基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制.pdf

罗慧英，吴步梅，马天玥，等.基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制 J.食品工业科技，2023，44（23）：1120.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010103LUOHuiying,WUBumei,MATianyue,etal.BasedonNetworkPharmacologyandMolecularDockingtoDiscusstheMechanismofAntitussiveandExpectorantActionofRuanerliJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(23):1120.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010103 未来食品 基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制止咳化痰作用机制罗慧英1,2，吴步梅3，马天玥4，张文利3，方彩霞3，魏永波5，陈辅斌6（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃兰州730000；3.兰州市农业科技研究推广中心，甘肃兰州730000；4.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京211198；5.皋兰百璐通瓜果专业合作社，甘肃兰州730200；6.什川镇农业农村综合服务中心，甘肃兰州730200）摘要：采用网络药理学方法预测软儿梨止咳化痰作用及其机制，并采用分子对接和动物实验对预测结果予以验证。通过文献调研和 TCMSP 等数据库筛选得到软儿梨的成分与作用靶点，与 GeneCards 数据库中“咳嗽（cough）”和“痰（sputum）”相关的两组基因相映射，得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。通过 Metascape 平台对靶点基因进行 GO 和 KEGG 富集分析；通过 STRING 数据平台构建靶点基因间 PPI 网络；利用 Cytoscape 插件 CytoHubba 筛选软儿梨止咳化痰作用 Top10 基因，并通过 Metascape 数据平台对 Top10 基因进行 KEGG 通路富集以预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。通过 AutodockVina 对预测所得 Top10 基因蛋白和软儿梨Top3 活性成分进行分子对接；最后通过氨水引咳试验和酚红排泄试验对预测所得结果进行验证。经多数据库联合分析，发现软儿梨中已见报道的化学成分有 51 个，对应作用靶点 282 个，其中 80 个与止咳化痰作用有关，根据Degree 值筛选出的 Top10 基因主要富集在与感染和免疫相关通路上。分子对接试验证明 Top10 基因与 PPI 网络中排名前 3 位的化学成分（咖啡酸、芦丁、戊醛）有较强的结合活性。动物实验证明软儿梨可以明显抑制小鼠氨水引发的咳嗽反应，降低血清中 IL-6 和 IL-13 水平，增加小鼠气管酚红的排泄量。PCR 和 WB 检测发现，软儿梨可降低炎症相关基因 IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 的 mRNA 水平和蛋白表达，软儿梨的止咳化痰作用可能与降低炎性基因表达，减少致炎因子释放有关。关键词：网络药理学，分子对接，软儿梨，止咳化痰，炎症因子本文网刊:中图分类号：R151.2文献标识码：A文章编号：10020306（2023）23001110DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023010103BasedonNetworkPharmacologyandMolecularDockingtoDiscusstheMechanismofAntitussiveandExpectorantActionofRuanerliLUOHuiying1,2，WUBumei3，MATianyue4，ZHANGWenli3，FANGCaixia3，WEIYongbo5，CHENFubin6（1.CollegeofPharmacy,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China；2.KeyLaboratoryofPharmacologyandToxicologyforTraditionalChineseMedicineofGansuProvince,Lanzhou730000,China；3.LanzhouAgrotechnicalResearchandPopularizationCenter,Lanzhou730000,China；4.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China；5.BailutongMelonandFruitFarmerCooperatives,Lanzhou730200,China；收稿日期：20230116基金项目：甘肃省农业农村厅资助项目（20221809RB）。作者简介：罗慧英（1979），女，博士，教授，研究方向：中药药效与物质基础研究，E-mail：。第44卷第23期食品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.20236.ShichuanAgricultureandRuralComprehensiveServiceCenter,Lanzhou730200,China）Abstract：TheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerlianditsmechanismwereinvestigatedbymethodsofnetworkpharmacology.Theoutcomespredictedwereverifiedbymoleculardockingandanimalexperiments.ThecomponentsandtargetsofRuanerliwereobtainedbyliteratureinvestigationandTCMSPdatabasescreen.MappingwithtwogroupsofgenesrelatedtocoughandsputumfromGeneCardsdatabase,thetargetgenesofantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerliwereobtained.GOandKEGGenrichmentanalysisofthetargetgeneswasperformedbyMetascapeplatform.ThePPInetworkamongthetargetgeneswasconstructedthroughSTRINGdataplatform.CytoscapepluginCytoHubbawasusedtoscreentheTop10genesrelatedtoantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli,andKEGGpathwayenrichmentwasperformedontheTop10genesthroughMetascapedataplatformtopredictthepossiblesignalpathwaysinvolvedinantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli.AutodockVinawasusedformoleculardockingbetweenthepredictedTop10geneproteinsandtheTop3activeingredientsofRuanerli.Finally,thepredictedresultswereverifiedbyammoniainducedcoughtestandphenolredexcretiontest.Accordingtotheanalysisofmultipledatabases,51chemicalcomponentsand282correspondingtargetshavebeenreported,eightyofthemwererelatedtotheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli.TheTop10genesselectedbyDegreevalueweremainlyconcentratedininfectionandimmune-relatedpathways.MoleculardockingtestshowedthattheTop10geneshadstrongbindingactivitywiththeTop3chemicalcomponents(Caffeicacid,RutinandValeraldehyde)inPPInetwork.AnimalexperimentsshowedthatthecoughinducedbyammoniawassignificantlyinhibitedwhentreatedwithRuanerliinmice.ThelevelsofIL-6andIL-13inserumwerereducedandtheexcretionofphenolredinmicetracheawasincreased.PCRandWBdetectionshowedthatthemRNAlevelsandproteinexpressionsofinflammatorygenesIL6,IL1B,VEGFA,PTGS2andMAPK3weredecreased,suggestingthattheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerlimightberelatedtodecreasingtheexpressionofinflammatorygenesandthereleaseofinflammatoryfactors.Keywords：networkpharmacology；moleculardocking；Ruanerli；antitussiveandexpectoranteffects；inflammatoryfactor软儿梨（Pyrus ussuriensisMaxim.）也叫冻梨、香水梨，是兰州特色水果。食用方法独特，具有后熟发酵及冻食特性。每年深秋采摘，新鲜果品口味欠佳，果肉硬而味酸，冷冻贮藏 40 多天后，果皮变黑，果肉发酵软化，其品质不因褐变而受到影响，果糖含量增加，此时食用梨软如泥，浆液充盈，味甜似蜜，是中国地方梨品种中的一个特色品种。2015 年被农业部批准为“全国农产品地理标志”。兰州年产软儿梨 3 万多吨，但是由于技术原因，除直接食用和简单加工后制成果汁、果酒外，未见高附加值的下游产品，资源浪费巨大，高值化、多品类的开发利用成为现今迫切需求。咳嗽是呼吸道系统的常见病。中医认为“肺主宣发和肃降”，肺气宣发通畅，则能主一身之气而呼吸调匀，助血液循环而贯通百脉12。但肺为娇脏，最易受外邪侵袭，如果受到风、寒、暑、湿、燥、火六淫的侵袭，就会造成肺失宣降，肺气上逆，引起咳嗽。按病邪性质咳嗽可分为风寒咳嗽、风热咳嗽、风燥咳嗽，痰湿咳嗽等36。秋冬时节，由于气候干燥多燥邪或风邪犯肺引发咳嗽，治疗多以清热去燥；而内伤咳嗽，多以脏器功能的失调为基础，以痰湿、痰热、肝火犯肺，肺阴亏损等为主要病症，治疗多以滋阴润肺为主79。软儿梨性凉味甘，富含果酸、苹果酸、柠檬酸、蔗糖、葡萄糖等成分，具有清热解毒、润燥止咳，生津化痰、滋身祛疾之功效1011，是药食兼备的妙品。本草纲目记载软儿梨有润肺、止咳、凉心消炎、降火、解疮毒、解酒等多种功效，当地人常服食之以镇咳化痰，但其具体作用机制鲜见报道。本研究旨在采用网络药理学方法和生物信息分析技术对软儿梨止咳化痰作用进行研究，并通过分子对接和动物实验对分析结果进行验证，以期为软儿梨止咳化痰功效提供理论与试验依据。1材料与方法1.1数据库与软件中药系统药理学数据库（TCMSP，http:/ 数据库（https:/cn.string-db.org/）、GeneCards 数据库（https:/www.genecards.org/）、Metascape 分析平台（https:/metascape.org/）、PubChem 数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uiprot 数据库（https:/www.uniprot.org/）、PDB 数据库（https:/www.rcsb.org/）、Cytoscape3.6.1、AutodockVina2.1、Chem3D、Pymol3.3、Venny2.1.0 等。1.2材料与仪器软儿梨冻梨甘肃皋兰百璐通瓜果专业合作社提供，剥去表皮后自然解冻取汁 1000mL，相当于软儿梨冻梨 1460.7g，经高效液相色谱法测定，总酚含量为 149.14mg/kg、总黄酮含量为 58.23mg/kg12；SPF 级昆明小鼠100 只，1820g，雌雄各半，甘肃中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0002，动物伦理审查批号：20220714；麻杏止咳糖浆太极集团四川南充制药有限公司，国药准字 Z51022042；氨水、酚红青岛海湾精细化工有限公司；IL-6ELISA 试剂盒、IL-13ELISA 试剂盒南12食品工业科技2023 年12月京建成生物工程研究所；RT-PCR 试剂盒、逆转录试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、RNA 提取（Trizol 法）试剂盒上海翌圣生物科技股份有限公司；兔抗 IL6多克隆抗体、兔抗 IL1B 多克隆抗体、兔抗 MAPK3多克隆抗体、兔抗 VEGFA 多克隆抗体、兔抗PTGS2 多克隆抗体上海酶联生物科技有限公司。UV-5500 型紫外分光光度计、BS124S 型电子天平、B-600 型超微量分光光度计上海元析仪器有限公司；TDL-5M 型台式大容量低温离心机上海精密仪器仪表有限公司；医用 KJR-602C 型超声雾化器合肥康居人智能科技有限公司；SUNRISE 酶联免疫检测仪瑞士 TECAN 公司；PCR 扩增仪、实时荧光定量 PCR 仪美国 AppliedBiosystem 公司；1645050 型基础电泳仪、Mini-PROTEANTetra 电泳槽、小型 rans-Blot 转印槽美国 Bio-Rad 公司。1.3实验方法1.3.1软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析通过调研，收集文献已报道的软儿梨化学成分，TCMSP、本草组鉴、ECTM 数据库中检索其对应的作用靶点。GeneCards 数据库中分别以关键词“咳嗽（cough）”和“痰（sputum）”检索，得到与咳嗽和生痰相关的两组基因。将 GeneCards 数据库中所得两组基因与软儿梨的作用基因相映射，得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。Venny2.1.0 绘制维恩图，Cytoscape 绘制软儿梨止咳化痰作用成分-靶点图。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至 Metascape 数据分析平台，进行GO 功能富集分析（包括Biologicalprocess、Cellularcomponent、Molecularfunction）和 KEGG 通路富集分析。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至STRING 数据平台，构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络（PPI 网络）。利用 Cytoscape插件 CytoHubba，根据 Degree 值过滤出 PPI 网络中的关键基因（Top10 基因）。通过 Metascape 数据平台对 Top10 基因进行 KEGG 通路富集，预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。1.3.2软儿梨止咳化痰作用 Top10 基因分子对接验证Uiprot 数据库、PDB 数据库中检索下载 Top10基因的蛋白结构，PubChem 数据库中下载 PPI 网络中排名前 3 位的化学成分 3D 结构。采用 Chem3D、Pymol 对受体和配体进行加氢、去水、均电荷等预处理，采用 AutodockVina 进行对接，设置对接 20 次，采用 Pymol 将结合能最小的对接结果可视化。1.3.3软儿梨止咳化痰作用动物试验验证1.3.3.1氨水引咳试验SPF 级昆明种小鼠 50 只，雌雄各半，体重 1820g，随机分为 5 组，分别为软儿梨高、中、低剂量组（软儿梨原汁 0.2、0.15、0.1mL/10g），麻杏止咳糖浆（0.1mL/10g）为阳性对照组，生理盐水（0.1mL/10g）为空白对照组；每天灌胃给药1 次，连续 10d。于最后 1 次给药 1h 后逐一将小鼠放入钟罩内，用医用超声雾化器以最大喷雾量（0.2mL/min）向钟罩内喷入 25%氨水气雾对小鼠进行引咳，15s 后将小鼠移出，记录从开始喷雾到小鼠产生第一次咳嗽所需时间（咳嗽潜伏期）和 3min 内咳嗽次数13。小鼠典型咳嗽症状为：腹部内缩，同时张大口，有咳嗽声。并按公式计算止咳率。止咳率(%)=给药组咳嗽潜伏期空白组咳嗽潜伏期1001.3.3.2酚红排泄试验SPF 级昆明种小鼠 50 只，雌雄各半，分组及给药方法同氨水引咳试验。末次给药 30min 后小鼠腹腔注射 5%的酚红溶液 0.5mL（0.5g/kg），30min 后处死动物，剥离甲状软骨下至气管分叉处的气管，放入盛有 2mL 生理盐水的试管中，加入1mol/L 的NaOH0.1mL 摇匀，于波长546nm处测吸光度，根据标准曲线，计算酚红含量（g/mL）14。1.3.3.3ELISA 法检测血清炎症因子水平氨水引咳试验中的小鼠，记录咳嗽潜伏期和 3min 内咳嗽次数后，摘眼球取血，离心取血清，按 ELISA 试剂盒说明测定血清中 IL-6 和 IL-13 含量。1.3.3.4RT-PCR 检测肺组织中 IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 的 mRNA 表达氨水引咳试验中的小鼠，摘眼球取血后，处死动物，冰上取出肺脏，分成两份，80 冰箱保存，分别供逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹（WB）使用。取80 保存的肺组织 50mg，按试剂盒说明书提取收集 RNA，将得到的 RNA 溶于 DEPC 水中；取溶解后的 RNA2L，微量分光光度计于 260、280nm 处测定吸光度，通过 A260/A280 计算 RNA 的纯度和浓度。通过逆转录试剂盒合成 cDNA，NCBIGeneba（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 PrimerBank（http:/harv-ard.edu）搜索基因序列，根据基因序列设计引物（引物序列见表 1），采用实时荧光定量 PCR 扩增，每个样品做 3 个复孔，扩增条件：94 预变性 5min，95变性 30s，60 退火 30s，72 延伸 30s，30 个循环。表1引物序列表Table1Primersequence基因引物序列（53）长度IL6正向ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG170bp反向CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGVEGFA正向AGGGCAGAATCATCACGAAGT183bp反向AGGGTCTCGATTGGATGGCAPTGS2正向TAAGTGCGATTGTACCCGGAC285bp反向TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGTIL1B正向AGCTACGAATCTCCGACCAC289bp反向CGTTATCCCATGTGTCGAAGAAMAPK3正向CTACACGCAGTTGCAGTACAT213bp反向CAGCAGGATCTGGATCTCCC1.3.3.5Western Blot 检 测 肺 组 织 中 IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 的蛋白表达取适量第44卷第23期罗慧英，等：基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制1380 保存的肝脏组织加入裂解液，8000r/min，4 低温匀浆 10min，冰上裂解 20min 后冻融 3 次，低温离心 10min（8000r/min，4），取上清，用 5上样缓冲液与蛋白样品按 1:4 的比例混合，100 变性 5min 后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，5%BSA 封闭 1h，一抗（1:1000 稀释）4 孵育过夜，二抗室温孵育 1h，ECL 发光液显影，ImageJ 软件分析目的蛋白与内参蛋白的灰度值，根据相应内参的灰度值计算目的蛋白的相对表达量。1.4数据处理X用 SPSS20.0 软件对所有数据进行处理，计量资料用+SD 表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P0.05 为具有统计学意义。2结果与分析2.1软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析结果经文献调研发现，软儿梨中已见报道的化学成分有 51 个（表 2），经 TCMSP、本草组鉴、ECTM 数据库检索得到对应作用靶点 282 个。GeneCards 数据库中与咳嗽相关的基因有 4425 个，与生痰有关的基因有 1737 个，三者映射重叠基因有 80 个（图 1a），软儿梨止咳化痰作用成分-靶点-疾病映射图见图 1b。将 80 个交集基因提交至 Metascape 数据分析平台，得到 KEGG 通路富集（图 1c）和 GO 功能富集（图 1d）结果，如图可知，这 80 个基因可能与细胞内过氧化物酶活性（Peroxidaseactivity）、抗氧化活性（Antioxidantactivity）、氧化还原酶活性（Oxidoreductaseactivity）、对活性氧的反应（Responsetoreactiveoxygenspecies）等生物过程有关，机制可能涉及 TNF 信号通路、IL-17信号通路、癌症信号通路等。通过 STRING 数据库，构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络（PPI 网络）（图1e）。利用Cytoscape 插件CytoHubba，根据 Degree 值过滤出 PPI 网络中的关键基因（Top10基因）（图 1f），分别是：GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3。Top10 基因与软儿梨中所含化学成分对应关系如图 1g 所示。对 Top10 基因进行 KEGG 通路富集分析，前 20 条富集信号通路如图 1h 所示，其中 12 条信号通路与细菌、病毒及寄生虫感染有关（Pertussis、Kaposisarcoma-associatedherpesvirusinfection、Pa-thogenicEscherichia coliinfection、Chagasdisease、Human cytomegalovirus infection、Yersinia infec-tion、Leishmaniasis、Salmonellainfection、Amoebi-asis、Malaria、Legionellosis、HepatitisB），4 条信号通路与免疫相关疾病有关（IL-17signalingpathway、C-type lectin receptor signaling pathway、Rheuma-toid arthritis、Toll-like receptor signaling pathway）（见图 1i），提示软儿梨可能主要通过消除炎症感染、增加人体免疫力来发挥止咳化痰作用。表2软儿梨化学成分表Table2ChemicalcompositiontableofRuanerli序号成分中文名成分英文名分子式分子量（g/mol）1苹果酸MLT（malicacid）C4H6O5134.092柠檬酸citricacidC6H8O7192.123熊果苷isohomoarbutinC13H18O7286.284儿茶酚catecholC6H6O2110.115绿原酸chlorogenicacidC16H18O9354.316咖啡酸caffeicacidC9H8O4180.167对香豆酸（Z）-p-coumaricacidC9H8O3164.168阿魏酸ferulicacidC10H10O4194.189芦丁rutineC27H30O16610.5102-甲基-丁醇2-methyl-butanolC5H12O88.15113,7-二甲基-6-辛烯（R）-3,7-dimethyl-6-octenC13H24O2212.3312反-2-己烯trans-2-hexeneC6H1284.1613反-2-辛烯trans-2-octenC10H18O2170.2514环己醇cyclohexanolC6H12O100.1615二氢杨梅素dihydromyricetinC9H20O144.2516戊醇amylalcoholC5H12O88.1517辛醇caprylalcoholC8H18O130.23182-甲基萘2-methylnaphthaleneC11H10142.219邻苯二甲酸二乙酯diethylphthalate/dimethylphthalateC12H14O4222.2420反-2-辛烯醛trans-2-octenalC8H14O126.221庚醛n-heptanalC7H14O114.1922癸醛1-decanalC10H20O156.2623己醛hexanalC6H12O100.1624壬醛1-nonaldehydeC9H18O142.2425戊醛valeraldehydeC5H10O86.13262-甲基丁酸2-MethylbutyricacidC5H10O2102.13273,4二羟苯基-D-丙氨酸3-（3,4-dihydroxyph-enyl）-d-alanineC9H11NO4197.1928-苯基-L-丙氨酸-phenyl-L-alanineC9H11NO2165.1929乙醛酸glyoxylicacidC2H2O374.0430棕榈酸palmiticacidC16H32O2256.42312-戊酮2-pentanoneC5H10O86.1332-法呢烯a-farneseneC15H24204.3533环十二烯cyclododeceneC12H22166.334十七烷甲酸1-heptadecanecar-boxylicacidC18H36O2284.535苯甲酸苄酯benzylbenzoateC14H12O2212.2436醋酸丁酯butylacetateC6H12O2116.1637丁酸丁酯butylbutyrateC8H16O2144.21383-苯基丁酸甲酯3-benzylmethylbutyrateC20H28N2O3344.439丁酸乙酯ethylbutyrateC6H12O2116.1640核黄素riboflavinC17H20N4O6376.441硫胺素thiamineC12H17N4OS+265.3642尼克酸niacinC6H5NO2123.1143维生素CvitaminCC6H8O6176.1244蔗糖canesugarC12H22O11342.345乙醇ethanolC2H6O46.0746萘naphthaleneC10H8128.16947丙酸propionicacidC3H6O274.0848乙酸aceticacidC2H4O260.0549丙酮acetoneC3H6O58.0850苯乙烯styreneC8H8104.1551甲苯tolueneC7H892.1414食品工业科技2023 年12月Ruanerli108888014921592765CoughSputum6log10(P value)30BPCCMF252015富集分数1050Post-embryonic camera-type eye morphogenesisPost-embryonic camera-type eye developmentPost-embryonic eye morphogenesisResponse to toxic substanceCellular detoxificationLipid hydroxylationSignal transduction in absence of ligandExtrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligandResponse to reactive oxygen speciesBcl-2 family protein complexTertiary granule lumenSecretory granule lumenCytoplasmic vesicle lumenVesicle lumenTertiary granuleFicolin-1-rich granuleSpecific granule lumenEndocytic vesicle lumenFicolin-1-rich granule lumenEstrogen 2-hydroxylase activityBH domain bindingBH3 domain bindingAntioxidant activityHeme bindingDeath domain bindingTetrapyrrole bindingPeroxidase activityOxidoreductase activity,acting on peroxide as acceptorOxidoreductase activity,acting on paired donors,withincorporation or reductionof molecular oxygen,reducedflavin or flavoprotein as one donor,and incorporationof one atom of oxygenSmooth muscle adaptationMolecular functionCellular componentBiological processGAPDHGAPDHGAPDHCASP3CASP3CASP3MAPK3MAPK3MAPK3IL1BIL1BIL1BVEGFAVEGFAVEGFAIL10IL10IL10IL6IL6IL6ValeraldehydeAcetoneRutineRutinPalmitic acidNaphthaleneHexanal78910 11 12KEGG pathwaysCaffeic acidJUNJUNJUNCXCL8CXCL8CXCL8PTGS2PTGS2PTGS2PertussisIL-17 signaling pathwayAGE-RAGE signaling pathway in diabetic complicationsKaposi sarcoma-associated herpesvirus infectionPathogenic escherichia coli infectionChagas disease(American trypanosomiasis)C-type lectin receptor signaling pathwayTNF signaling pathwayHuman cytomegalovirus infectionYersinia infectionLeishmaniasisSalmonella infectionRheumatoid arthritisAmoebiasisToll-like receptor signaling pathwayMalariaLegionellosisNon-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)Pathways in cancerHepatitis B(a)(c)(d)(e)(f)(g)(i)(h)(b)图1软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析结果Fig.1ResultsofnetworkpharmacologicalanalysisontheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli注：a：软儿梨作用靶点基因-GeneCards 中止咳化痰基因韦恩图；b：软儿梨-成分-靶点图；c：软儿梨止咳化痰基因 KEGG 通路富集图；d：软儿梨止咳化痰基因 GO 功能富集图；e：软儿梨止咳化痰基因蛋白互作网络图；f：软儿梨止咳化痰 Top10 基因；g：软儿梨中所含化学成分-Top10 基因关系图；h：Top10 基因 KEGG 通路富集圈图；i：Top10 基因 KEGG 通路富集分组图。第44卷第23期罗慧英，等：基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制152.2软儿梨止咳化痰作用 Top10 基因分子对接结果分子对接结果显示，软儿梨止咳化痰作用 Top10基因与 PPI 网络中排名前 3 位的化学成分（咖啡酸、苦丁、戊醛）的结合能均小于-5kcal/mol（见图 2），说明受体与配体能够自发结合，且具有较强的结合活性15，部分分子对接结果见图 3。1614咖啡酸芦丁戊醛1210结合能(kcal/mol)86GAPDHIL6IL1BVEGFAPTGS2JUNCASP3CXCL8IL10420图2软儿梨止咳化痰作用 Top10 基因蛋白与 Top3 活性成分结合能图Fig.2BindingenergygraphofTop10geneproteinsfortheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerliandTop3activecomponents2.3软儿梨对氨水致小鼠咳嗽反应的影响氨水是一种刺激性较强的化学物质，动物吸入氨水气雾后，可刺激呼吸道感受器，引起咳嗽13。由表 3 可知，经氨水刺激后小鼠出现明显咳嗽反应。与空白组比较，软儿梨组小鼠咳嗽次数显著减少（P0.05），咳嗽潜伏期也有显著延长（P0.05），且作用呈剂量依赖性，提示软儿梨对氨水所致咳嗽有较好的抑制作用。2.4软儿梨对小鼠呼吸道酚红排泄的影响酚红是一种对人体无害的染料，经腹腔注射进入小鼠体内后可部分由呼吸道排泄，由祛痰作用的药物在使支气管分泌增加的同时，也使呼吸道黏膜的酚红排泄量增加，因此可由呼吸道酚红的排泄量间接推测药物的祛痰作用。在本实验中，酚红标准曲线为：Y=0.81048X0.05511，r2=0.97959。经与标准曲线比对发现，与空白组比较软儿梨组酚红排泄量显著增加（P0.05），其呈显著剂量依赖性（P0.05）（见表 4），提示软儿梨有促进支气管黏膜分泌（祛痰）的作用。2.5软儿梨对血清中炎症因子水平的影响IL-6 是一个 26kDa 的多肽，生物效应极为广泛，主要包括1618：调节 B 细胞的生长和分化；增强CTL、NK 细胞的杀伤效应；刺激造血干细胞的增生分化；促进肝细胞合成急性相蛋白等。大量实验资料表明，IL-6 在维持机体生理平衡中具有十分重要的地位，体内 IL-6 的异常与多种疾病有关。IL-13 是趋化因子家族的一种细胞因子，可诱导单核细胞分化和炎症反应，在过敏、哮喘、肺纤维化和肿瘤发生中具有重要作用1921。在本实验中，经 ELISA 检测发现，经氨水刺激后，小鼠血清中 IL-6 和 IL-13 的水平明显升高，经软儿梨处理后 IL-6 和 IL-13 的水平显著降低（P0.05），且作用呈显著剂量依赖性（P0.05）（表 5），提示软儿梨可以降低血清中炎性介质的水平。2.6软儿梨对肺组织中 IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3mRNA 表达及蛋白表达的影响IL1 是趋化因子家族的一种细胞因子，IL1B 是其一种存在形式。低浓