培养的条件进行了研究，发现单倍体胚状体诱导率为 21.33%；其中单倍体率 97%、二倍体率 3%，这与 Zou 等9在西瓜不同果型西瓜单倍体诱导技术优化戴玉娟，龚诗琦，孙翔宇，陈浩杰，熊程，孙小武，戴思慧（园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程研究中心 湖南农业大学园艺学院长沙410128）摘要：西瓜未受精子房离体培养是诱导单倍体的有效方法，可缩短育种时间。为建立高效稳定的单倍体诱导体系，提高单倍体诱导率，以大果型品种雪龙 1 号、雪龙 3 号，中果型品种早蜜、红都 2 号和小果型品种小玉 9 号和黄小玉的 6 个杂交一代（2n=2x=22）西瓜的未受精子房为试验材料，研究不同植物生长调节剂种类和质量浓度对西瓜单倍体诱导率的影响。结果表明，6 个不同基因型品种在 2 mgL-16-BA+1 mgL-1NAA 和 2 mgL-16-BA+2 mgL-1NAA 的诱导培养基中均能诱导出胚状体，除黄小玉以外，均获得了单倍体再生植株；其中，红都 2 号的胚状体诱导率最高，达 63.89%；其次是早蜜，诱导率为 55.56%。关键词：西瓜；植物生长调节剂；单倍体诱导中图分类号：S651文献标志码：A文章编号：1673-2871（2024）01-018-07Optimisation of haploid induction techniques in watermelon with differ-ent fruit typesDAI Yujuan,GONG Shiqi,SUN Xiangyu,CHEN Haojie,XIONG Cheng,SUN Xiaowu,DAI Sihui（Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding,Ministry of Education/College ofHorticulture,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,Hunan,China）Abstract:Unfertilized ovary culture of watermelon is an effective method to induce haploids,which can shorten thebreeding time.In order to establish an efficient and stable haploid induction system and improve the haploid inductionrate,the unfertilized ovaries of six watermelon hybrids（2n=2x=22）of large-fruited variety Xuelong 1 and Xuelong 3,medium-fruited variety Zaomi,Hongdu 2,and small-fruited variety Xiaoyu 9,Huangxiaoyu were used as experimentalmaterials.The effects of different plant growth regulators on the haploid induction rate of watermelon were studied.Theresults showed that six different genotypes of watermelon were induced in the induction medium 2 mgL-16-BA+1 mgL-1NAA,2 mgL-16-BA+2 mgL-1NAA,and haploid regeneration plants were obtained except for Huangxiaoyu.Amongthem,Hongdu 2 had the highest induction rate of 63.89%,followed by Zaomi with an induction rate of 55.56%.Key words:Watermelon;Plant growth regulator;Haploid inductionDOI：10.16861/ki.zggc.2023.058018第1期，等：不同果型西瓜单倍体诱导技术优化试验研究单倍体培养试验中再生植株的倍性鉴定结果基本一致。李玲等11以大果型西瓜品种西农 9 号和小果型西瓜品种早春红玉、小绿黄为供体，芽点诱导率最高为 17.2%，仅早春红玉获得了再生植株。李迎迎12以 3 个大果型和 1 个特大果型西瓜品种为试材，胚状体诱导率最高仅 1.67%，且未获得单倍体再生植株。目前未见到以大、中、小 3 种果型在相同植物生长调节剂配方中均能诱导出单倍体植株的报道，且西瓜未受精子房诱导单倍体的研究所采用的主要材料大多为单一果型品种，虽已获得再生单倍体植株，但诱导率仍然较低8-13。针对上述问题，笔者以 6 个不同基因型的大、中、小果型西瓜品种为试材，研究不同植物生长调节剂种类和质量浓度对西瓜单倍体诱导率的影响，并对获得的再生植株进行了倍性鉴定，以期筛选到能够诱导大、中、小 3 种果型的诱导培养基，建立高效稳定的西瓜单倍体诱导体系，为西瓜单倍体育种提供技术支持。1材料与方法1.1材料试验材料包括大果型西瓜品种雪龙 1 号、雪龙3 号，中果型西瓜品种早蜜、红都 2 号和小果型西瓜品种小玉 9 号、黄小玉，品种均为杂交一代材料（2n=2x=22），由湖南雪峰种业责任有限公司提供，材料特点见表 1 和图 1。试验于 2022 年 3 月至2023 年 6 月在湖南农业大学园艺学院实验室及金山基地进行。1.2方法1.2.1未受精子房离体培养与植株再生参照 Zou等9的方法进行子房处理。在第 2 朵雌花开放后采收子房，开花前一天 17：00 套袋，开花当天 08：00前取回，取回的材料立即处理或放在 4 冰箱保存。首先去掉子房的花蕾和花茎，并冲洗干净表面的绒毛；然后用 75%的乙醇消毒 1 min、蒸馏水冲洗3 次后，将子房去皮，切成 1 mm 左右的切片；再用 1%的次氯酸钠溶液消毒 1 min，蒸馏水冲洗4 次；最后将切片放在无菌滤纸上吸干水分，接种至诱导培养基中培养。将中果型早蜜的子房切片接种到 M1M10 诱导培养基上，研究不同培养基配方对早蜜胚状体诱导率的影响。将 6 个不同基因型的子房切片接种到 M1、M7、M8、M9、M10 等 5 个注：a.雪龙 3 号；b.雪龙 1 号；c.早蜜；d.红都 2 号；e.小玉 9 号；f.黄小玉。Note:a.Xuelong 3;b.Xuelong 1;c.Zaomi;d.Hongdu 2;e.Xiaoyu 9;f.Huang xiaoyu.图 1不同基因型的西瓜子房Fig.1Watermelon ovaries of different genotypes表 1供体材料的主要性状Table 1Main traits of donor materials材料名称Material names雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3早蜜Zaomi红都 2 号Hongdu 2小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu果型Fruit type大果型Big fruit大果型Big fruit中果型Medium fruit中果型Medium fruit小果型Small fruit小果型Small fruit材料特性Material characters生长势强，红瓤，花皮Strong growth potential,red flesh,green peel with dark green bands高抗枯萎病，生长势强，红瓤，花皮resistance to Fusarium wilt,stronggrowth potential,red flesh,greenpeel with dark green bands生长势强，红瓤，花皮Strong growth potential,red flesh,green peel with dark green bands生长势强，红瓤，花皮Strong growth potential,red flesh,green peel with dark green bands生长势强，红瓤，花皮Strong growth potential,red flesh,green peel with dark green bands生长势强，黄瓤，花皮Stronggrowthpotential,yellowflesh,green peel with dark greenbands戴玉娟，等：不同果型西瓜单倍体诱导技术优化19中国瓜菜第37卷试验研究诱导培养基上，研究不同基因型对胚状体诱导率的影响。每个处理接种 3 瓶并设置 3 次重复，每瓶接种20 片。前 4 d 将接种后的培养瓶放在 33 的黑暗环境下进行热激处理，第 5 天转至培养室中培养，温度为 25，光周期为 16 h/8 h（光/暗）。经过 14 d的诱导培养，将子房切片转至分化培养基中，大约35 d 诱导出胚状体，胚状体诱导率/%=出胚数/接种片数100。最后将有明显形态学上端和下端的胚状体转至 MS 培养基中，直至生长成完整的再生植株。再生植株率/%=完整再生植株数/出胚数100。单倍体诱导过程中的具体培养基配方见表 2。表 2西瓜未受精子房培养的培养基配方Table 2Media formulations for unfertilised ovary culture in watermelon培养基MediumM1M2M3M4M5M6M7M8M9M10N1MS（MS 改良培养基）Modified MS medium concentration/（gL-1）41.441.441.441.441.441.441.441.441.441.441.441.4（2，4-D）/（mgL-1）012201120000（6-BA）/（mgL-1）213131232210（NAA）/（mgL-1）42224411120.50培养基用途Application of medium诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture诱导培养 Induction culture分化培养 Differentiation culture生根培养 Rooting culture1.2.2流式细胞仪检测用刀片取 0.5 cm2的再生植株幼叶，置于培养皿中，取 400 L Partec CyStainUV Precise P 裂解冲液涂在叶片周围，用刀片将叶片切碎，充分提取出完整的细胞核，提取时间约 为 10 s，随后用后 30 m 滤网过滤至样品管中，再用 1600 L 的 Partec CyStain UV Precise P 染液染色 10 s，最后用 Partec CyFlow Space 检测悬浮液的核 DNA 相对含量。样本峰值的荧光强度X-Mean（横坐标）与细胞 DNA 含量成正比，所以由各样本 X-Mean 之间的比例关系判断倍性。用二倍体（2n=2x=22）的西瓜植株为参考标准，将对照的二倍体峰调整在横坐标 100 位置，则单倍体峰值会出现在 50，而峰值在 200 位置的则为四倍体。图形的纵坐标代表细胞数量，峰的高低反映了细胞比例的不同。1.3数据处理采用 SPSS 26.0 与 Excel 2019 软件进行试验数据处理和统计分析。2结果与分析2.1胚状体发育及诱导成苗过程子房切片在 33 的黑暗环境下热激 4 d 后，胚珠明显膨大（图 2-a），再经过 5 d 的光照培养，膨大的胚珠变绿（图 2-b）。培养 35 d 左右，胚状体长注：a.胚珠膨大；b.胚珠转绿；c.胚状体；d.再生植株。Note:a.Ovule enlargement;b.Ovule change green;c.Embryoid;d.Regenerated plant.图 2西瓜未受精子房离体培养Fig.2Isolated culture of unfertilised ovary in watermelon20第1期，等：不同果型西瓜单倍体诱导技术优化试验研究出明显的形态学上端和下端（图 2-c）时转接至 MS 生根培养基中，生长成完整的再生植株（图 2-d）。2.2不同培养基配方对早蜜胚状体诱导率的影响由表 3 可知，早蜜在不同培养基配方中胚状体诱导率由高到低依次为 M9M10M1M7M8M2M3、M4M5、M6，其中 M9 配方胚状体诱导率最高，达 49.44%，与其余 9 个配方呈显著差异；选用5 个诱导效果较好的培养基配方进行下一步试验，即 M1、M7、M8、M9、M10。2.3不同基因型对西瓜未受精子房胚状体诱导率的影响由表 4 可知，所选用的 6 个不同基因型材料都能诱导出胚状体，但不同基因型之间的胚状体诱导率存在较大差异，在 063.89%之间。大果型雪龙 1号和雪龙 3 号胚状体诱导率最高分别为 6.11%和8.89%；中果型红都 2 号和早蜜的诱导率最高分别为63.89%和 55.56%；小果型小玉 9 号和黄小玉的胚状体诱导率最高分别为 1.11%和 2.22%。整体来看，中果型品种胚状体诱导率较高，其次是大果型品种，小果型品种的诱导率最低，其中黄小玉仅在 M9 和 M10 培养基上成功诱导出胚状体。2.4不同植物生长调节剂配方对西瓜未受精子房胚状体诱导率的影响由表 4 可知，5 种诱导培养基均能诱导出胚状体，其中 M9 和 M10 能诱导出大、中、小 3 种果型的胚状体，但胚状体诱导率差异大。大果型品种雪龙 1 号在 M10 中胚状体诱导率最高（6.11%），雪表 3不同培养基配方对早蜜胚状体诱导率的影响Table 3Effect of different media formulations on theinduction rate of early honey blastomeres培养基MediumM1M2M3M4M5M6M7M8M9M10接种数Number ofinoculation180180180180180180180180180180出胚数Number ofembryoid285330015108956胚状体诱导率Embryoidinductionrate/%15.56 c2.78 e1.67 e1.67 e0.00 e0.00 e8.33 d5.56 d49.44 a31.11 b注：同列不同小写字母表示不同处理间在 0.05 水平差异显著。下同。Note:Different small letters in the same column indicate signifi-cant difference among different treatment at 0.05 level.The same below.培养基MediumM1M7M8M9M10品种Varieties雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu接种数Number ofinoculation180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180180出胚数Number ofembryoid13183310341211102117130081679100241121156421胚状体诱导率Embryoidinductionrate/%0.56 e1.67 e10.00 e18.33 d0.56 e0.00 e1.67 e2.22 e6.67 e6.11 e0.56 e0.00 e1.11 e0.56 e9.44 e7.22 e0.00 e0.00 e4.44 e8.89 e43.80 b55.56 a1.11 e2.22 e6.11 e1.11 e63.89 a35.56 c1.11 e0.56 e表 4不同培养基配方对未受精子房胚状体诱导率的影响Table 4Effect of different media formulations on theinduction rate of embryoid bodies of unfertilised ovary戴玉娟，等：不同果型西瓜单倍体诱导技术优化21中国瓜菜第37卷试验研究龙 3 号在 M9 中胚状体诱导率最高（8.89%），但均与其他诱导培养基之间无显著差异。中果型品种红都 2 号在 M10 中胚状体诱导率最高，达 63.89%，M9 中诱导率为 43.80%，均与 M1、M7、M8 培养基呈显著差异；中果型品种早蜜在 M9 中胚状体诱导率最高，达 55.56%，M10 中胚状体诱导率为 35.56%，均与其他诱导培养基呈显著差异。小果型品种小玉 9号、黄小玉在 M9 中的胚状体诱导率分别为 1.11%和 2.22%，均与其他诱导培养基无显著差异。2.5胚状体成苗情况通过对胚状体后期生长状况的观察与记录，发现部分发育不完全的胚状体（图 3），包括无生长点植株、黄化苗、玻璃化植株和生长缓慢植株4 种类型。共成功诱导胚状体 517 个，产生完整再生植株 233 株，再生植株率为 45.07%，见表 5。整体来看，2 个中果型品种在 5 个再生培养基上均能获得完整的再生植株，再生植株率较高，其中早蜜的再生植株率在 36.36%52.00%，红都 2 号的再生植株率在 11.11%60.00%；大果型和小果型品种虽有一定的再生植株率，但本身出胚数较少，再生植株率没有统计学上的意义。注：a.无生长点植株；b.黄化苗；c.玻璃化植株；d.生长缓慢植株。Note:a.Plant without growing points;b.Etiolated seedling;c.Vitrifiedplant;d.Slow growing plant.图 3发育不完全的再生植株Fig.3Incompletely developed regenerated plants培养基MediumM1M7M8M9M10品种Varieties雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu雪龙 1 号Xuelong 1雪龙 3 号Xuelong 3红都 2 号Hongdu 2早蜜 Zaomi小玉 9 号Xiaoyu 9黄小玉Huang xiaoyu出胚数Number ofembryoid1318331034511102117130081679100241121156421再生植株数Number ofregeneratedplants01215000034000056003342522021632810再生植株率Regeneratedplants rate/%0.0033.3311.1145.450.000.000.000.0060.0036.360.000.000.000.0029.4146.150.000.0037.5018.7553.1652.00100.000.0018.1850.0054.7843.7550.000.00表 5西瓜未受精子房培养的再生植株率Table 5Regenerated plants rate of unfertilised ovaryculture in watermelon2.6流式细胞仪倍性鉴定对得到的 233 株再生植株，利用流式细胞仪对其中的 50 株进行倍性鉴定（图 4）。结果表明，47 株为单倍体，3 株为二倍体，单倍体率为 94%。22第1期，等：不同果型西瓜单倍体诱导技术优化试验研究3讨论与结论基因型已被证明是许多植物未受精子房离体培养的关键因素，如黄瓜14-17、南瓜5、18、西葫芦19-21等。在西瓜中，也有研究表明，基因型是影响雌核发育的关键10-12，不同基因型的西瓜胚状体诱导率在 1.67%21.33%。在本研究中，笔者所选用的 6个不同的基因型都诱导出了胚状体，但不同基因型之间的胚状体诱导率差异较大。在 M9 诱导培养基中，大果型西瓜品种雪龙 1 号和雪龙 3 号的诱导率分别为 4.44%和 8.89%，雪龙 3 号的诱导率是雪龙 1号的 2 倍；中果型西瓜品种早蜜的诱导率最高（55.56%），红都 2 号次之（43.80%），早蜜的诱导率比红都 2 号高 11.76 个百分点；但小果型品种小玉9 号和黄小玉的诱导率均偏低，分别为 1.11%和2.22%。由此可见，中果型西瓜品种的胚状体诱导率均比大果型和小果型高，不同基因型的胚状体诱导率存在显著差异，也进一步说明基因型是影响西瓜未受精子房培养诱导胚状体的关键因素，与前人的研究结果一致。龚思等10以中果型西瓜早佳未受精子房为试材，对西瓜未受精子房的胚状体诱导率进行了研究，最高胚状体诱导率为 21.33%；而本研究中红都 2 号的胚状体诱导率最高为 63.89%，是早佳的 3 倍。前人研究结果表明，不同诱导培养基的胚状体诱导率差异显著，植物生长调节剂在胚状体诱导中发挥了重要作用9-10，22-23。Zou 等9在西瓜未受精子房培养中选用中果型西瓜品种早佳和黑媚娘，在MS+3 mgL-12,4-D+2 mgL-16-BA+0.5 mgL-1NAA诱导培养基中培养，早佳的胚状体诱导率最高，为 20.67%，黑媚娘的诱导率为 14.72%，而在 MS+3 mgL-12，4-D+1 mgL-16-BA+0.5 mgL-1NAA 中，早佳和黑媚娘胚状体诱导率仅为 1.67%和 6.94%，说明不同植物生长调节剂的添加量是重要因素。在笔者的研究中，M9（MS+2 mgL-16-BA+1 mgL-1NAA）和 M10（MS+2 mgL-16-BA+2 mgL-1NAA）是西瓜未受精子房诱导单倍体的最佳诱导培养基，6 个不同基因型的西瓜品种在 M9 和 M10 诱导培养基中都能诱导出胚状体，当使用不同的诱导培养基时，胚状体诱导率有显著差异。以中果型为例，红都 2 号在 M10 诱导培养基中胚状体诱导率最高，达 63.89%，诱导率是 M1 的 10 倍；而早蜜在 M9诱导培养基中效果最好（55.56%）。本研究中，红都 2号在M7（MS+1mgL-12，4-D+2mgL-16-BA+1mgL-1NAA）诱导培养基的培养下，胚状体诱导率仅为6.67%，可能是添加了 2，4-D 的原因，这与荣文娟等13在未受精胚珠培养萌发的研究结果一致，认为2，4-D 能有效促进愈伤组织生长，但得到的愈伤组织难以分化。在笔者的研究中，共获得了 233 株再生植株，这是西瓜单倍体育种的一个很大突破。笔者利用流式细胞仪对 50 株再生植株进行倍性鉴定，结果表明，47 株为单倍体，3 株为二倍体，单倍体率为94%。在研究过程中，尽管筛选到了能够诱导大、200160120804000100200300400500相对荧光强度Relative fluorescence intensity0100200300400500相对荧光强度Relative fluorescence intensity0100200300400500相对荧光强度Relative fluorescence intensity400320240160800注：从左至右依次为单倍体再生植株、二倍体再生植株和对照二倍体植株。Note:Haploid regenerated plant,diploid regenerated plant and diploid plant（control）from left to right.图 4流式细胞仪对再生植株的倍性鉴定Fig.4Ploidy determination of regenerated plants by flow cytometry histogram400320240160800数量 Number数量 Number数量 Number戴玉娟，等：不同果型西瓜单倍体诱导技术优化23中国瓜菜第37卷试验研究中、小果型胚状体的培养基，但大果型和小果型品种的胚状体诱导率和再生植株率偏低，可能与基因型、诱导培养基所添加的植物生长调节剂的种类和浓度有关，且小果型品种黄小玉未获得再生单倍体植株。下一步，笔者一方面将调整植物生长调节剂的种类和浓度，以提高大、小果型品种的胚状体诱导率；另一方面，根据流式细胞仪倍性鉴定的结果，笔者将利用化学药剂（秋水仙素、氨磺乐灵等）对获得的西瓜单倍体再生植株进行染色体加倍，以获得双单倍体植株。综上所述，笔者筛选到了适合大、中、小果型的西瓜单倍体诱导培养基，提高了西瓜单倍体诱导率，并获得了除黄小玉外的单倍体再生植株。研究结果对提高西瓜育种效率具有重要意义，有助于推进西瓜育种发展，为西瓜单倍体育种提供技术支持。参考文献1SARI N，ABAK K，PITRAT M，et al Induction of 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