基于遗传毒性谈5-羟甲基糠醛在含糖口服溶液剂中的风险控制研究.pdf

36中国处方药 第 21 卷 第 9 期实验研究Biomed Pharmacother，2016，77：108-113.16 李国春，黄新武.氯沙坦在国内应用研究进展 J.中国药师，2005，8（11）：952-954.17 Gorin Y，Ricono JM，Wagner B，et al.Angiotensin II-induced ERK1/ERK2 activation and protein synthesis are redox-dependent in glomerular mesangial cellsJ.Biochem J，2004，381（Pt 1）：231-239.18 Iturralde M，Gamen S，Pardo J，et al.Saturated free fatty acid release and intracellular ceramide generation during apoptosis induction are closely related processesJ.Biochim Biophys Acta，2003，1634（1-2）：40-51.19 Wang WZ，Pang L，Palade P.Angiotensin II causes endothelial-dependent increase in expression of Ca（V）1.2 protein in cultured arteriesJ.Eur J Pharmacol，2008，599（1-3）：117-120.遗传毒性杂质研究是药品标准修订以及上市药品安全性再评估的重点研究方向，近年来 N-亚硝胺类药品杂质超限事件引发社会热议，药品质量问题再次受到公众广泛关注。欧洲药品管理局（EMA）、美国食品药品管理局（FDA）等先后颁布了遗传毒性杂质控制的指导原则；国际人用药品注册技术协调会（ICH）2014 年发布了 M7（遗传毒性杂质）指导原则；中华人民共和国药典 2020 年版四部中收载“9306 遗传毒性杂质控制指导原则”，用于指导药物遗传毒性杂质的危害评估、分类和限值制定1。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF），又名 5-羟甲基-2 糠醛，是一种五碳环芳香醛，其分子结构由 1 个呋喃环、1 个醛基和 1 个羟甲基组成，是葡萄糖、果糖等单糖在高温、酸性或微生物作用下经过美拉德反应或焦糖化反应脱水生成的小分子化合物2，广泛存在于含糖类成分高的药品（如含葡萄糖的注射液）、中药材（如熟地黄）、食品（如干果、蜂蜜）中。5-HMF 稳定性差，具有吸湿性，对光和空气敏感，容易分解成乙酰丙酸和甲酸或发生聚合反应。基于遗传毒性谈 5-羟甲基糠醛在含糖口服溶液剂中的风险控制研究伍良涌，周远华，赵雪梅，李玮玲，董顺玲（广州市药品检验所，广州 510160）【摘要】目的 根据 5-羟甲基糠醛的遗传毒性评价，提出其在含糖口服溶液剂中控制的必要性。方法 建立 5-羟甲基糠醛通用的高效液相色谱检测方法，选取部分含糖口服溶液剂检测其中 5-羟甲基糠醛的含量；根据药物临床用量计算 5-羟甲基糠醛的暴露量，并按照遗传毒性杂质相关指导原则的要求对其标准限度进行评估。结果 选取的含糖口服液体制剂中大部分检出 5-羟甲基糠醛，且部分含量超出了拟定限度，存在安全隐患。结论 5-羟甲基糠醛为 2 类遗传毒性杂质，建议含糖口服液体制剂的标准中应考虑建立 5-羟甲基糠醛检查项，为生产企业改进工艺提供参考。【关键词】高效液相色谱法；含糖口服液体剂；5-羟甲基糠醛；遗传毒性杂质；风险控制Study on risk control of 5-hydroxymethyl furfural in sugar-containing oral solution drugs based on its genotoxicityWU Liang-yong，ZHOU Yuan-hua，ZHAO Xue-mei，et al.Guangzhou Institute for Drug Control，Guangzhou 510160，China.【Abstract】Objective According to assess the genotoxicity of 5-hydroxymethyl furfural，to discuss the necessity of controlling 5-hydroxymethyl furfural in sugar-containing oral solution drugs.Methods A general HPLC method was established to determine the content of 5-hydroxymethyl furfural，and some sugar-containing oral solution drugs were selected to detect the content.The potential exposure of 5-hydroxymethyl furfural was calculated based on the dosages of drugs.Then the limit of 5-hydroxymethyl furfural was evaluated according to guidelines for genotoxic impurities.Results Most selected sugar containing oral solution drugs were detected 5-hydroxymethyl furfural，and some of them exceeded the proposed limits，that indicated too high to ensure the drugs safety.Conclusion 5-hydroxymethyl furfural is a class 2 genotoxic impurityIt is suggested that consideration of the determination of 5-hydroxymethyl furfural in the quality standard of sugar containing oral solution drugs.The established analytical method can be used to provide reference for the quality control of sugar containing oral solution drugs and the improvement of production process.【Key words】HPLC；Sugar-containing oral solution drugs；5-hydroxymethyl furfural；Genotoxic impurity；Risk control基金项目：广州市市场监督管理局科技项目资助 （2022kj31）37Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9实验研究文献报道 5-HMF 具有毒性作用，可能引起血栓性静脉炎，引发和促进结肠小囊异常生长，促进皮肤癌变，对人体横纹肌和内脏有损害，具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生蓄积中毒，还有遗传毒性和致突变性3。为了安全起见，有必要尽可能降低含糖口服溶液剂中 5-HMF 的含量，提高临床用药的安全性。本文汇总分析了 中华人民共和国药典 2020 年版4-5中收载 5-HMF 作为杂质的药品标准，对其检测方法及限度进行了分析，并结合文献6-16报道的检测方法优化建立了 5-HMF 通用检测方法，选取市售布洛芬混悬液、盐酸氨溴索口服溶液、葡萄糖酸钙锌口服溶液等品种测定 5-HMF的量。结合遗传毒性杂质评价和控制的要求探讨设置检查限度，提示药品生产企业和监管部门应关注 5-HMF 超限风险。1 中国药典收载品种及方法分析在 中国药典 2020 年版一部收载的蜂蜜品种3设置了 5-羟甲基糠醛检查项；二部收载的葡萄糖注射液、己酮可可碱葡萄糖注射液、右旋糖酐 20/40/70 葡萄糖注射液等含葡萄糖的注射液等 16 个品种4均设置 5-羟甲基糠醛检查项，其检测方法主要为紫外分光光度法和高效液相色谱法，但尚有含糖制剂如复方葡萄糖酸钙口服溶、葡萄糖酸钙注射液、口服补液盐散（I）等未设置 5-羟甲基糠醛检查，见表 1。2 检测方法及样品测定结果2.1 仪器 1260 型高效液相色谱仪，配置四元泵、柱温箱、二极管阵列检测器、自动进样器（美国 Agilent 公司）；XPE56型电子天平（瑞士 METTLER TOLEDO 公司）；S20K 酸度计（瑞士 METTLER TOLEDO 公司）。2.2 药品与试剂5-HMF 对照品（中国食品药品检定研究院，批号111626-202114，含量 98.7%）；布洛芬混悬液（企业 A，批号 13100861；企业 B，批号 H64455；企业 C，批号 130609；企业 D，批号 50120041；企业 E，批号 200313；企业 F，批号 190107016；企业 G，批号 20101225；企业 H，批号20130802）、盐酸氨溴索口服溶液（企业 I，批号 2002212；企业 G，批号 2101021J；企业 K，批号 132210903；企业 L，批号 6210303；企业 M，批号 21H012）、葡萄糖酸钙锌口服溶液（企业 N，批号 19092032、20141117、21121125；企业 O，批号 2108151-B003、2005081-D009；企业 P，批号191025 132；企业 G，批号 20200305）；甲醇（色谱纯试剂）；纯化水。2.3 色谱条件色谱柱：Ecosil C18（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相：甲醇-水，梯度洗脱（0 6 min，20%B；6 6.01 min，20%B 80%B；6.0120 min，80%B85%B；2020.01 min，85%B 20%B；20.01 25 min，20%B）；流速为每分钟 1.0 ml；检测波长284 nm；进样体积 20 l。2.4 溶液的配制2.4.1 对照品溶液 取 5-HMF 对照品适量，精密称定，加溶剂（20%甲醇）溶解并定量稀释制成每 1 ml 中约含 10 g 的溶液，作为对照品溶液。2.4.2 供试品溶液 取样品（布洛芬混悬液）1.0 g，精密称定，置 10 ml 量瓶中，加甲醇适量振摇 10 min，用甲醇稀释至刻度，离心，精密量取上清液 2 ml，置 10 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用 0.45 m 滤膜过滤，即得。精密量取样品（盐酸氨溴索口服溶液、葡萄糖酸钙锌口服溶液）1 ml，置 10 ml 量瓶中，加甲醇适量振摇 10 min，加甲醇稀释至刻度，离心，表 1 中国药典收载品种情况序号中国药典 2020 年版一部/二部收载品种5-羟甲基糠醛检测方法限度1蜂蜜HPLC不得过 0.004%2己酮可可碱葡萄糖注射液 按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.02%，10 g/ml（规格葡萄糖 5.0%）3甲硝唑葡萄糖注射液 按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.02%，10 g/ml（规格葡萄糖 5.0%）4肌酐葡萄糖注射液 按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.02%，10 g/ml（规格葡萄糖 5.0%）5米力农注射液（处方中含有葡萄糖的产品）按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.02%6阿昔洛韦葡萄糖注射液按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.03%，15 g/ml（规格葡萄糖 5.0%）7胞磷胆碱钠葡萄糖注射液按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.024%，12 g/ml（规格葡萄糖 5.0%）8替硝唑葡萄糖注射液按外标法计算，不得过葡萄糖标示量的 0.02%，10 g/ml（规格葡萄糖 5.0%）9右旋糖酐 20/40/70 葡萄糖注射液UV吸光度不得大于 0.32（规格葡萄糖 5.0%）10利巴韦林片葡萄糖注射液吸光度不得大于 0.25（规格葡萄糖 5.0%）11单硝酸异山梨酯葡萄糖注射液吸光度不得大于 0.32（规格葡萄糖 5.0%）12复方乳酸钠葡萄糖注射液 吸光度不得大于 0.2513硝酸异山梨酯葡萄糖注射液 吸光度不得大于 0.32（规格葡萄糖 5.0%）14葡萄糖注射液吸光度不得大于 0.3215葡萄糖氯化钠注射液吸光度不得大于 0.2516氯化钾葡萄糖注射液吸光度不得大于 0.25（规格葡萄糖 5.0%）38中国处方药 第 21 卷 第 9 期实验研究精密量取上清液 2 ml，置 10 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用 0.45 m 滤膜过滤，即得。2.4.3 空白溶液 以溶剂（20%甲醇）作为空白溶液。2.4.4 专属性考察 取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图 1A。结果表明，辅料和杂质均未对 5-HMF 的测定产生干扰，5-HMF色谱峰的适量理论塔板数大于 3 000，方法专属性良好。2.5 进样精密度试验取对照品溶液连续测定，记录色谱图，5-HMF 峰面积的RSD 0.1%（n 6），表明仪器精密度良好。2.6 线性试验 取 5-HMF 对照品适量，精密称定，加溶剂（20%甲醇）溶解并定量稀释制成每 1 ml 中约含 100 g 的溶液；取上述溶液稀释，配制浓度为 0.052 13 104.262 6 g/ml 的系列5-HMF溶液，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线图，计算回归方程：Y132 627X29 985，r0.999 9（n 9）。结果表明，5-HMF 在 0.052 13 104.262 6 g/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.7 稳定性试验 取布洛芬混悬液、盐酸氨溴索口服溶液、葡萄糖酸钙锌口服溶液供试品溶液，分别在 0、18、20 和 24 h 测定含量。布洛芬混悬液企业 A 批号 13100861 含量均值 96.81 g/ml，RSD 0.3%；盐酸氨溴索口服溶液企业 I 批号 2002212 含量均值 22.70 g/ml，RSD 1.0%；葡萄糖酸钙锌口服溶液企业 N 批号 19092032 含量均值 0.7049 g/ml，RSD0.1%。结果表明 5-HMF 溶液在 24 h 内基本稳定。2.8 检测限和定量限 取对照品溶液加溶剂逐步稀释进样，记录色谱图，按信噪比 31 计算，5-HMF 的检测限为 0.029 ng；按信噪比101 计算，5-HMF 的定量限为 0.097 ng。2.9 回收率试验 精密量取同一批已测含量的布洛芬混悬液、盐酸氨溴索口服溶液、葡萄糖酸钙锌口服溶液供试品各 6 份，每份 1 ml，置 10 ml 量瓶中，分别精密加入对照品溶液液适量，按“2.2.2”方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进样，测定其峰面积，按外标法计算回收率和RSD，结果布洛芬混悬液（企业 A 批号 13100861）回收率 100.35%，RSD 0.9%（n 6）；盐酸氨溴索口服溶液（企业 I 批号 2002212）回收率 98.77%，RSD 0.1%（n 6）；葡萄糖酸钙锌口服溶液（企业 N 批号 21121125）回收率100.14%，RSD 0.3%（n 6）。2.10 样品测定结果 20 批样品测定结果见表 2。3 讨论本次实验参考了 中国药典 2020 年版二部甲硝唑葡萄糖注射液中 5-HMF 的检查方法，检测波长为 284 nm，由于实验样品为混悬液或口服溶液，会有辅料的干扰，通过比较不同的流动相系统，最终确认以甲醇与水进行梯度ABCDE图 1 高效液相色谱图注：A：对照品溶液，B：布洛芬混悬液供试品溶液（企业 A），C：盐酸氨溴索口服溶液供试品溶液（企业 I），D：葡萄糖酸钙锌口服溶液供试品溶液（企业 N），E：空白溶液；1：5-HMF39Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9实验研究洗脱，能有效地分离其他辅料峰，准确测定 5-HMF。根据表 1，我国药典对用到葡萄糖等单糖的制剂进行了 5-HMF 的限度控制，对蜂蜜及某些含蜂蜜制剂也进行5-HMF 的限度控制，可见 5-HMF 的控制是重要的质量指标。因此，研制以葡萄糖为载体的注射剂均应制定 5-HMF的限度；研制以葡萄糖为主要原、辅料，且制备工艺中有酸性溶液环境及较长时间高温过程的口服制剂时，建议进行产品中 5-HMF 的含量考察。根据本次实验选择三个品种的处方分析，其中均有加入辅料蔗糖作为调味剂，但蔗糖在酸性条件下会产生 5-HMF，提示含糖口服溶液药品中其生产企业应重点关注其产品中 5-HMF 的量，应在内控质量标准中增加 5-HMF 检查项。5-HMF 属 2 类遗传毒性杂质，限度的制订可分以下几种情况：根据欧盟食品安全委员会以修正理论加权最大日摄入量法为基础进行研究，认为每人每天摄入5-HMF 的上限为 1.6 mg。针对欧盟食品安全委员会以修正理论加权最大日摄入量法按照布洛芬混悬液每日服用40 ml 计算，限值为 40 g/ml；按照盐酸氨溴索口服溶液及葡萄糖酸钙锌口服溶液每日服用 30 ml 计算，限值为 50 g/ml；如限度的制定按照遗传毒性杂质要求进行，最理想的限度 5-HMF 日暴露量为 1.5 g3，控制指标过于严格会导致增加生产成本和生产工艺的难度；口服溶液剂如参考蜂蜜中 5-HMF 日暴露量 1.2 mg，折算限度布洛芬混悬液为 30 g/ml；盐酸氨溴索口服溶液及葡萄糖酸钙锌口服溶液为 40 g/ml。本次实验选择三品种按通用检测方法测定 5-HMF的量，布洛芬混悬液样品中出现超出拟定限度情况，如采用更严格限度则会有更多产品中 5-HMF 超限，提示企业应关注其产品生产工艺，在相应质量标准中应考虑增加5-HMF 检查项。参考文献1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典，四部 S.北京：中国医药科技出版社，2020：527.2 赵玲，周臣清，朱婉清，等.5-羟甲基糠醛的生物安全性和生物活性研究进展 J.食品工业科技，2016，37（11）：372.3 祝清芬，魏霞，王维剑，等.基于杂质遗传毒性谈药物中 5-羟甲基糠醛的质量控制 J.药物分析杂志，2018，38（3）：485-489.4 国家药典委员会编.中华人民共和国药典，一部 S.北京：中国医药科技出版社，2020：374.5 国家药典委员会编.中华人民共和国药典，二部 S.北京：中国医药科技出版社，2020：57-1633.6 李玲，王秋实.葡萄糖酸锌口服溶液中 5-羟甲基糠醛的限量检查 J.中国药业，2020，29（11）：65-67.7 林义忠，周华琼.口服补液盐散（）中 5-羟甲基糠醛的HPLC 法限量检查 J.化工管理，2018，（36）：124-125.8 刘毅，吴建敏，姚晓，等.盐酸溴己新葡萄糖注射液的 5-羟甲基糠醛检查方法研究 J.中国新药杂志，2018，27（22）：2612-2615.9 聂黎行，程显隆，戴忠，等.UPLC 法快速测定生脉注射液及其中间体中 5-羟甲基糠醛含量 J.时珍国医国药，2018，29（9）：2086-2089.10 齐雷，高婕，曲荣广.缩合葡萄糖氯化钠注射液质量标准研究-HPLC 法测定缩合葡萄糖氯化钠注射液中 5-羟甲基糠醛J.中国伤残医学，2013，21（12）：60-61.11 李小华.维生素 C 葡萄糖注射液中 5-羟甲基糠醛限量检查的研究 J.四川医学，2005，26（10）：1166-1167.12 汪祺，谢黔峰，刘丽娜，等.六味地黄丸（大蜜丸）中蜂蜜辅料的质量考察（2）糖转化产物 5-羟甲基糠醛的测定 J.药物分析杂志，2010，30（12）：2349-2351.13 岳志华，张娜，李慧义.盐酸多巴酚丁胺葡萄糖注射液含量测定和 5-羟甲基糠醛等有关物质检查方法的建立 J.中国药学杂志，2008，43（21）：1661-1664.14 张玉荣，王瑞忠，鲁静.药用蜂蜜中 5-羟甲基糠醛的限量检查方法研究 J.药物分析杂志，2018，38（2）：326-330.15 杨杨，刘永成，姜连阁.HPLC 法测定盐酸丁丙诺啡注射液中 5-羟甲基糠醛 J.黑龙江医药，2009，22（3）：242-245.16 王发，王嫦鹤，张秉华，等.HPLC 法检查右旋糖酐 40 氯化钠注射液中 5-羟甲基糠醛的限量 J.西北药学杂志，2011，26（6）：410-411.表 2 含量测定结果品名生产企业批号5-羟甲基糠醛（g/ml）布洛芬混悬液A1310086198.47BH6445538.52C1306091.33D501200414.20E2003130.97F1901070164.32G2010122553.19H2013080249.13盐酸氨溴索口服溶液I200221222.59G2101021J0.23K1322109030.94L62103030.10M21H012小于检出限葡萄糖酸钙锌口服溶液N190920320.71201411170.37211211250.33O2108151-B003小于检出限2005081-D009小于检出限P191025 1320.54G202003050.03