基因综合项目工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用.doc

基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中应用一、 课程设计目 理解工业生产中新型育种技术并比较不同育种技术优势；学习理解基因工程育种技术及其操作原理；研究基因工程育种技术在人干扰素生产中创新。二、 课程设计题目描述与规定本文简介一种二十世纪七十年代发展起来一种新型生物技术基因工程，简介其在育种中应用。文中重点简介了基因工程育种普通环节，以及近年来浮现运用基因工程进行定向育种重要新技术：基因定点突变，易错PCR，DAN重排及基因组重排。之后，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b，通过优化补料分批培养时葡萄糖流加方略,提高了hIFNa2b表达量和表达速率。不同葡萄糖流加方式有各自长处,采用恒速流加葡萄糖方式,hIFNa2b表达量达到6 540 mg/L,高于当前已知文献中hIFNa2b最高表达量5 200 mg/L。三、课程设计报告内容引言基因工程是二十世纪七十年代发展起来一种新型生物技术，其发展从主线上变化了生物技术研究和开发应用模式。1972年美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学Cohen和Boyer等人在体外构建出具有四环素和链霉素连个抗性基因重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应抗生素抗性，由此宣布了基因工程诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果浮现及应用，基因工程带来了一场新革命。运用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身本来没有蛋白质。同样，运用重组DNA技术，也可以使某些本来存在量极低但有重要工业或医学用途小分子(抗生素)或蛋白质之外大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术完善和发展，以基因水平为核心当代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家关注，并展示了良好应用前景。1、基因工程育种基因工程育种是在基因水平上，运用人为办法将所需某一供体生物遗传物质提取出来，在离体条件下用恰当工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指引下一种自觉、能像工程同样可预先设计和控制育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前程一种育种新技术。基因工程技术所有过程普通涉及目基因DNA片段获得、DNA片段与基因载体体外连接、外源基因转入宿主细胞和目的基因表达等主要环节。1.1 基因工程育种普通环节是：(1)目基因获得：普通通过化学合成法、物理化学法(涉及密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序列富集(磁珠捕获)、产物导向法、Nod连接片段筛选法、外显子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相似序列克隆法、差别显示逆转录PCR法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等办法获得目基因。(2)载体选取：基因工程载体重要是质粒和病毒，载体普通为环状DNA，其规定有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。(3)重组子体外构建：重要办法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法。(4)重组载体导入受体细胞：其重要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、迅速冷冻法和炭化纤维介导法等。(5)重组体筛选和鉴定：以适当筛选办法选取具备最佳性能突变重组子，重组体筛选和鉴定重要通过表型法、DNA鉴定筛选法，选取性载体筛选法、分子杂交选取法、免疫学办法和mRNA翻译检测法等办法来实现。1.2 运用基因工程进行定向育种新技术12.1 基因定点突变定点突变(sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis)是指在目DNA片断(例如：一种基因)指定位点引入特定碱基对技术，其涉及寡核苷酸介导定点突变、盒式诱变以及以PCR为基本定点突变。近十年来，定点突变技术获得了长足发展，并且在此基本上又发展了诸多新技术。例如：重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR简称EOPCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重叠延伸PCR(OnestepOverlap Extension PCR，简称OOEPCR)、单管大引物PCR(Singletube Megaprimer PCR)、迅速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简朴和合用，并得到广泛应用。单管大引物PCR Picard等和HKe等分别建立了单管大引物PCR法。该法省去了老式上以PCR为基本定点突变中第1轮PCR产物纯化过程，实现了在同一管中先后进行2轮PCR反映定点突变目的。在上述2组研究者建立办法中，后者提出方案更加巧妙、简朴(图1)。其只需设计Tm值不同2个侧引物，在第1轮PCR反映中用Tm值低侧引物(F1)和诱变引物，在较低退火温度下进行扩增反映，产生大引物；然后再加入Tm值高侧引物(F2)，在较高退火温度下进行第2轮反映，扩增出含突变位点整个DNA产物。Ke等在此办法中还提出了2条更为细致、有效改进办法，使PCR产物最后产量和纯度均有所提高。这2条改进办法为：(1)在第1轮PCR反映中，诱变引物浓度仅为侧引物1，以减少诱变引物在第2轮PCR中干扰作用；(2)在第l轮PCR反映后，亦即第2轮PCR反映前，增长5个循环不对称扩增，这有助于提高其后扩增效率。这种单管大引物法长处是：实现了在同一管中先后进行2轮PCR反映，大幅简化了操作环节，并且省时、省力。在对各种样品进行操作时，该办法长处更为突出。在以PCR为基本诱变办法中，该法是引入单位点突变最简朴、最经济办法。图1 单管大引物PCR过程Figure 1 The process of Singletube megaprimer PCRTAMS定点诱变技术 ，Young等报道了一种有目地扩增突变链定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。该技术可以一次引入各种位点突变，并且可以有目地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100。该办法重要分3步(图2)：(1)线性单链DNA模板制备：通过线性PCR制备单链DNA模板；(2)突变链合成：该环节需用2个锚锭引物(即Anchor5和Anchor3)和各种诱变引物(Mut1和Mut2)。(3)有目地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3)，使其3端碱基分别与锚锭引物引入突变碱基配对，扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链。在多位点突变实验中，TAMS诱变技术应当是首选办法。定点突变技术已在蛋白质构造和功能改造上获得了很大成功。例如，运用定点突变变化酪氨酰-tRNA合成酶活性中心，从而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫键，明显提高了该酶稳定性。图2 TAMS定点诱变技术原理和操作过程Figure 2 The principle and operation process of TAMS12.2 易错PCRDNA聚合酶在进行扩增目DNA时会以一定频率发生碱基错配，这一现象正好提供了一种对特定基因进行随机诱变也许办法。运用PCR过程中浮现碱基错配进行特定基因随机诱变技术就称为易错PCR(Error_prone PCR，简称EPPCR)。此办法原理与操作如图3，其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化PCR反映体系中，运用Mn代替天然辅助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺少校对活性，同步使反映体系中各种dNTP比例失衡，因而导致碱基错配率大大增长，普通约为0.1。此外，还可以在该反映体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种办法可以将错配率最大提高至20。孔荣等运用易错PCR使D-海因酶对底物水解活性提高了2.4倍；黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L减少至7.717mmol/L，在pH8.0时稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。图3 易错PCR示意图Figure 3 Sketch of error-prone PCR12.3 DAN重排DNA重排(DNA shufling)技术是一种运用重组文库体外定向进化技术，Stemmer于1993年一方面提出。DNA重排基本原理是一方面将同源基因(单一基因突变体或基因家族)切成随机大小DAN片段，然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差别随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，通过多次PCR循环后能迅速产生大量重组DNA，从而创造出新基因。其操作原理和环节如图4。图4 DNA重排原理及操作环节Figure 4 The principle and operation process of DNA shufflingZhao等在此基本上创造了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)(图5)。此技术是在一种PCR反映体系中以2个以上有关DNA片段为模板进行PCR反映。引物先在一种模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循环中，那些某些延伸片段可以随机地与含不同突变模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组限度可以通过调节时间和温度来控制。此办法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排办法进一步简化。图5 交叉延伸程序基本过程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近几年来，提高DNA重排技术捕获变异能力始终是研究人员努力方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI对靶序列进行消化，创造了递减法建立杂交酶技术（ITCHY)，使得非同源性序列间也能发生重排，扩大了该技术用途。Hiraga等开发SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶辨认标记，用相应限制性内切酶代替DNase I产生重排片段。Bergquist等开发DOGS技术则是依照保守模体区序列特性设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此办法是在突变耐受保守区直接增长转辙组几率，因此其产生突变频率大大增长。DNA重排最大特点是在重复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要过程，并且其对可操作靶序列长度没有任何规定，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选取，可以使有益突变迅速积累，导致功能明显提高，同步还打破了老式物种之间由于生殖隔离导致不能重组界限。12.4 基因组重排基因组重排(genome shufling)技术是受DNA重排启发，于2l世纪浮现全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛范畴内对菌种目性状进行优化组合。一方面，运用典型诱变育种技术获得具有目的性状基因组库，然后运用原生质体融合技术将这些发生正向突变菌株全基因组进行多轮随机重组，从而迅速筛选表型得到较大改进杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)办法。Zhang等于初次报道应用基因组重排办法迅速地使弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生泰乐菌素能力得到提高。该办法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24 000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株，其泰乐菌素产量高于通过典型诱变育种办法所筛得生产菌株SF21，而后者(SF21)是用典型诱变育种办法在长达时间中先后筛选过约1 000 000个菌株后才获得。由此可见，此技术大大减少了工作量，并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所徐波等以产量性状为标记特性，应用基因组重排办法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3。除上述技术外，近年来又浮现了某些新技术，例如：某些基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、瞬时模板随机嵌合、单向引物随机重组、自我复制、体外随机引起重组(RPR)、酶法体外随机-定位诱变(randomsitedirected mutagenesis)、交错延伸剪接PCR等。2、基因工程育种技术在大肠杆菌种应用大肠杆菌是迄今为止研究最为详尽原核细菌，其K-12MG1655株4 000多kb染色体DNA已测序完毕，全基因共具有4 405个开放阅读框，其中大某些基因生物功能已被鉴定。作为一种成熟基因克隆表达受体，大肠杆菌被广泛用于分子生物学研究各个领域，如基因分离扩增、DNA序列分析、基因表达产物功能鉴定等。由于大肠杆菌繁殖迅速，培养代谢易于控制，大肠杆菌分子遗传学背景已相称明了，不断完善基因操作技术可将大肠杆菌构建成为用于异源蛋白生产分子工厂。因而，运用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌，以规模化生产真核生物基因特别是人类基因表达产物，具备重大经济价值。当前已有100各种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程菌实现了产业化，其中涉及某些构造相称复杂人体蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工业中惯用于生产医药蛋白如人胰岛素、人生长激素、人干扰素、人白细胞介素和抗体。如下以生产人干扰素为例简介其应用。人干扰素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165个氨基酸构成多肽,具备抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、修复DNA构造损伤等作用。hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等均具备治疗作用。大肠杆菌表达系统具备生长迅速、发酵成本低、表达水平高等长处,是生产外源蛋白抱负表达体系。在大肠杆菌温度诱导表达外源蛋白发酵过程中,如何控制升温诱导后菌体生长,提高产物比生产速率,是实现高密度高表达核心。本文采用大肠杆菌BL21(pBAI)表达hIFNa2b,其表达通过温控型PL启动子调控。考察了补料方式对hIFNa2b生产速率影响,hIFNa2b表达水平达到6 540 mg/L。2.1 材料与办法2.1.1材料菌株宿主菌E. coli BL21(DE3)BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) gal(DE3),重组质粒为pBAI,带有氨苄青霉素耐药性标记,hIFNa2b基因表达受PL启动子和质粒cI857编码蛋白调控。培养基种子培养基为LB培养基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠。分批发酵培养基为含葡萄糖5 g/LLB培养基。未特别注明补料分批发酵培养基均为含葡萄糖5 g/L2LB培养基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),补料液为400 g/L葡萄糖。培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均为Oxoid产品,别的试剂为国产分析纯,采用去离子水配制。2.1.2培养办法种子培养从-20C保藏甘油管中取出1ml菌液,接入装有30 ml种子培养基250mL锥形瓶,于摇床200 r/min,30C下培养10 h,为一级种子;将一级种子以1.5%接种量转接至装有70 ml LB培养基500 ml锥形瓶中,相似条件培养9 h,为二级种子。发酵罐培养将二级种子以6%接种量接入5 L发酵罐(RIBE-5型)中。培养液装量为2.5 L，生长阶段控制温度30C,表达阶段控制温度42C，发酵过程中控制pH为7.0,通气量4 L/min，初始搅拌转速为400 r/min,发酵过程中转速逐渐提高以维持溶氧不不大于20%。补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽后采用3种不同葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率流加。恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(Lh)速率流加葡萄糖；恒比供应速率(QG)为0.27 g/(gh)，每小时依照菌体浓度调节葡萄糖流加速率。2.1.3测定办法菌体浓度测定采用浊度法,测定波长600 nm处光密度(OD600),依照原则曲线计算菌体干重。葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定。乙酸测定采用气相色谱法5。hIFNa2b电泳测定采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(=0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三层胶系统分离目蛋白6,凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分析系统(Smart View analysis program,上海复日科技有限公司)定量。取发酵液于12 000 r/min,4C下离心10 min,得到菌体用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 7.0,4C)洗涤,然后溶于上样缓冲液中12mmol/L、pH 6.8 Tris-HCl,甘油(=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇(=0.02),溴酚兰(0.5 g/L。2.2成果与讨论2.2.1分批发酵在5 L罐中分批培养,成果见图6和表1。培养2.5 h升温诱导,此时菌体处在对数生长期,升温对于菌体生长影响并不明显,表达初期菌体比生长速率较升温前略有下降。分批发酵中葡萄糖耗完时,乙酸积累达到最大值1.1 g/L。hIFNa2b表达水平达到749 mg/L,是相似培养基条件下摇瓶培养2.9倍。诱导后1 h,hIFNa2b比生产速率为162 mg/(gh),生产速率为275 mg/(Lh)；诱导后期比生产速率下降至95 mg/(gh),但由于菌体浓度增大,生产速率达到363 mg/(Lh)。图6分批培养时菌体()、葡萄糖()、乙酸()及hIFNa2b()变化曲线Fig.6Profiles of dry cell weight ()，residual glucose()，acetic acid () and hIFNa2b () in batch cultivation2.2.2 葡萄糖流加对于hIFNa2b生产水平影响要获得hIFNa2b高体积表达水平,则需维持较高比生产速率,并且增大菌体密度,流加葡萄糖是一种较好选取。恒pH流加葡萄糖培养4 h后升温诱导表达hIFNa2b,此时残糖浓度为0.9 g/L。6 h时初始葡萄糖耗尽,溶氧迅速回升,开始用恒pH法补加葡萄糖,即pH高于设定值时蠕动泵自动加入葡萄糖溶液1 s。此补料分批发酵实验记为FB1,成果见图7和表1。升温诱导后,菌体生长明显减慢,升温后2 h菌体比生长速率为0.425 h-1,与升温前0.710 h-1相差很大,这与诱导时环境和细胞生理状态关于。与分批发酵相比较,升温诱导时(2.5 h)菌体处在对数生长前期,培养基中营养物质充分,而本实验中于4 h升温诱导时菌体处在对数生长后期,培养基中营养物质已经被大量消耗,难以维持对数期比生长速率。进入恒pH补料阶段后,菌体比生长速率下降趋势进一步明显,发酵末期菌体比生长速率仅为0.025 h-1。图7恒pH补料分批培养(FB1)中菌体()、葡萄糖()、乙酸()及hIFNa2b()变化曲线Fig.7Profiles of dry cell weight ()，residual glucose(),acetic acid () and hIFNa2b () in pH-statfed-batch cultivation (FB1)hIFNa2b表达量在11.5 h达到2 400 mg/L,是分批发酵3. 2倍。诱导初期2 h内,hIFNa2b比生产速率为148 mg/(gh),生产速率高达730 mg/(Lh)。后期hIFNa2b表达速率明显减慢,发酵末期仅为10 mg/(gh)。在恒pH补料分批培养中,能较好地控制葡萄糖流加,使得发酵后期没有乙酸积累。但是恒pH流加方式下葡萄糖流加是基于有机氮源异化代谢引起pH上升,随着培养基氮源如氨基酸逐渐消耗,减少了氨离子产生,从而不易引起发酵液pH上升,导致葡萄糖补加速率减少,使得培养过程中特别是发酵后期葡萄糖供应局限性。如图8所示,培养过程中葡萄糖流加速率rG从2.83 g/h下降到1.99g/h,葡萄糖比消耗速率QG从0.115 g/(gh)下降到0.087 g/(gh),限制了hIFNa2b表达。与分批培养相比,虽然hIFNa2b比生产速率有所下降,但总产量和菌体hIFNa2b含量大幅提高,阐明菌体浓度升高有助于提高hIFNa2b表达水平,恒pH流加是一种操作以便流加方式。图8恒pH补料分批培养(FB1)中葡萄糖浓度()、葡萄糖流加速率()及葡萄糖比消耗速率()变化曲线Fig.8Profiles of residual glucose()，feeding rate of glu-cose () and specific consumption rate of glucose() in pH-stat fed-batch cultivation (FB1)恒速补料实验中hIFNa2b平均生产速率是恒pH补料时1.65倍,表白葡萄糖供应改进提高了hIFNa2b表达水平,尽管葡萄糖比消耗速率还是从诱导初期0.28 g/(gh)下降到0.21g/(gh)。由于盼望达到较高菌体密度,因此生长期较长。诱导前培养基中营养物质消耗较多,8.5h时菌体比生长速率已经减少到0.203 h-1,升温诱导后1 h,比生长速率更减少至0.074 h-1,营养消耗导致hIFNa2b比生产速率仅27 mg/(gh),大大低于恒pH补料分批培养实验FB1。通过恒速补糖方式获得了hIFNa2b非常高表达量,但这是通过延长发酵时间和提高菌体浓度实现,过低比生产速率大大影响发酵生产效率。2.3诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平影响许多基因工程菌外源基因表达显示出与生长速率有关特性,而补料分批培养中,随着菌体浓度提高,诱导初期比生长速率明显下降,反映了营养限制。因而在诱导前1.5 h补充有机氮源(酵母提取物25 g),以满足菌体生长和产物合成需要。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供应速率(0.27 g/(gh)方式补充葡萄糖,发酵过程记为FB3,成果见图9和表1。图9补料分批培养FB3中菌体()、葡萄糖()、乙酸()及hIFNa2b()变化曲线Fig.9Profiles of dry cell weight ()，residual glucose()，acetic acid () and hIFNa2b () in fed-batch cultivation FB3 (yeast extract was added at6.5 h)采用恒比供应速率流加方式,葡萄糖流速依照菌体总量变化而变化,可以较好地满足细胞代谢及重组蛋白表达所需能量需求,同步也避免了乙酸和残糖积累,平均比生产速率为恒速流加时2倍。可以看出,加入酵母抽提物,满足了菌体生长需要,使得诱导先后均有较高比生长速率,表达期平均比生长速率达到0.106 h-1。升温诱导5.5 h后,hIFNa2b表达量即达到5530mg/L,hIFNa2b最大比生产速率为124 mg/(gh),hIFNa2b平均生产速率大幅提高,达1 006 mg/(Lh)。分批发酵和不同补料分批发酵实验成果归纳于表1。可以看出FB3添加酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有助于外源基因转录和翻译,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b对于有机氮源得率最高,是FB21.27倍,并且发酵周期仅13.5h,较FB220. 5 h大大缩短了时间,提高了hIFNa2b生产速率,一次性添加有机氮源操作也比较便捷,在生产上有一定应用价值。1) DCW at the beginning of inductionb；2) DCW at the end of culture3) During 1 h post induction；4) Overall productivity of hIFNa2b；5) Overall specific productivity of hIFNa2b；6) HIFNa2b yield based on total complex nitrogen sources；7) Specific hIFNa2b production3结论当前hIFN2b在临床应用广泛,需求量大,但由于生产水平限制,价格仍旧较高。本文通过优化补料分批培养时葡萄糖流加方略,提高了hIFNa2b表达量和表达速率。分批培养时乙酸积累,对hIFNa2b表达有一定抑制作用,流加葡萄糖方略使得表达期无乙酸积累,提高了hIFNa2b表达水平。不同葡萄糖流加方式有各自长处,采用恒速流加葡萄糖方式,hIFNa2b表达量达到6 540 mg/L,高于当前已知文献中hIFNa2b最高表达量5 200 mg/L。恒比供应速率流加葡萄糖并在诱导前添加酵母抽提物,虽然总表达量5 530 mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生产速率高达1 006 mg/(Lh),是分批培养时3.08倍,是恒速流加方式时1.84倍,并且对有机氮源得率提高到138 mg/g,大大缩短了发酵时间,为该表达系统实际应用创造了条件。参照文献：1 张惠展.基因工程.上海：华东理工大学出版社,82 朱筠,李志敏,张倩,甘人宝,叶勤.重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b.华东理工大学学报,3(2):184-1883 聂明,李怀波,万佳蓉,周传云.工业微生物遗传育种研究进展.当代食品科技，,21(3):184-1874 王参军,邹文艺,张玲,范清林,宋礼华. 突变人干扰素-2b基因5端提高其在大肠杆菌中表达.安徽医科大学学报,45(2):149-1535 代云见,王明蓉,杜天飞.微生物基因工程育种技术研究进展.药研动态(国外医药抗生素分册),29(5):193-2006 王海波,申烨华,秦芳玲等.大肠杆菌生产重组人干扰素-培养基研究.西北大学学报(自然科学版),33(2):174-1787 邹钟诚,侯剑英,王增学,苏冬梅.大肠杆菌发酵重组人干扰素-2a高密度、高表达.微生物学杂志,1999,19(1):24-268 周鸣南,方深高,陶征宇,何丽敏.人a2b型干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达提高.中华人民共和国医药工业杂志,1995,26(4):152-1559 党建章,郑雄敏,李飞.PVA包埋产延胡索酸酶黄色短杆菌固定化研究.南昌大学学报,1995,19(4):380-384