DB42∕T 1992-2023 动物尿液中α-受体激动剂的测定 高效液相色谱-串联质谱法(湖北省).pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 19922023 动物尿液中-受体激动剂的测定 高效液相色谱-串联质谱法 Determination of-receptor agonists in animals urine by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2023-03-28 发布 2023-05-28 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 19922023 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 试剂和材料.1 6 仪器和设备.2 7 样品的制备和保存.2 8 测定步骤.2 9 结果计算.4 10 灵敏度、准确度和精密度.5 附录 A（资料性）7 种-受体激动类药物中英文通用名称、化学分子式和 CAS 号.6 附录 B（资料性）猪尿基质匹配 7 种-受体激动类药物标准溶液色谱图.7 DB42/T 19922023 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位:湖北省兽药监察所（湖北省畜禽产品质量监督检验测试中心）、武汉海关技术中心。本文件主要起草人：王峻、金秀娥、龚波、王鹏、李菁菁、曾勇、王建华、卢芳、舒金秀、陈向丹、胡深、董文婷、周平、吴晓翠、冯超林。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：[phone]，邮箱；对本文件的有关修改意见建议请反馈至湖北省兽药监察所（湖北省畜禽产品质量监督检验测试中心），联系电话：[phone]，邮箱：。DB42/T 19922023 1 动物尿液中-受体激动剂的测定 高效液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了动物尿液中可乐定、溴莫尼定、替扎尼定、胍法辛、胍那苄、安普乐定、赛拉嗪等7种-受体激动剂的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于猪、牛、羊的尿液中可乐定、溴莫尼定、替扎尼定、胍法辛、胍那苄、安普乐定、赛拉嗪等7种-受体激动剂的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样中残留的-受体激动剂，经过氢氧化钠溶液碱化，乙酸乙酯提取并浓缩后用混合型阳离子固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。5 试剂和材料 测定试剂和材料如下：水为符合 GB/T 6682 规定的一级水；甲醇（CH3OH）：色谱纯；甲酸(HCOOH)：色谱纯；氢氧化钠（NaOH）：分析纯；乙酸乙酯（CH3COOC2H5）：分析纯；氯化钠（NaCl）：分析纯；氨水(NH4OH)：25%28%，分析纯；氢氧化钠溶液（5 mol/L）：准确称取固体氢氧化钠 100 g，用水溶解并定容至 500 mL；5%氨水甲醇溶液：取 5 mL 氨水，用甲醇定容至 100 mL；0.1%甲酸溶液：取甲酸 0.1 mL，用水定容至 100 mL；甲酸-甲醇溶液：取 0.1%甲酸溶液 90 mL，加甲醇 10 mL，混匀；DB42/T 19922023 2 标准物质：盐酸可乐定、溴莫尼定、盐酸替扎尼定、胍法辛、胍那苄、盐酸安普乐定、赛拉嗪含量均98.0%。具体见附录 A；标准储备液：准确称取适量的标准物质，用甲醇分别配制成 1 mg/mL 标准储备液，于 2 8 温度保存，有效期 6 个月；混合标准中间液：分别准确量取 1.00 mL 可乐定、溴莫尼定、替扎尼定、胍法辛、胍那苄、安普乐定、赛拉嗪标准储备液置于同一个棕色 100 mL 量瓶中，用甲醇配制成浓度为 10 g/mL 的混合标准中间液，于 2 8 温度保存，有效期 1 个月；混合型阳离子固相萃取柱：60 mg/3 mL，或相当者；微孔滤头：0.22 m 有机相。6 仪器和设备 测定仪器和设备如下：液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；天平：感量 0.01 g 和 0.01 mg；氮吹仪；冷冻高速离心机：转速10000 r/min；振荡器；涡旋混合器；离心管：50 mL；固相萃取装置；pH 计。7 样品的制备和保存 样品的制备 取适量新鲜或解冻后摇匀的空白或供试样品，如有混浊，离心后取上清备用。取摇匀的供试样品，作为供试试样。取摇匀的空白样品，作为空白试样。取摇匀的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。样品的保存-20 以下条件保存。8 测定步骤 样品前处理 取试样5.0 mL,于50 mL塑料离心管中,用5 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.011.0，涡旋混匀，加乙酸乙酯10 mL，加1.5 g2.0 g氯化钠，充分振荡，于10000 r/min离心5 min，转移上清液于另一50 mL塑料离心管中。下层溶液中加乙酸乙酯10 mL重复提取一次，合并两次上清液，50 氮气吹干，加甲酸-甲醇溶液5.0 mL溶解残余物，备用。DB42/T 19922023 3 取固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，把全部备用液以每秒一滴的速度过混合型阳离子固相萃取柱，依次用水3 mL、甲醇3 mL分别淋洗，真空抽干，5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，于50 水浴中氮气吹干。用甲酸-甲醇溶液1.0 mL溶解残余物，涡旋1 min，过0.22 m微孔滤头，供液相色谱-串联质谱测定。基质匹配标准曲线的构建 取空白样品按8.1处理后作为基质空白溶液。准确移取适量混合标准中间液，用基质空白溶液配制成1 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L和80 g/L基质匹配标准工作液，供液相色谱-串联质谱测定。以各药物特征离子的色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线，求回归方程和相关系数。测定 8.3.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下：色谱柱：C18柱，粒径 2.7 m，内径 2.1 mm，柱长 100 mm，或性能相当者；流动相：梯度洗脱条件见表 1；柱温：35；流速：0.3 mL/min；进样量：10 L。表1 梯度洗脱程序 时间 min 0.1%甲酸水溶液%甲醇%0.00 90 10 0.50 90 10 2.00 65 35 5.00 10 90 6.00 10 90 6.10 90 10 7.00 90 10 8.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压（Capillary Voltage）:4000 V；雾化温度(Gas temp):325；雾化器流速(Gas flow)：10 L/min;雾化器压力(Nebulizer)：40 psi；鞘气温度(Sheath gas temp)：300；鞘气流速(Sheath gas flow)：11 L/min 监测模式：多反应监测（MRM 采集模式）DB42/T 19922023 4 各种药物的 MRM 参数见表 2。表2 MRM 参数 药物名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 可乐定 230.0160.0 230.0213.0 125 40 230.0213.0 125 30 溴莫尼定 292.0170.1 292.0212.1 125 40 292.0212.1 125 33 替扎尼定 254.0210.0 254.044.1 130 35 254.044.1 130 35 胍法新 246.0158.9 246.060.1 95 37 246.060.1 95 17 胍那苄 231.0136.0 231.0172.0 125 30 231.0172.0 125 25 安普乐定 245.0209.0 245.0174.0 135 25 245.0174.0 135 33 赛拉嗪 221.0163.9 221.090.0 135 30 221.090.0 135 25 定性定量方法 8.4.1 定性方法 在相同试验条件下，样品中待检测物质与基质匹配标准溶液中对应物质的保留时间偏差在2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质匹配标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度（%）50 2050 1020 10 允许的相对偏差（%）20 25 30 50 8.4.2 定量方法 在仪器最佳工作条件下，分别取适量试样溶液和相应浓度的基质匹配标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。基质匹配标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述条件下，-受体激动剂标准溶液特征离子质量色谱图见附录A。空白实验 除不加试样外，采用完全相同的测定步骤（8.1）进行平行操作。9 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式（1）计算样品中-受体激动剂类药物的浓度，结果需扣除空白值，试样中-受体激动剂类药物的残留量X，以体积分数微克每升(g/L)表示，按式(1)计算：DB42/T 19922023 5 =12 (1)式中：X 试样中相应的-受体激动剂类药物的残留量，单位为微克每升(g/L)；Cs 标准溶液中相应的-受体激动剂类药物的浓度，单位为微克每升(g/L)；A 试样溶液中相应的-受体激动剂类药物的色谱峰面积；As 标准溶液中相应的-受体激动剂类药物的色谱峰面积；V1 溶解残余物所用的溶液体积，单位为毫升(mL)；V2 试样体积，单位为毫升(mL)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。10 灵敏度、准确度和精密度 灵敏度 本方法的检测限为0.1 g/L，定量限为0.3 g/L。准确度 本方法在0.3 g/L3 g/L添加浓度水平上的回收率为60%110%。精密度 本方法批内相对标准偏差15%，批间相对标准偏差20%。DB42/T 19922023 6 A A 附录A （资料性）7 种-受体激动类药物中英文通用名称、化学分子式和 CAS 号 7种-受体激动类药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号见表A.1。表A.1 7 种-受体激动类药物中英文通用名称、化学分子式和 CAS 号 化合物名称 英文通用名称 化学分子式 CAS 号 盐酸可乐定 Clonidine Hydrochloride C9H10Cl3N3 4205-91-8 溴莫尼定 Brimonidine C11H10BrN5 59803-98-4 盐酸替扎尼定 Tizanidine Hydrochloride C9H9CI2N5S 64461-82-1 胍法辛 Guanfacine C9H9Cl2N3O 29110-47-2 胍那苄 Guanabenz C8H8Cl2N4 5051-62-7 盐酸安普乐定 Apraclonidine Hydrochloride C9H10Cl2N4HCl 73128-79-8 赛拉嗪 Xylazine C12H16N2S 7361-61-7 DB42/T 19922023 7 B B 附录B （资料性）猪尿基质匹配 7 种-受体激动类药物标准溶液色谱图 猪尿基质匹配7种-受体激动类药物标准溶液色谱图见图B.1。图B.1 猪尿基质匹配 7 种-受体激动类药物标准溶液色谱图