基于网络药理学及实验验证探讨甘草苷治疗帕金森病的作用机制.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究基于网络药理学及实验验证探讨甘草苷治疗帕金森病的作用机制曲欣妮，李文标，王利，沈隽吉，殷宇晴，徐缘博，何建成，许言午（上海中医药大学基础医学院生物化学教研室，上海中医药大学基础医学院中医诊断教研室，上海市健康辨识与评估重点实验室 上海 201203）摘要：目的应用网络药理学方法预测和分析甘草苷治疗帕金森病的作用机制，并选取凋亡信号通路进行细胞水平实验验证。方法从 BATMAN-TCM、PharmMapper、SEA、SuperPred、SwissTargetPrediction等数据库获取甘草苷的作用靶点，从OMIM、GeneCards、CTD等数据库获取帕金森病相关基因。将甘草苷的预测靶点和帕金森病相关基因取交集，通过Cytoscape软件利用交集靶点构建“药物-靶点-疾病”网络并进行可视化；运用Cytoscape软件的BisoGenet插件对交集靶点构建PPI网络，通过CytoNCA插件进行拓扑学计算并经度中心性（Degree centrality，DC）和中介中心性（Between centrality，BC）两步筛选获得核心PPI网络；采用R软件运行Bioconductor程序包进行GO和KEGG富集分析；运用Cytoscape软件构建“基因-通路”网络，筛选出网络的关键靶点，并将其与甘草苷进行分子对接；采用Western blot方法验证甘草苷对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）诱导的 SH-SY5Y细胞 Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-PI3K和 p-AKT等凋亡通路关键蛋白表达与活化的调控作用。结果共获得甘草苷靶点343个，帕金森病相关基因1328个，二者交集靶点为46个；经拓扑学分析获得核心PPI网络，包含108个节点和2298条边；GO功能分析得到的1543个条目主要与凋亡调控、细胞周期与节律、DNA合成及分解代谢有关；凋亡、PI3K-AKT、NF-B、TGF-、HIF-1、FoxO等97条KEGG信号通路被显著富集；“基因-通路”中筛选的关键蛋白及分子对接结果显示TP53、AKT1及RELA可能是甘草苷治疗帕金森病的关键靶点；Western blot结果显示，与6-OHDA组相比，给与甘草苷处理后Bax和Cleaved-Caspase-3的表达水平明显减少（P0.05），Bcl-2的表达水平显著增加（P0.01）；p-PI3K和p-AKT磷酸化水平明显增多（P74和BC600依次筛选获得核心PPI网络及核心网络基因。1.1.5GO功能分析与KEGG通路分析使用 R3.6.2 软件，利用 Bioconductor 的 org.Hs.eg.db，colorspace，stringi，DOSE，clusterProfile，pathview，ggplot2和limma等程序包，对核心网络基因进行基因ID 转换及 GO 功能分析和 KEGG 通路分析（校正 P0.05为标准）并进行结果的可视化。GO功能分析主要1690 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究包 括 生 物 过 程（Biological process，BP）、细 胞 组 分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3大类，分别选择三者中校正P值最小的前10个条目进行展示。由于网络药理学的分析结果须遵循概率论原则，应是本质上具有统计学意义的预测性结论，且结果的客观性和准确性必须通过实验加以验证。因此，本研究选择具有统计学意义、已知参与帕金森病发生发展的重要机制、与本实验室前期研究高度相关及目前领域内研究热点相关的条目进行可视化。因此，KEGG分析中选择感兴趣的15条显著富集的通路进行可视化。1.1.6“基因-通路”网络分析使用Cytoscape 3.7.2软件，导入前20条显著富集的KEGG通路及其相关的核心网络基因，构建“基因-通路”网络，并根据DC大小将它们进行可视化，以筛选甘草苷治疗帕金森病的关键靶点。1.1.7分子对接将甘草苷与“基因-通路”网络中值较大的关键靶点进行分子对接。从PubChem数据库下载甘草苷的SDF 结构，调用 OpenBabel 2.4.1 转化为 mol2 格式，使用AutodockTools 1.5.6打开配体小分子，并进行加氢、加电荷、检测配体等操作，并保存为 pdbqt 文件。靶点的三维结构从RCSB Protein Data Bank 数据库下载 得 到，作 为 对 接 所 用 的 受 体 蛋 白 源 文 件。在AutodockTools1.5.6中打开通过添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后，将其定义为受体并保存成pdbqt文件。采用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，选取affinity最佳的构象，作为最终的对接构象。选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用PyMOL作图。1.2甘草苷治疗帕金森病的实验验证1.2.1细胞株SH-SY5Y（人神经细胞母细胞瘤细胞）细胞株（PWE-HU026）购自大连美仑生物科技有限公司。1.2.2主要药品、试剂及仪器6-OHDA（J1110A）、L-抗坏血酸钠（D121212A）、DMEM/F12培养基（PWL005）购自大连美仑生物技术公司；甘草苷（B20414），购自上海同田生物技术有限公司；胰酶（25200056），胎牛血清（04-001-1a），购自Gibco公司；MTT（MC2128），购自Biosharp白鲨生物科技公司；青霉素和链霉素溶液（60162ES76）购自上海中韬生物科技有限公司；一抗抗体-actin（66009-1-l g）、Caspase-3/p17（19677-1-AP）、Bcl2（12789-1-AP）、Bax（50599-2-l g），均购自Proteintech抗体公司；HRP标记的羊抗兔二抗抗体（HA1001）购自杭州华安生物技术有限公司。光学显微镜（DGX-9003B）、多功能酶标仪（Gene.Company.Limited 公司、型号 BioTek.Synergy.2）、高速离心机（Eppendorf、型号 Centrifuge 5417R）、垂 直 电 泳 仪 及 转 膜 仪（Bio-Rad、货 号043BR41664）、化学发光仪（美国 Protein Simple、92-15312-00（220）。1.2.3细胞培养用含有10%的胎牛血清及1%双抗（青霉素和链霉素溶液）的DMEM/F12培养基，置于5%CO2、37恒温培养箱培养SH-SY5Y细胞。当细胞汇合度达80%-90%时，PBS清洗1次后，加入0.25%胰酶消化传代或接种到96孔板进行培养处理。1.2.4帕金森病细胞模型建立避光称取6-OHDA溶于PBS，加入0.3%抗坏血酸钠，配成 5 mmolL-1 6-OHDA 储液-20避光保存备用。取对数生长期的 SH-SY5Y细胞按 1104个/孔接种至96孔板，培养16 h。分别用含不同浓度6-OHDA（10 molL-1、20 molL-1、30 molL-1、40 molL-1、50 molL-1、60 molL-1、70 molL-1、80 molL-1、90 molL-1、100 molL-1）的无血清 DMEM/F12培养基处理细胞24 h。使用MTT法检测细胞活力，选择细胞50%存活率对应的6-OHDA浓度，即半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）作为模型浓度。1.2.5实验分组及甘草苷干预称取甘草苷溶于 DMSO，配成 100 mmolL-1甘草苷溶液，-20保存备用。实验分为正常组、模型组、溶剂对照组及给药组，设为6个复孔。按前述方法接种细胞，用不同浓度的甘草苷溶液（20 molL-1、40 molL-1、60 molL-1、80 molL-1、100 molL-1）与6-OHDA共处理细胞，作为给药组。同时用相同浓度的甘草苷直接作用于正常细胞，观察其对细胞的毒副及促增殖作用。培养箱孵育24 h后用MTT法测定各组细胞活力，选择甘草苷发挥最佳保护作用且无明显毒性和促增殖作用的浓度作为后续实验的用药剂量。1.2.6MTT法测定细胞活力将细胞悬液按1104个/孔接种至96孔板，同时设1691 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 置空白对照孔。给药处理结束后，按每孔体积比培养基：MTT（5 mgmL-1）=100:15以换液的形式加入MTT，孵育4 h。吸去上清，按每孔100 L加入DMSO，溶解生成的甲臜颗粒。用酶标仪在570 nm的波长下测定吸光度值（OD）。1.2.7Western blot法测定蛋白含量实验终点吸去培养皿中的培养基，用4预冷的PBS清洗2次。加入裂解液于冰上裂解细胞，细胞刮刮取细胞收集至EP管。4，14000 rpm离心15 min。取上清用BCA法进行蛋白定量，使各组蛋白上样质量为20 g，总体积为20 L。金属浴100加热10 min。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白，设置电压 80 V，40 min使蛋白从上层胶进入下层胶，后改用120 V，80 min使不同分子量的蛋白分离。转膜用孔径为 0.22 m 的 PVDF 膜，200 mA，70 min。5%脱脂牛奶作为封闭液室温封闭1 h。根据目的蛋白分子量大小剪膜，4 过夜孵育一抗：-actin（1 5000），Bax（1 5000），Bcl-2（1 2500），Caspase-3/P17（1 1000）。TBST 洗膜，室温孵育二抗1 h。TBST洗膜，使用ECL发光液进行显影成像。利用Image J软件对蛋白条带的灰度值进行分析。1.2.8数据处理及统计方法运用 GraphPad Prism 8 软件对实验数据进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，以P74的拓扑筛选，获得PPI子网络，该网络由560个节点和23205条边组成（图2B）。进一步按BC600筛选获得核心PPI网络，包括108个节点和2298条边（图2C）。甘草苷可能主要通过直接或间接调控这些核心网络基因发挥治疗帕金森病的作用。2.1.3GO功能分析结果对上述核心 PPI网络的108个靶蛋白进行 GO功能分析，共富集到1543个GO条目（校正P0.05）。其中，BP有1291个条目，主要包括凋亡调控、DNA合成及分解代谢过程、RNA分解代谢过程和细胞周期、节律；CC有112个条目，主要有核染色质、粘着斑、细胞-底物黏合连接；MF有140个条目，涉及泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合和磷酸酶结合等。各类别校正P值最小的前10个富集结果进行可视化，如图3所示。核心靶点可能通过上述过程介导甘草苷对帕金森病的治疗。2.1.4KEGG通路分析结果为进一步阐释甘草苷治疗帕金森病的作用机制，对核心PPI网络的108个靶蛋白进行KEGG通路分析。共得到97条富集结果（校正P0.05），部分通路如图4所示，包括凋亡、PI3K-AKT、NF-B、TGF-、FoxO、HIF-1等相关信号通路。提示这些通路相互调节，协同参与甘草苷帕对金森疾病的治疗。2.1.5“基因-通路”网络分析结果使用前 20 条通路及其相关的 70 个基因构建了“基因-通路”网络（图5A）。图中的橘色矩形表示基因，红色V形表示通路。节点形状的大小与节点的连接度成正比。其中TP53、AKT1、RELA具有最高的连接度，分别参与了16、14、12条信号通路，表明它们可能是甘草苷治疗帕金森病的关键靶点。2.1.6分子对接结果将甘草苷与“基因-通路”网络中“degree”值较大的前 3 个基因 TP53（degree=16）、AKT1（degree=14）及RELA（degree=12）进行了分子对接，结果见图5B。从图1甘草苷治疗帕金森病潜在靶点获取与“药物-靶点-疾病”网络构建注：Liquirtin：甘草苷；Parkinsons disease（PD）：帕金森病。1693 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 图2甘草苷治疗帕金森病潜在靶点PPI网络构建及核心网络筛选注：A：交集靶点初级PPI网络；B：次级PPI子网络；C：核心PPI网络。图3核心靶点的GO功能分析柱状图注：根据校正P0.05，各类别前10条富集的GO条目；横坐标表示富集分类及条目名称；表示该条目富集的基因数目。Biological Process（BP）：生物学过程；Cellular Component（CC）：细胞组分；Molecular Function（MF）：分子功能。1694 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究图5“基因-通路”网络图及甘草苷与关键靶点的分子对接注：A：“基因-通路”网络。橘色矩形表示基因，红色V形表示通路。形状的大小和与之相连边的数目成正比。B：甘草苷与关键靶点的分子对接。甘草苷采用紫色棍棒模型表示，蛋白分子采用绿色卡通模型表示。图4核心靶点的KEGG通路分析条图注：校正P0.05的15条KEGG条目，横坐标表示P值，黑色圆点代表核心靶点在通路中被富集的基因数目。1695 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 图可以看出，甘草苷在TP53、AKT1及RELA的活性口袋中呈现出紧凑的结合模式，甘草苷与它们形成氢键作用，使得蛋白与甘草苷形成稳定的复合物。一般认为结合能-5.0 kcalmol-1说明两者可以结合，结合能-7.0 kcalmol-1说明有较好的结合能力。由表 1可以看出，甘草苷与AKT1有很好的结合能力，与TP53和RELA亲和力也接近-7.0 kcalmol-1，进一步证明了网络药理学预测的可靠性。2.2实验验证结果2.2.16-OHDA损伤SH-SY5Y模型建立结果显示，随着 6-OHDA浓度的增加，SH-SY5Y 细胞存活率逐渐降低。与正常组相比，各剂量组均具有显著性差异（P0.001）（图6A，表2）。IC50曲线图显示6-OHDA对SH-SY5Y细胞的半数抑制浓度为50.77 molL-150 molL-1（图6B），故选定此浓度为模型浓度。2.2.2甘草苷对6-OHDA损伤细胞存活的影响结果显示，甘草苷可以剂量依赖地保护6-OHDA损伤细胞（P0.01或 P0.0001），并在 100 molL-1处发挥最佳的保护效果（图 6C，表 3）。进一步的实验表明，各浓度甘草苷对正常细胞无明显的毒性和促增殖作用（图 6D，表 4）。因此在本研究的量效范围内，选定 100 molL-1作为甘草苷的后续实验用药剂量。2.2.3甘草苷对凋亡相关蛋白表达的影响网络药理学的GO及KEGG分析结果均富集到凋亡相关生物学过程及信号通路，因此通过Western blot的方法对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表图6不同浓度6-OHDA对SH-SY5Y细胞存活的影响，以及不同浓度甘草苷对6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞的保护作用注：A：不同浓度6-OHDA对细胞存活的影响。与对照组相比，*P0.0001；B：6-OHDA对SH-SY5Y细胞的IC50曲线。C：不同浓度的甘草苷对6-OH-DA损伤细胞存活的影响。与对照组相比，*P0.01，*P0.05。表2不同浓度6-OHDA对SH-SY5Y细胞存活的影响（x s，n=8）组别Con6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA6-OHDA浓度（molL-1）-102030405060708090100Cell细胞存活率survival rate（Fold of Con）0.99740.05460.85380.0700*0.85550.0350*0.82090.0400*0.70380.0412*0.50980.0425*0.39740.0378*0.38800.0277*0.26190.0308*0.25730.0155*0.20330.0225*注：与对照组相比，*P0.001。1696 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究达/活化量进行分析，以验证甘草苷对它们的调控作用。如图 7A 所示，与正常组相比，模型组的 Bax、Cleaved-Caspase-3 表达明显升高（P0.05），Bcl-2 表达显著下降（P0.05）。而给以甘草苷处理后，与模型组相比，Bax、Cleaved-Caspase-3表达则明显减少（P0.05），Bcl2表达显著增加（P0.01）。2.2.4甘草苷对通路关键蛋白表达的影响如 7 所示，与正常组相比，模型组的 p-PI3K、p-Akt磷酸化水平明显降低（P0.05）。在给与甘草苷处理后，p-PI3K、p-Akt磷酸化水平显著提高（P0.01）。3 讨论 已有的研究表明，甘草苷具有抗氧化、抗凋亡的药理作用19-20，能够促进神经元生长和保护受损的神经细胞16-18。因此，甘草苷是一种治疗神经损伤相关性疾病十分有前景的化合物。然而其对神经退化性疾病帕金森病是否具有治疗作用尚未见报道。表3不同浓度甘草苷对6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞的保护作用（x s，n=10）组别Con6-OHDA6-OHDA+DMSO6-OHDA+Liquritin6-OHDA+Liquritin6-OHDA+Liquritin6-OHDA+Liquritin6-OHDA+Liquritin浓度（molL-1）-50-20406080100Cell 细胞存活率survival rate（Fold of Con）1.0000.08290.49050.0685*0.50950.04400.44700.02510.46080.04170.51760.03910.58160.0389&0.68610.0590&注：与对照组相比，*P0.01，与6-OHDA组相比，&P0.0001。表4Liquritin对SH-SY5Y细胞存活的影响（x s，n=6）组别ConCon+LiquritinCon+LiquritinCon+LiquritinCon+LiquritinCon+Liquritin浓度（molL-1）-20406080100Cell 细胞存活率survival rate（Fold of Con）1.0000.03191.0560.04451.0420.09361.0420.08510.97550.06770.99960.0793图7甘草苷对凋亡相关蛋白Bax、Bc12、Cleaved-Caspase-3，通路关键蛋白p-PI3K、p-Akt的表达及活化的影响注：各组间比较，*P0.05，*P0.01，*P0.001，ns表示无统计学意义。1697 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 因此，本研究运用网络药理学的方法分析了甘草苷治疗帕金森病的可能分子机制；并用6-OHDA诱导的帕金森病细胞损伤模型，验证了甘草苷神经元保护作用的有效性并对其对凋亡通路关键分子表达与活性的调控作用进行了初步验证。对甘草苷治疗帕金森病核心PPI网络基因的GO功能分析和KEGG通路富集分析的结果显示，GO功能富集条目主要包括凋亡调控、细胞周期与节律、DNA合成及分解代谢、RNA分解代谢、粘着斑、细胞-底物黏合连接；KEGG通路富集结果主要涉及凋亡、PI3K-AKT、NF-B、TGF-、HIF-1、FoxO等97条信号通路。并且由“基因-通路”网络筛选出的关键靶点 TP53、AKT1和RELA均与凋亡密切相关。多项研究结果表明：凋亡在多巴胺能神经元丢失过程中起到核心作用，抗凋亡是相关药物发挥对PD治疗作用的重要靶点和途径21-23。有关PD患者的尸检结果表明：Bax蛋白的存在及其向线粒体外膜的易位可能导致PD中多巴胺能神经元的死亡24-25。此外，在PD患者的SNpc多巴胺能神经元中发现了Caspase-3的活性增加26以及Caspase-8和Caspase-927-28的激活。-synuclein是散发性 PD 中路易小体的主要成分之一29-30，有研究表明，过表达-synuclein 可以通过激活 Caspase-9 和Caspase-3，在体内诱导凋亡杀死多巴胺能神经元。以上结果提示，对细胞凋亡的调控可能是甘草苷治疗帕金森病的重要机制。据此我们进行了关键靶点对接和对凋亡通路关键蛋白的实验验证。TP53/P53，是一种调节DNA稳定性、细胞正常生长、增殖和损伤修复的重要转录因子。细胞处于应激状态或损伤不可逆时，TP53会转移到线粒体，与Bcl-2结合并释放Bax/Bak形成线粒体通透性转换孔，导致细胞周期阻滞，继而引发凋亡或是衰老。p53过表达引起的线粒体功能障碍是帕金森病发生的重要因素31。AKT1 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于AKT家族蛋白（包括AKT1、AKT2及AKT3），催化众多细胞底物，参与多种信号通路的调节。在帕金森病模型中，AKT1的氧化修饰导致其去磷酸化，其激酶活性丧失，引起黑质致密部神经元变性32-33。研究表明，与无姿势不稳定的帕金森患者相比，姿势不稳定帕金森患者的抗凋亡基因 Akt-1 表达水平显著降低34。此外，AKT的激活依赖于 PI3K通路，并且 PI3K-AKT信号通路在本研究的KEGG通路分析中被显著富集，在“基因-通路”网络中，DC值最大（degree=18）。有研究表明，PI3K/AKT 信号通路在减少多巴胺能神经元凋亡，改善帕金森病模型小鼠的神经行为中发挥重要作用35-36。RELA/P65是NF-B的一个亚基,它和P53被SIRT1去乙酰化可以限制凋亡和炎症反应37。而降低p65的核表达，对鱼藤酮诱导的凋亡SH-SY5Y细胞具有保护作用38。大脑黑质纹状体的多巴胺能神经元凋亡是影响帕金森病发生发展的重要原因39。凋亡是一种程序性的细胞死亡模式，受多种信号分子调控，引发级联反应，导致细胞死亡。其中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白在凋亡的发生中扮演重要角色。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，是凋亡调控的核心分子。Caspase-3 是Caspase 家族成员之一，与其它家族成员 Caspase-2、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10和Caspase-12密切联系，共同参与凋亡的启动与执行。Caspase3作为凋亡执行分子，可以在Asp-28/Ser-29以及Asp-175/Ser-176处被剪切，转变为活化的p17大亚基和 p12 小亚基片段，最终形成活化形式的Cleaved-Caspase-340-41。Caspase-3 的活化决定了凋亡的最终进程。Bax 和 Bcl-2为 Bcl-2家族的重要成员，Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，两者通过控制线粒体通透性调节凋亡过程42。Bcl-2定位于线粒体外膜，抑制细胞色素C（Cytochromo C）从线粒体膜间隙释放至细胞质。Bax 则驻留于细胞质中，接受死亡信号后易位至线粒体中，促进细胞色素C的释放，导致Caspase激活引起细胞死亡。因此，Bax/Bcl-2蛋白比值增加通常反映凋亡的发生。本研究的实验部分，通过用6-OHDA建立SH-SY5Y细胞损伤模型，给予甘草苷处理后，与模型组相比，Cleaved-Caspase-3和 Bax的表达下调、Bcl-2上调、PI3K/AKT/NF-B通路关键蛋白磷酸化水显著增加，该结果与网络药理学预测、分子对接的结果高度一致，说明甘草苷保护受损的神经干细胞与其抗凋亡机制密切相关。这些实验结果表明，网络药理学方法的应用具有一定的可靠性和可行性，甘草苷可能通过调节PI3K/AKT/NF-B通路以及凋亡相关分子，抑制神经元凋亡来治疗帕金森病。此外，甘草苷还可能通过调节细胞周期、TGF-等信号通路治疗帕金森病。细胞周期在GO和KEGG富集分析结果中均有涉及，且在KEGG分析结果中拥1698 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究有最小的校正P值（校正P=1.2124e-10）。大量研究数据表明，在帕金森病和其他神经退行性疾病中，细胞周期调控相关基因表达水平显著改变，引起细胞周期调控能力失常，最终导致神经元死亡43-45。Esteras等46发现帕金森病患者永生化淋巴细胞的细胞周期活动的增强与细胞周期蛋白D3/CDK6复合物的活性增加有关，导致G1/S调节失控。TGF-是一种转化生长因子，在细胞的生长、发育和分化中起关键作用。TGF-/Smad3信号通路与帕金森病多巴胺能神经变性、多巴胺能轴突和树突减少以及-突触核蛋白聚集等病理特征有关47。研究表明，神经元TGF-信号转导缺失导致黑质纹状体变性，激活此信号则能减弱MPTP神经毒性48。综上所述，本研究综合网络药理学和部分实验验证的方法初步探讨了甘草苷治疗帕金森病可能的机制，发现其与凋亡调控、PI3K-AKT、NF-B等信号途径密切相关，并在细胞水平证明了甘草苷对6-OHDA诱导的帕金森病模型的凋亡抑制作用。上述结果说明甘草苷治疗帕金森病的过程是由多靶点、多途径共同参与的，为后续进一步详细阐明其药理作用机制提供了重要方向和参考。而网络药理学作为一门新兴且正在发展的学科也具有一定的局限性。首先是数据库靶点信息的准确性和全面性有待提高49；且不同的数据库数据收录差距大，数据相对独立、来源分散、整合难度较大50。其次是网络药理学技术只是定性地预测了药物成分和靶点，明确的药理作用还需要配合动物实验甚至临床试验来验证51。相信随着网络药理学和生物系统信息学技术的不断发展，利用网络技术发现中药复方中的有效成分，探索中药治疗疾病的作用机制，可以使中药在国际上得到更多的认可，在临床上灵活运用中药治疗疾病的前景将更加广阔。参考文献 21Kaur K,Gill J S,Bansal P K,et al.Neuroinflammation-A major cause for striatal dopaminergic degeneration in Parkinsons disease.J Neurol Sci,2017,381:308-314.2Toulorge D,Schapira A H V,Hajj R.Molecular changes in the postmortem parkinsonian brain.J 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