基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制.pdf

第 卷 第 期邵阳学院学报（自然科学版）年 月 （）文章编号：（）基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制侯凯，何淼，郭新星，秦旭平（南华大学附属第二医院 临床研究中心，湖南 衡阳，；晋城大医院 新生儿科，山西 晋城，；南华大学 药学院药物药理研究所，湖南 衡阳，）摘要：目的利用网络药理学方法探索延胡索（）治疗心绞痛的主要有效成分和作用靶点，为阐明延胡索药理作用机制提供参考。方法利用 、数据库，参考有关文献收集延胡索防治心绞痛的活性成分和交叉靶点；再利用 软件，建立延胡索有效成分和心绞痛共同作用靶点的网络图；数据库进行 网络的生成与分析。采用 数据库进行 分析、通路富集分析；结合 软件和 软件进行分子对接验证其作用靶点。结果共获得 个延胡索有效成分和 个靶点与治疗心绞痛相关，这些靶点包括细胞外间隙组分、酶体系、肿瘤坏死因子等信号通路等。分子对接表明，所筛选出的延胡索主要有效成分与核心作用靶点均有良好的亲和力，结合能较低。结论延胡索多种成分与机体内多个信号通路、多个靶点相互作用是其治疗心绞痛的重要作用机制。关键词：延胡索；心绞痛；网络药理学；分子对接中图分类号：文献标志码：，（，；，；，）：本文共同第一作者收稿日期：基金项目：南华大学博士启动基金（）；南华大学归国人员科研启动基金（）作者简介：侯凯，男，助理研究员，硕士，从事心血管药理学研究；：通信作者：秦旭平，男，教授，博士，硕士研究生导师，从事心血管药理学方面的研究；：邵阳学院学报（自然科学版）第 卷 ：，：；心绞痛（）是由于冠状动脉供血不足导致心肌暂时性缺血缺氧所引起的临床综合征，以胸骨部短暂性疼痛和胸部不适为主要症状 。心绞痛的发生率一般与年龄呈正相关，最近有研究显示，因作息方式不佳和工作压力的不断增大，导致心血管方面的疾病发生率不断攀升 。目前，临床上治疗心绞痛首选药物治疗，如舌下含服硝酸甘油，服用硝苯地平等，如果药物治疗不能达到预期的效果，可以选择经皮冠状动脉介入治疗或者冠状动脉旁路移植 。植物延胡索（）是一种常见的中草药。延胡索属于罂粟科紫堇属，被用于入药治病已有近千年的历史，有止痛、活血、利气的作用 。长期以来，对于中药治疗疾病的机制是按照独特朴素中医理论来解释，缺乏可视化现代化医学理论支撑。迄今从延胡索中分离出的化学成分已达 余种 。现代医学研究表明，延胡索具有抑制疼痛、稳定情绪、安神、扩张冠状动脉、保护心肌缺血等多种药理作用 ，但其分子药理作用机制尚不完全清楚。网络药理学融合系统生物学、生物信息学、网络科学等学科，从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与治疗对象之间的分子关联，对揭示中药物的多成分、多靶点的系统性或整体性治疗作用机制 以及正确使用药物、发明新药物等有重要意义 。本研究通过网络药理学及分子对接技术，探索延胡索治疗心绞痛的有效成分和作用靶点，为其临床应用及其潜在的作用机理提供新的理论依据。材料与方法 延胡索有效成分的筛选及对应靶点的获取通过 数据库（：），获得延胡索的所有活性化合物，并设定其过滤条件，即口服生物利用度（，）大于等于 ，类药性（，），并根据延胡索治疗心绞痛的相关文献，筛选出其全部有效第 期侯凯，何淼，郭新星，秦旭平：基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制 成分信息及对应有效成分的靶点。利用 数据库（：），将延胡索有效成分的靶点进行规范化，然后将有效成分的靶点名称转换为基因名，将 数据库中无法找到的靶点进行剔除，最后对转换后的靶点进行去重。心绞痛疾病靶点的获取借助 数据库（：），找到与心绞痛疾病相关的靶点，在搜索栏中输入检索词“”，导出检索出的疾病靶点信息。延胡索与心绞痛共有靶点的获取利用 平台（：），找到延胡索有效成分靶点和心绞痛疾病靶点之间的相同靶点，即交集靶点。将药物靶点和疾病靶点分别复制粘贴到两个列表中，点击相交的区域部分，得到交集靶点，绘制并保存 图。药物成分 疾病 靶点网络图的建立结合延胡索有效成分与心绞痛的交集靶点，建立延胡索有效成分、心绞痛疾病及交集靶点数据的 文件和 文件，并在 软件中点击“”，再按“”，分别将上述 个文件导入该软件中，构建出延胡索有效成分、心绞痛疾病及交集靶点的网络图，并对延胡索有效成分、心绞痛和靶点之间的相互作用关系进行网络可视化。蛋白质互作（，）网络的构建将延胡索与心绞痛的交集靶点复制粘贴到 数据库（：）的列表中，选择“多种蛋白质”，选定物种为“人”，下载并保存 文件，通过 软件对该文件进行网络分析和处理，构建 网络图，并使用“”插件进行网络拓扑参数分析，以度（）中心性（，）、接近中心性（，）、中介中心性（，）项指标都大于平均数作为筛选指标，在筛选出的靶点中选择前 个靶点作为关键靶点。在此基础上，利用 软件中的插件 对 网络中的子模块进行筛选，筛选条件为 ，。基因本体（，）分析和京都基因与基因组百科（，）通路富集分析利用 （：）数据库，对交集靶点进行 分析和 通路富集分析，分析包含生物过程（，）、分子功能（，）、细胞组分（，），根据 值（）和错误发现率（，）对 、和信号通路进行筛选和分析。分子对接从 数据库中下载延胡索有效成分的 结构信息，并将其作为 文件形式保存，然后在 数据库（：）的检索栏中输入核心靶点，以物种为“”，分辨率较低，方法为 衍射为筛选准则，同时结合与心绞痛相关的分子对接文献，筛选并下载核心靶点的 晶体结构信息，以 格式保存，然后将其导入 软件，通过 软件对靶蛋白质受质体进行移除水分子和删除配体等操作，最后 邵阳学院学报（自然科学版）第 卷采用 软件来完成分子对接，在软件中计算出延胡索有效成分与关键核心靶点之间的结合能，利用 软件进行结果的可视化分析和处理。结果 延胡索有效成分的筛选及对应靶点将检索词“延胡索”输入在 数据库中，共获得 种化学成分，通过 、的条件筛选，在 数据库中查找延胡索化学成分所涉及到的相关疾病，最终筛选得到 个与心绞痛相关的延胡索有效成分。另外，根据文献中关于心绞痛和延胡索方面的研究，增加了 个与心绞痛有关的延胡索有效成分，最后获得 种延胡索有效成分，包括槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱等，如表 所示。然后在 数据库中获取以上 个有效成分的对应靶点，共得到 个靶点，通过 数据库将靶点的蛋白质名称进行转换，将数据库中匹配不到的靶点进行删除后，得到 个靶点，最后删除以上靶点中相同的靶点，最终得到延胡索有效成分的靶点 个。表 延胡索有效成分表 编号中文名称英文名称 小檗碱 黄连碱 二氢白屈菜红碱 紫堇碱 甲基 （，四甲氧基 菲基）乙基 胺 （，）去氢紫堇单酚碱 甲基去氢紫堇单酚碱 异托林 甲基巴马士宾 甲基樟苍碱 诺格拉辛 巴马汀 槲皮素 延胡索乙素 心绞痛疾病靶点通过 数据库，得到与心绞痛疾病相关的靶点 个。延胡索与心绞痛共有靶点将延胡索有效成分的 个靶点和心绞痛疾病的 个靶点输入到 平第 期侯凯，何淼，郭新星，秦旭平：基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制 台中，对以上靶点进行取交集操作，最终获得相同的靶点 个，见图 。图中延胡索有效成分靶点和心绞痛疾病靶点相交的部分即为交集靶点。图 延胡索有效成分靶点和心绞痛疾病靶点 图 药物成分 疾病 靶点网络图的构建利用 软件，对 个延胡索有效成分和 个交集靶点建立延胡索有效成分、心绞痛疾病和靶点网络图（图 ）。该图包括 个节点（个药物，个疾病，个有效成分，个交集靶点）和 个边，其中交集靶点为菱形，延胡索有效成分为圆形，疾病为三角形，药物为箭头。在网络图中，值越高，节点就越大，根据 值筛选出排名前 的延胡索有效成分，从图 中可以看出，排名前 位的延胡索主要有效成分分别是槲皮素（）、延胡索乙素（）、紫堇碱（）、异托林（）、诺格拉辛（），说明以上 种成分在治疗心绞痛的过程中发挥重要作用。图 延胡索 心绞痛靶点网络图 邵阳学院学报（自然科学版）第 卷 网络的构建将 个交集靶点输入到 数据库中，进行 网络分析，去除网络中游离的节点，设置最大置信度为 ，用 格式文件输出分析结果，利用 软件对 文件进行了网络可视化分析。结果如图 所示，该网络由 个节点和 条边组成，每一个节点都是一个交集靶点，每一条边表示靶点之间的相互作用关系。节点的圆圈大小和颜色的深浅，与靶点的 值呈正比；边线条越粗，颜色越深，则表示靶点之间的相互作用关系越强烈。接着，利用“”插件对该网络进行了拓扑参数分析，并对其进行数据处理，计算得出该网络中节点的 平均数为 ，平均数为 ，平均数为 。在网络中，、均大于平均数的排名前 位靶点依次是 、（表）。另外，利用 软件中的插件 对 网络进行分析，得出了起核心作用的 个主要的子模块（图 ，表 ）。图 延胡索和心绞痛交集靶点的 网络 表 核心靶点信息 靶点 注：为度中心性；为接近中心性；为中介中心性。分析和 通路富集分析 分析用 数据库对 个交集靶点进行 分析，根据 ，进行筛选，第 期侯凯，何淼，郭新星，秦旭平：基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制 结果显示，得到的生物过程有 个，细胞组分有 个，分子功能有 个。选取 个类别中 值最低的评分前 条（图）。从图中可以看出，延胡索对心绞痛的作用主要涉及对药物的反应、正调控 聚合酶 启动子的转录、模板等生物过程；包含细胞质、细胞外间隙、膜筏等细胞组分；参与 聚合酶 转录因子活性、酶结合、蛋白质结合等分子功能。这些结果提示，延胡索可能通过多种作用途径治疗心绞痛，对心绞痛的治疗有一定的影响。图 基于 的 模块 表 网络聚类分析结果 类簇靶点节点数边数聚类评分 、通路富集分析采用 数据库，对 个交集靶点进行 通路富集分析，根据 ，进行筛选，结果显示共有 条通路，对信号通路按顺序排列，选择 值最低的排名前 条信号通路制作条形图（图 ）。从图中可以看出，延胡索对心绞痛的治疗主要包括 信号通路、信号通路、信号通路、肿瘤坏死因子信号通路，且与非小细胞肺癌、膀胱癌、乙型肝炎相关的信号通路有关。这表明延胡索治疗心绞痛是通过多条信号通路发挥药理作用的。邵阳学院学报（自然科学版）第 卷图 功能注释气泡图，从上至下依次为生物过程、细胞组分、分子功能 ，第 期侯凯，何淼，郭新星，秦旭平：基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制 图 延胡索治疗心绞痛的 通路富集分析条形图 分子对接结果分子间的对接使用 软件来进行操作。在 数据库中筛选出关键核心靶点，受体蛋白的 编号为 ，受体蛋白的 编号为 ，受体蛋白的 为 。通过对 个核心靶点和延胡索的 个有效成分进行分子对接，计算出了有效成分与受体蛋白 、之间的最低结合能，对接结果见表 。如果结合能小于零，则表示有效成分能与受体蛋白自发地结合，而且它们之间的结合能愈小，表示其对接结果愈佳，受体与配体间的亲和力越大，结合构象越稳定。从表格中可以看出，槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱、异托林、诺格拉辛与 、的结合能均为负值，所以，延胡索的 个有效成分与 个关键核心靶点的结合能都比较好，均有较优良的结合活性，其中，与槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱和诺格拉辛的结合构象更稳定，对它们进行可视化处理，见图 。表 延胡索有效成分和核心靶点的结合能预测 编号延胡索有效成分结合自由能（）槲皮素（）延胡索乙素（）紫堇碱（）异托林（）诺格拉辛（）邵阳学院学报（自然科学版）第 卷（）为靶点 与有效成分槲皮素的分子对接；（）为靶点 与有效成分紫堇碱的分子对接；（）为靶点 与有效成分延胡索乙素的分子对接；（）为靶点 与有效成分诺格拉辛的分子对接图 分子对接图 讨论心绞痛是一种急性心脏疾病，中医治疗常采用“活血化瘀”法、“芳香温通”法和“祛痰通络”法 。延胡索具有治疗血中气滞、气中血滞、气血不畅等功效，对身体各个部位的气滞血瘀均有较好的治疗效果，其中，延胡索的止痛作用更是被历代医学家称赞。等 的研究表明，延胡索的提取物具有良好的抑制疼痛作用，特别是治疗急性伤害性疼痛、急性炎症和神经性疼痛。迄今为止，从延胡索中提取到的化合物已达 余种，延胡索的主要活性成分为生物碱，包括叔胺碱和季胺碱 ，本研究利用 数据库对其进行分析，共筛选获得了 种延胡索的化学成分。通过 数据库筛选和文献查阅，最后获得 种 延 胡 索 有 效 成 分 与 心 绞 痛 相 关，包 括 槲 皮 素（）、延 胡 索 乙 素（）、紫堇碱（）、异托林（）、诺格拉辛（）等。种延胡索有效成分与心绞痛相关靶点有 个。并利用 软件，使成分与疾病交集靶点进一步可视化。这些结果进一步解释了他人的研究成果，比如对槲皮素对心血管作用 ，延胡索乙素的抗心律失常、保护心肌等心血管功能 。另外，本文还预测了紫堇碱、异托林、诺格拉辛等对心绞痛也可能具有良好的疗效，这有待于今后研究证实。通过对交集靶点进行 网络的构建与分析，并根据相关文献报道，归纳出了延胡索在抗心绞痛方面作用最显著的几个核心靶点，包括 、等。并通过相关指标显示出靶点之间相互作用关系的强弱。其他学者研究发现，原癌基因编码的蛋白质 和 是激活蛋白 （）的主要组成部分，在细胞的增殖、存活、凋亡、分化以及炎症等多种细胞过程中有关键影响 。可以调节血管粥样硬化的形成并减轻病变的进展过程，还能使血管粥样硬化的斑块保持稳定。是一类丝裂原活化蛋白激酶，是一种能够将细胞表面的信号转导到细胞核里面的关键因子。目前，在哺乳动物中，已经发现了 种 ，通路是促进细胞生长、产生应激反应、炎症反应、细胞转化和凋亡等信号通路的共同作用的通路之一。通路参与了 和 的基因转录和激活 。是一种丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶 家族。它是 第 期侯凯，何淼，郭新星，秦旭平：基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制 信号通路的关键因子，参与细胞的增殖、生长和凋亡的重要分子 ，该通路也参与了冠心病的病理形成过程 。等 研究发现，在部分磷酸酯蛋白的作用下会与激发 收缩偶联连接，从而影响心肌细胞的新陈代谢、生长和存活。基因的缺失则会导致血管内皮细胞（，）的功能紊乱，从而引起血管平滑肌细胞（，）在血管中的迁移和存活的变化，同时也对冠状动脉阻塞和动脉粥样硬化有促进作用，还会导致斑块的脱落，对心血管疾病产生不可逆转的影响 。除此之外，通过对 网络进行聚类分析，得到了 个得分较高的子模块，其中，得分最高即作用最显著的子模块 包含 、等，而这些基因与炎症，细胞凋亡有关，从而进一步表明，延胡索抗心绞痛的作用机制可能是通过调控细胞的凋亡与炎症反应来达到治疗效果的，这些结果符合本研究预测结果。通过 通路富集分析发现，延胡索对心绞痛的治疗作用涉及 信号通路、信号通路、信号通路、信号通路等。信号通路 可以通过直接减少下游调节细胞凋亡和存活的靶点，从而保护心肌细胞，抑制凋亡，并通过磷酸化 蛋白亚型，使其转录活性降低，间接阻止细胞的凋亡 。是血管内皮生长因子，参与血管内皮细胞的增殖、迁移以及血管的形成，它可以通过调节 信号通路来防止斑块形成，从而维持斑块的稳定 ，等 通过研究发现，哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（）的过表达，可以诱导 升高 ，进而促进内皮细胞的增殖，促进血管的生成。肿瘤坏死因子（）是一种具有多种作用效果的细胞因子，它可以通过多条信号通路来调节炎症反应和细胞凋亡。信号通路被激活后，可导致血管平滑肌细胞受损，从而对斑块的稳定性造成损害，信号通路还参与动脉粥样硬化的产生和发展 。等 的研究表明，可以激活肿瘤坏死因子受体 （），进而激活 的活性，提高 启动子的活性。信号通路也参与了心血管疾病的产生和进展，是一个异二聚体，由 和 两个亚基构成，其中 亚基起重要作用。在细胞轻度缺氧状态下，通过对细胞凋亡的抑制来保护心肌细胞；在细胞严重且长时间缺氧的情况下，可通过诱导细胞凋亡的方式来降低其对周围心肌细胞带来的损伤 。以上结果表明，延胡索对心绞痛的治疗作用与多种信号途径有关，如炎症反应、免疫反应、氧化应激反应、细胞凋亡代谢等。本研究对 个关键核心靶点与 个延胡索有效成分进行了分子对接验证，结果表明，在有效成分与关键核心靶点的对接中，与紫堇碱、诺格拉辛、槲皮素、延胡索乙素均存在较强的结合作用，它们之间的结合能均小于 ，这说明它们之间的分子对接结合构象相比其他成分与靶蛋白的分子对接构象更稳定。由此可知，尽管目前缺乏相关文献报道，但进一步研究紫堇碱、诺格拉辛对心绞痛治疗效果实属必要。综上所述，本研究采用网络药理学方法，证明延胡索是通过多种有效成分、多个作用靶点、多条信号通路的方式来治疗心绞痛，涉及到炎症反应、细胞凋亡代谢等一系列生物过程。延胡索的 个潜在有效成分（槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱、异托林、诺格拉辛）与心绞 邵阳学院学报（自然科学版）第 卷痛的 个重要靶点（、）相互作用是延胡索抗心绞痛的主要作用机制，以上分析结果可为解释延胡索抗心绞痛药理作用提供了现代医学理论依据。参考文献：王朝平，罗晶，曹美芳，等“冰片 郁金”药对挥发油成分治疗心绞痛作用机制的网络药理学研究 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