基于胶体金侧向层析原理的大米中痕量镉现场快速检测方法.pdf

基金项目:安徽省自然科学基金项目(编号:Q B );安徽省重点研究与开发计划项目(编号:a ,f )作者简介:王冉冉,女,合肥工业大学在读硕士研究生.通信作者:姚丽(),女,合肥工业大学博士后,博士.E m a i l:y b l c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()基于胶体金侧向层析原理的大米中痕量镉现场快速检测方法Am e t h o d f o ro n s i t ea n dr a p i dd e t e c t i o no f t r a c ec a d m i u mi n r i c eb a s e do nc o l l o i d a l g o l d l a t e r a l c h r o m a t o g r a p h y王冉冉WANGR a n r a n姚丽Y A OL i姚帮本Y A OB a n g b e n陈伟CHEN W e i陈赵然CHENZ h a o r a n(合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽 合肥 ;安徽省产品质量监督检验研究院,安徽 合肥 )(S c h o o l o fF o o da n dB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n g,H e f e iU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,H e f e i,A n h u i ,C h i n a;A n h u iP r o v i n c eI n s t i t u t eo fP r o d u c tQ u a l i t yS u p e r v i s i o n&I n s p e c t i o n,H e f e i,A n h u i ,C h i n a)摘要:目的:建立一种可实现对大米中镉元素现场快速检测的胶体金试纸条检测方法.方法:基于侧向免疫层析技术,对胶体金试纸条一系列影响检测性能的参数进行系统优化.结果:所制备的胶体金试纸条对大米中镉元素的检测达到了可视化检测限为 n g/g的水平.在实际应用中,此方法样品前处理过程操作简单,低浓度酸直接提取并稀释后即可用于试纸条检测.结论:胶体金试纸条快速检测方法适用于大米镉的现场快速筛检.关键词:大米;镉;现场快速检测;胶体金试纸条;可视化检测;低浓度酸A b s t r a c t:O b j e c t i v e:Ac o l l o i d a lg o l dt e s ts t r i pm e t h o dt h a tc a na c h i e v eo n s i t ea n dr a p i dd e t e c t i o no fc a d m i u me l e m e n t si nr i c ew a se s t a b l i s h e d M e t h o d s:B a s e do nl a t e r a li mm u n o c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n o l o g y,t h ec o l l o i d a lg o l dt e s ts t r i pw a s s y s t e m a t i c a l l yo p t i m i z e d f o r a s e r i e s o f p a r a m e t e r s t h a t a f f e c tt h ed e t e c t i o np e r f o r m a n c e R e s u l t s:T h ev i s u a ld e t e c t i o nl i m i to fc a d m i u mi nr i c ew a sr e a c h e da t n g/gw i t ht h ec o l l o i d a lg o l dt e s ts t r i p I n p r a c t i c a la p p l i c a t i o n s,t h es a m p l e p r e t r e a t m e n tp r o c e s s i s s i m p l e,l o wc o n c e n t r a t i o na c i dc a nb ed i r e c t l ye x t r a c t e da n dd i l u t e d f o r t e s t s t r i pd e t e c t i o n C o n c l u s i o n:T h e c o l l o i d a l g o l dt e s t s t r i pw a ss u i t a b l ef o ro n s i t er a p i ds c r e e n i n go f c a d m i u mi nr i c e K e y w o r d s:r i c e;c a d m i u m;o n s i t ea n dr a p i dd e t e c t i o n;c o l l o i d a lg o l dt e s t s t r i p;v i s u a l d e t e c t i o n;l o wc o n c e n t r a t i o na c i d镉是一种通过工业生产和农业实践广泛传播的银白色有毒金属污染物,具有不可降解性和积聚性,是环境中毒性最强的重金属之一.镉普遍存在于环境中,会通过水源、土壤、空气流动等进入生态系统内循环.水稻具有发达的根系和特殊的生长周期,对重金属镉的吸收、富集能力强于一般农作物,导致大米重金属镉超标问题尤为突出.中国相关法律规定大米中镉含量不得超过m g/k g.因此,对大米中镉污染的检测对于保障人的生命健康具有重要意义.大米中重金属污染尤其是镉污染已严重危害到人类健康.目前,对于镉污染的检测方法主要依赖于一些大精仪器,如原子荧光光谱(A F S)、电感耦合等离子体原子发射光谱(I C P A E S)、电感耦合等离子体质谱(I C P M S)等.这些方法虽然具有较高的灵敏度与精确度,但是检测样品要求高,样品前处理复杂,检测耗时长,所需仪器昂贵并需要专业人员操作,不适合现场即时筛查.一些快速检测方法如比色检测法 、电化学分析法 ,因灵敏度低、抗干扰能力弱,不适用于复杂的实际样本检测.近年来,侧向层析试纸技术因其简单、易操作、低成本、检测 耗 时 短 等 而 被 广 泛 应 用 于 食 品 安 全 检 测 领域 .X u等 开发了一种基于Q u E C h E R S方法的便携式仪器,经酸溶液剧烈振摇提取后,转移到分散固相萃取柱中由高氯酸洗脱,通过免疫层析试纸法检测含有镉的纯化和浓缩样品,通过将该方法与电感耦合等离子体质谱法获得的结果进行比较,进一步验证了该方法实F OO D&MA CH I N E R Y第 卷第期 总第 期|年月|际应用中的可靠性.L i n g等 用具有复杂三维花状结构的纳米花颗粒(A u N F s)作为高信号报告基因,成功开发了基于A u N F s标记的条带.与传统胶体金标记的结果相比,检测线提高了约 倍,将获得的试纸测试用于真实水样中镉离子的检测,其灵敏度高,且具有良好的重复性.A r a i等 开发了糙米中镉免疫检测试剂盒,由免疫色谱装置和用于预处理的选择性纯化柱组成,定量范围为 g/k g,可用于现场快速检测.研究拟通过胶体金免疫层析试纸条检测技术,构建镉离子便携可视化快速检测平台,并与传统的重金属镉提取方法进行比较,以期为大米中镉的现场检测提供更快速便捷的途径.材料与方法材料与试剂大米:籼米和糯米,安徽省质检院;氯金酸、柠檬酸三钠:分析纯,生工生物工程(上海)股份有限公司;牛血 清 蛋 白(B S A)、人 血 清 蛋 白(H S A)、酪 蛋 白(C a s e i n)、酪蛋白钠(N a C a s e i n):分析纯,百灵威科技有限公司;磷酸缓冲溶液(P B)、磷酸盐缓冲溶液(P B S)、磷酸盐吐温缓冲 液(P B S T)、三 羟甲 基 氨 基 甲 烷 盐 酸 盐(T r i s HC l)、硝酸(HNO)、氢氧化钠(N a OH)、乙二胺四乙酸二钠(E D T A N a):分析纯,国药集团化学试剂有限公司;水中镉标准品:m g/L,坛墨质检科技股份有限公司;镉抗体、镉包被原、羊抗鼠二抗:杭州贤至科技生物有限公司;硝酸纤维素膜(N C膜)、吸水垫、玻璃纤维膜、聚氯乙(P V C)底板:上海捷宁科技生物有限公司.主要仪器设备磁力搅拌器:I KA R C Tb a s i c型,广州仪科实验室技术有限公司;电热恒温鼓风干燥箱:B型,上海三发科学仪器有限公司;低温高速离心机:F r i t s c hL E G E N D M I C R O R型,德国贺利氏公司;试纸条喷膜仪:X Y Z型,美国B i o d o t公司;试纸条切条机:CM 型,美国B i o d o t公司;高速万能粉碎机:FW 型,天津市泰斯特仪器有限公司;超声仪:I T 型,昆山市超声仪器有限公司.方法 胶 体 金 的 制 备采 用 柠 檬 酸 三 钠 还 原 法.将 m L锥形瓶和磁力搅拌子用自来水冲洗干净后,加入王水浸泡 h.向锥形瓶中加入双蒸水煮沸后倒出,反复用沸水洗涤次.向洗净的锥形瓶中加入 m L质量浓度为g/L的氯金酸溶液,并加双蒸水至 m L,混匀,置于磁力搅拌器上加热至暴沸状态时,开启搅拌,转速调至 r/m i n,随后迅速加入m L 柠檬酸三钠溶液,边加热搅拌边,当溶液由黑变紫再变成稳定的酒红色后,继续加热搅拌m i n,关闭热源,继续搅拌m i n,关闭仪器,将锥形瓶于室温冷却,并于冰箱贮藏备用.胶体金标记镉抗体偶联物的合成取m L胶体金溶液于m L离心管内,加入KC O溶液调节p H,再加入 m g/m L镉 抗 体,室 温 下 摇 晃 孵 育h.加 入 L封闭 剂,继 续 室 温 孵 育 h.反 应 结 束 后,r/m i n离心 m i n,弃去上清液后加入 L重悬液进行复溶,获得所需偶联物.移取L偶联物滴加至金标垫上,于 烘箱干燥,备用.免疫侧向层析试纸的制备胶体金免疫侧向层析试纸从下到上依次由P V C底板、样品垫、金标垫、N C膜和吸水垫个部分组成.将一定浓度的镉包被原和羊抗鼠二抗经喷膜仪分别以直线的形式喷涂至N C膜上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),随后将膜放入 烘箱中干燥h.最后将样品垫、金标垫、N C膜和吸水垫依次粘贴在P V C底板上,用切条机切割成mm宽的试纸条保存备用.大米样品中镉的检测()样品前处理:将标准浓度镉大米样本粉碎后过 目筛网,以保证每一批样本提取前粒径相等.()试样提取:准确称取g过筛后的大米于m L离心管中,加入m L质量分数为的HNO提取镉离子.将溶液于室温下剧烈涡旋震荡m i n,使样品与硝酸充分反应.将溶液于 r/m i n离心 m i n,获得含有镉离子的上清液.()镉离子检测:取 L上清液加入适量m o l/L的N a OH溶液调至中性,待充分混匀后,加入 L(含 m g/LE D T A N a)mm o l/L的P B S T缓冲液,混匀,得到的溶液即为上样液.取 L上样液滴加到制备好的 镉 胶体 金试 纸 条样 品垫 上,等 待 m i n后观 察结果.试验参数优化胶体金与镉抗体偶联体系p H优化向m L胶体金溶液中加入不同体积(,L)m o l/L的KC O,根据试纸条检测结果确定最适的KC O用量.镉抗体用量优化在KC O用量优化结果的基础上,偶联过程中,在等量胶体金中加入不同体积(,L)质量浓度为m g/m L的镉抗体,制备成胶体金镉抗体偶联物,最终根据试纸条检测结果确定最适的镉抗体用量.|V o l ,N o 王冉冉等:基于胶体金侧向层析原理的大米中痕量镉现场快速检测方法封闭剂种类的选择分别选择质量分数为 B S A、H S A、C a s e i n、N a C a s e i n作为封闭剂进行封闭,最终制备成胶体金镉抗体偶联物,根据试纸条检测结果确定最适的封闭剂种类.重悬液的选择在前期参数优化的基础上,平行组进行胶体金与抗体的偶联与封闭,选择质量分数为 B S A、H S A、C a s e i n、N a C a s e i n作为重悬液对组偶联物进行复溶,根据试纸条检测结果确定最适的重悬液种类.螯合缓冲液的选择为了验证不同的盐离子浓度和不同的p H检测环境对大米中镉离子检测效果的影响,选择 m o l/LP B、m o l/LP B S、m o l/LT r i s HC l、m o l/LP B S T种溶液分别作为螯合缓冲液,根据试纸条检测结果确定最适的缓冲液种类.试纸条检测灵敏度的验证选择优化后的最适条件,分别取 L质量浓度分别为,n g/m L稀释后的镉标准溶液于不同离心管中,经m o l/L N a OH将p H调 至 中 性 后,与 L(含 m g/L E D T A N a)mm o l/LP B S T混合,等待m i n后观察试纸条显线情况.试纸条特异性验证为了验证此方法是否受其他重金属离子的干扰,分别选取质量浓度为 n g/m L的F e、C r、Z n、H g、C u、P b以 及 空 白 对 照P B S T,与质量浓度为 n g/m L的目标物C d,利用制备的试纸同时进行检测,等待m i n后观察其显线情况.结果与分析镉胶体金试纸条检测原理如图所示,镉抗体标记胶体金形成金标抗体,铺在标记垫上,N C膜上分别喷涂了羊抗鼠二抗和镉包被原作为C线和T线.当被测样品中含有重金属镉时,通过样品的前处理将其转化成镉离子,再与乙二胺四乙酸形成螯合物,会与T线上的镉包被原共同竞争金标抗体,金标抗体便不能与喷涂于T线上的镉包被原结合,使T线显线较弱或者不显线,随着金标抗体继续向前迁移,将与C线上的羊抗鼠二抗结合,显示红线最终试纸条上C线较强,T线较弱或者不显线,即为阳性;若样品中不含镉,金标抗体便会与T线上的镉包被原以及C线上的羊抗鼠二抗结合,此时试纸条显示两条颜色较强的红线,即为阴性.胶体金与镉抗体偶联p H优化图为胶体金与镉抗体偶联体系最适p H优化结果,由于合适的酸碱环境有助于抗体在胶体金表面的结合,而过酸过碱条件下,容易导致胶体金聚集,故选择KC O这种强碱弱酸盐来对初始状态为酸性的胶体金进行p H值的调节.由图可知,随着体系中加入KC O量的增加,溶液的p H值随之增大,试纸条的灵敏度逐渐增强,说图重金属镉胶体金试纸条检测原理图F i g u r eD e t e c t i o ns c h e m a t i cd i a g r a m o ft h ec o l l o i d a lg o l dt e s t s t r i pf o r t h eh e a r ym e t a l c a d m i u m图胶体金与抗体偶联体系最适p H优化结果F i g u r e O p t i m i z a t i o n r e s u l t s o f o p t i m u m p H f o rc o l l o i d a l g o l da n dc a d m i u ma n t i b o d yc o n j u g a t e ds y s t e m s明在偏 碱性 条件 下,有 助 于 抗 体 与 胶 体 金 的 结 合.当KC O用量为L时,检测灵敏度最高,且阴性T线强度最强,阴阳结果对比明显,因此在该反应条件下,选择KC O用量为L进行标记体系p H的调节.镉抗体用量优化由图可知,镉抗体用量太低时,影响T线的显现,随着镉抗体用量的增多,检测结果中T线的强度增强,但相应的灵敏度降低,综合考虑T线强度和检测灵敏度,最终选择L的镉抗体为最终使用量.胶体金与镉抗体偶联封闭剂的选择由图可知,使用C a s e i n和N a C a s e i n作为封闭剂制备的金标抗体偶联物,测试过程中偶联物在金标垫上不容易释放,测试完成后金标垫上仍有大量偶联物堆积,而B S A和H S A作为封闭剂时释放效果良好.在二者 检 测图抗体标记量优化结果F i g u r eO p t i m i z a t i o nr e s u l t so f c a d m i u ma n t i b o d yd o s a g e安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I ON总第 期|年月|灵敏度一致的条件下,B S A封闭组阴性T线强度略高于H S A封闭组,综合考虑,选取质量分数为 的B S A溶液作为试纸条偶联过程的封闭剂.重悬液的选择由图可知,种不同的重悬液制备的试纸条,检测过程中金标垫上偶联物均有良好的释放效果,对比组检测结果中的灵敏度和显线强度,最终选择质量分数为的N a C a s e i n作为重悬液.螯合过程缓冲液的优化由图可知,当P B S T作为缓冲液时,其灵敏度与其他种缓冲液相比明显提高,可能是P B S T中含有的表面活性剂吐温 提高了镉与金标抗体的结合.因此,选择P B S T作为螯合缓冲液.标准曲线的建立由图(a)可知,随着样品中C d质量浓度的增加,试纸条T线的颜色强度逐渐减弱,当C d质量浓度达到图封闭剂优化结果F i g u r eO p t i m i z a t i o no f t e s t r e s u l t so fd i f f e r e n tb l o c k i n ga g e n t s n g/m L时,可以明显看出其T线颜色与阴性样本的差异,当C d质量浓度达到 n g/m L时,试纸条T线完全消除.由图(b)可知,随着C d质量浓度的增大,T线的峰值面积越来越小,在 n g/m L时检测线的峰面积显著减小,并且在C d质量浓度达到 n g/m L时基本消失,与图(a)中的检测线变化趋势保持一致,进一步证明了该试纸条用肉眼观察的准确性.由图(c)可知,T线峰面积与对应的C d质量浓度在 n g/m L时具有良好的线性关系,证明了试验方法的定量检测潜力.特异性检测结果由图(a)可知,利用制备的试纸条对多种金属离子进行检测时,只有C d能够使试纸条T线消失,其他重金属离子样本上样时,T线的强度与空白对照组几乎一致,表 明 该 试 纸 条 对 于 镉 离 子 具 有 良 好 的 特 异 性.图(b)和图(c)分别是根据图(a)中T线处信号强度的灰度扫描图谱和峰面积获得的柱状图,进一步验证了此镉胶体金试纸条具有良好的特异性.实际样品检测对份不同大米样本通过镉离子提取并螯合后利用制备的镉离子试纸条进行上样检测,结果如图所示.由图可知,份大米样本中有个样本对应T线与C线强度区别不大,无明显减弱,可判定为阴性样本;份T线明显变弱,可判定为阳性样本.并且试纸条对应T线的灰度扫描结果也显示,其中份样本T线峰值较高,另图重悬液优化结果F i g u r eO p t i m i z t i o no f t e s t r e s u l t so fd i f f e r e n tr e s u s p e n s i o n s图螯合缓冲液优化结果F i g u r eO p t i m i z a t i o nr e s u l t so f c h e l a t i n gb u f f e r图镉胶体金试纸条与标准曲线的建立F i g u r eE s t a b l i s h m e n to f s t a n d a r dc u r v eo f c a d m i u mc o l l o i d a l g o l ds t r i p|V o l ,N o 王冉冉等:基于胶体金侧向层析原理的大米中痕量镉现场快速检测方法图镉胶体金试纸条特异性检测结果F i g u r eS p e c i f i c t e s t r e s u l t so f c a d m i u mc o l l o i d a lg o l dt e s t s t r i p外份T线峰值降低明显.而通过原子吸收光谱法测得份样本中镉含量分别为籼米 n g/g、籼米 n g/g、籼米 n g/g、籼米 n g/g、糯米 n g/g,糯米 n g/g,根据国标对大米中镉离子的限量要求可知,低于 n g/g时可视为阴性样本,说明试纸条检测结果与仪器测定结果一致,进一步验证了胶体金试纸条方法的可行性与有效性.与市售试剂盒对比为了验证试验方法检测大米中镉的准确性,购买了市售的检测试剂盒与之进行对比.由图 可知,试验所制备的胶体金试纸条比商业化试剂盒的消线效果更好,更适用于现场快速检测.将该胶体金试纸条检测法与商业化电化学检测仪相比,两者均能满足实际检测要求,但该方法的便携性和特异性更好.因此试验方法具有极大的实际应用潜力.结论研究建立了一种可现场快速检测大米中重金属镉的胶体金试纸条.结果表明,与传统的镉离子检测方法相比,试验方法的样品前处理过程简便、耗时短,无需复杂的样本提取过程,操作过程简单、温和,经过稀酸提取并图实际样品检测结果F i g u r eD e t e c t i o nr e s u l t so f c a d m i u mi nr e a l s a m p l e图 市售试剂盒与试验方法检测结果对比F i g u r e C o m p a r i s o n o f t e s t r e s u l t s b e t w e e nc o mm e r c i a l r e a g e n tk i t a n dt e s tm e t h o d稀释后即可于试纸条上检测,短时间内就能获得检测结果,节省了大量时间.研究仅对大米中的镉进行了检测,后续可以将该方法应用于其他谷物及各种水产品等镉污染环境中,通过进一步优化提取方法,实现各种环境下镉离子的快速检测,提高该方法在复杂样品中的检测性能.参考文献1 MONDAL SC,SARMAB,FAROOQM,etal.Cadmiumbioavailability in acidic soils under bean cultivation:Role of soiladditivesJ.International Journal of Environmental Science andTechnology,2020,17:153160.2 LI S,ZHANG C C,WANG S N,et al.Electrochemical microfluidicstechniques for heavy metal ion detectionJ.Analyst,2018,143:4 2304 246.3 BANSOD B,KUMAR T,THAKUR R,et al.A review on variouselectrochemical techniques for heavy metal ions 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