基于筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症的网络药理学分析及其对高尿酸细胞模型和高尿酸血症模型小鼠的治疗作用.pdf

第 50 卷 第 1 期2024年 1 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.1Jan.2024DOI：10.13481/j.1671587X.20240108基于筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症的网络药理学分析及其对高尿酸细胞模型和高尿酸血症模型小鼠的治疗作用刘丽1,2,黄林生3,赵永恒1,曹文洁1,2,钱永帅1,2,余惠凡1,2,李飞1,2（1.湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000；2 湖北医药学院 武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000;3.湖北省十堰市太和医院肝胆胰外科，湖北 十堰 442000）摘要 目的目的：基于网络药理学、分子对接和体内外高尿酸模型实验探讨筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症（HUA）的作用，阐明其活性成分的主要作用靶点和信号通路相关机制。方法方法：通过台湾中医药资料库、本草组鉴数据库、化学专业数据库、TargetNet 数据库、SwissTargetPrediction 数据库、GeneCards数据库、药物靶点数据库（TTD）、DrugBank 数据库、DisGeNET 数据库、人类在线孟德尔遗传（OMIM）数据库和 Venny数据库获取筒鞘蛇菰治疗 HUA 的潜在靶点；利用 STRING 数据库和 Cytoscape软件构建筒鞘蛇菰活性成分-预测靶点网络和蛋白-蛋白互作（PPI）网络，并进行拓扑分析筛选筒鞘蛇菰主要活性成分和核心靶点，采用 R 软件进行基因本体论（GO）功能和京都基因组与基因百科全书（KEGG）信号通路富集分析，采用 AutoDock Vina软件进行分子对接验证。NRK-52E细胞分为空白对照组、空白给药组、模型组和不同浓度（2.0、10.0 及 50.0 mol L1）圣草酚（EDT）组，模型组和不同浓度 EDT 组细胞采用腺苷诱导制备高尿酸细胞模型，采用高效液相色谱（HPLC）法检测各组细胞培养上清液中尿酸（UA）水平。雄性ICR小鼠随机分为空白对照组、空白给药组、模型组和 EDT 组，后 2组小鼠制备 HUA 模型，采用试剂盒检测各组小鼠血清中 UA、肌酐（Cr）和血尿素氮（BUN）水平；取小鼠两侧肾组织，称质量，计算各组小鼠肾脏指数；TUNEL染色法观察各组小鼠肾组织中细胞凋亡情况；Western blotting 法检测各组小鼠肾组织中蛋白激酶 B（AKT）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇 3-激酶（p-PI3K）、B 细胞淋巴瘤 2（Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax）和 基 质 金 属 蛋 白 酶 9（MMP-9）蛋 白 表 达 水平。结果结果：筛选得到筒鞘蛇菰 6种活性成分，涉 及 116 个 交 集 靶 点，14个核心靶点。富 集 分 析 得 到1 828个 GO 条目和 145条信号通路。分子对接结果，EDT 与 MMP-9具有较好的结合活性。高尿酸细胞实验，与空白对照组比较，模型组细胞中 UA 水平明显升高（P0.01）；与模型组比较，2.0、10.0和50.0 mol L1 EDT 组细胞中 UA 水平明显降低（P0.01）。与空白对照组比较，模型组小鼠血清中UA、Cr 和 BUN 水平及肾脏指数明显升高（P0.01）；与 模 型 组 比 较，EDT 组 小 鼠 血 清 中 UA、Cr和 BUN 水平及肾脏指数明显降低（P0.05或 P0.01）。与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中可见大量凋亡细胞；与模型组比较，EDT 组小鼠肾组织中凋亡细胞数明显减少。与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中 p-AKT/AKT 及 p-PI3K/PI3K比值和 Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P0.05或 P0.01），Bax和 MMP-9蛋白表达水平明显升高（P0.01）；与模型组比较，EDT 组小鼠肾组织中 p-AKT/AKT 及 p-PI3K/PI3K 比值和 Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P0.05 或 P0.01），Bax 和MMP-9蛋白表达水平明显降低（P0.01）。结论结论：筒鞘蛇菰活性成分 EDT 具有降 UA 作用，且可能通过激活 PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡并缓解肾损伤。关键词 网络药理学；筒鞘蛇菰；圣草酚；高尿酸血症；肾损伤中图分类号 R285.5；R589.7 文献标志码 A文章编号 1671587X(2024)01005813收稿日期 20230212基金项目 湖北省卫健委青年人才项目（WJ2021Q010）；湖北省教育厅重点项目（D20192101）作者简介 刘 丽（1997），女，河南省鹿邑县人，在读硕士研究生，主要从事肾脏系统药理学方面的研究。通信作者 李飞，教授，硕士研究生导师（E-mail：）58刘丽，等.基于筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症的网络药理学分析及其对高尿酸细胞模型和高尿酸血症Network pharmacological analysis on Balanophora involucrata Hook.f.in treatment of hyperuricemia and its therapeutic effect on hyperuricemia cell model and hyperuricemia model mouseLIU Li1,2,HUANG Linsheng3,ZHAO Yongheng1,CAO Wenjie1,2,QIAN Yongshuai1,2,YU Huifan1,2,LI Fei1,2（1.College of Pharmaceutical Sciences，Hubei Medical College，Shiyan 442000，China；2.Key Laboratory of Wudang Local Chinese Medicine Research，Hubei Medical College，Shiyan 442000，China；3.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Taihe Hospital，Shiyan City，Hubei Province，Shiyan 442000，China）ABSTRACT Objective：To investigate the efficacy of Balanophora involucrata Hook.f.in treatment of hyperuricemia（HUA）based on network pharmacology，molecular docking，and hyperuricemia models in vivo and in vitro，and to clarify the main targets of its active components and related signaling pathway mechanism.Methods：The potential targets of Balanophora involucrata Hook.f.in treatment of HUA were identified by Databases such as the Traditional Chinese Medicine Database in Taiwan，the Chinese Herbal Medicine Identification Database，Professional Chemical Database，TargetNet Database，SwissTargetPrediction Database，GeneCards，Therapeutic Target Database（TTD），DrugBank Database，DisGeNET Database，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）Database，and Venny Database.STRING Database and Cytoscape software were used to construct the active component-predictive target network and protein-protein interaction（PPI）network for Balanophora involucrata Hook.f.；topological analysis was used to select the main active components and core targets；Gene Ontology（GO）functional and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）signaling pathway enrichment analysis were performed by R software；AutoDock Vina software was used for molecular docking validation.The NRK-52E cells were divided into blank control group，blank administration group，model group，and different concentrations（2.0，10.0，and 50.0 mol L1）of erythrodiol（EDT）groups.High-performance liquid chromatography culture（HPLC）was used to detect the uric acid（UA）levels in the cell culture supernatants in various groups.The male ICR mice were divided into blank control group，blank administration group，model group，and EDT group；the mice in the last two groups were used to prepare the HUA models；kits were used to detect the levels of UA，creatinine（Cr），and blood urea nitrogen（BUN）in serum of the mice in various groups；the bilateral kidney tissue of the mice was harvested and weighed；the kidney indexes of the mice in various groups were calculated；TUNEL staining was used to observe the apoptosis in kidney tissue of the mice in various groups；Western blotting method was used to detect the expression levels of protein kinase B（AKT），phosphorylated AKT（p-AKT），phosphoinositide 3-kinase（PI3K），phosphorylated PI3K（p-PI3K），B-cell lymphoma-2（Bcl-2），Bcl-2-associated X protein（Bax），and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）proteins in kidney tissue of the mice in various groups.Results：Six active components of Balanophora involucrata Hook.f.were identified，involving 116 intersecting targets and 14 core targets.The enrichment analysis yielded 1 828 GO terms and 145 signaling pathways.The molecular docking results showed that EDT had good binding activity with MMP-9.The high uric acid cell experiment results showed that compared with blank control group，the UA level in the cells in model group was significantly increased（P0.01）；compared with model group，the UA levels in the cells in 2.0，10.0，and 50.0 mol L1 EDT groups were significantly decreased（P0.01）.Compared with blank control group，the levels of UA，Cr，and BUN in serum of 59第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）the mice in model group were increased（P0.01），and the kidney indexes were significantly increased（P0.01）；compared with model group，the levels of UA，Cr，and BUN in serum of the mice in EDT group were decreased（P0.05 or P0.01），and the kidney index was significantly decreased（P0.05 or P0.01）.Compared with blank control group，the number of apoptotic cells in kidney tissue of the mice in model group was increased；compared with model group，the number of the apoptotic cells in kidney tissue of the mice in EDT group was significantly decreased.Compared with blank control group，the ratios of p-AKT/AKT and p-PI3K/PI3K and expression level of Bcl-2 protein in kidney tissue of the mice in model group were significantly decreased（P0.05 or P0.01），while the expression levels of Bax and MMP-9 proteins were significantly increased（P0.01）；compared with model group，the ratios of p-AKT/AKT and p-PI3K/PI3K and expression level of Bcl-2 protein in kidney tissue of the mice in EDT group were significantly increased（P0.05 or P0.01），and the expression levels of Bax and MMP-9 proteins were significantly decreased（P0.9 为遴选60刘丽，等.基于筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症的网络药理学分析及其对高尿酸细胞模型和高尿酸血症条件进行潜在靶点预测，利用 Uniprot（http：/www.uniprot.org）数据库剔除非人源的潜在靶点。1.2 HUA 疾 病 靶 点 和 交 集 靶 点 获 取疾 病 靶 点 和 交 集 靶 点 获 取 以“hyperuricemia”和“gout”为 关 键 词，通 过DisGeNET 数据库、药物靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD）、GeneCards 数 据 库、DrugBank 数据库和人类在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数 据 库 进行检索、汇总和去重后得到与 HUA 相关的靶点。分别将筒鞘蛇菰活性成分靶点及 HUA 疾病靶点输入 Venny 2.1.0 数 据 库（https：/b.csic.es/tools/venny/），得到交集靶点。1.3活性成分活性成分-预测靶点网络和蛋白预测靶点网络和蛋白-蛋白互作蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建网络构建利用Cystoscope 3.7.2软件构建筒鞘蛇菰活性成分-预测靶点网络。将交集靶点输入到 STRING 11.5 数据库中，限定“Organism”为“Homo sapiens”，其余 参 数 选 择 默 认 值，获 得 PPI 网 络，采 用Cytoscape 3.7.2软件使结果可视化。1.4分子对接分子对接从 PubChem 数据库下载筒鞘蛇菰活性成分的 3D 结构，从国际蛋白质结构数据库中（http：/www.rcsb.org/）下载核心靶点的 3D 结构，采用 AutoDock TOOLs 进行去水和加氢并分别将其选为配体和受体，利用 AutoDock Vina软件进行对接，采用 PyMOL软件进行可视化。1.5基因本体论基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集和功能富集和京都基因与基因组百科全书京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信 号 通 路 富 集 分信 号 通 路 富 集 分析析采用 R 软件对筒鞘蛇菰治疗 HUA 的靶点进行GO 功能富集分析和 KEGG 信号通路富集分析，分析筒鞘蛇菰治疗 HUA 交集靶点参与的生物学过程和涉及的信号通路。1.6细胞细胞、动物动物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器大鼠肾小管上皮 NRK-52E 细胞购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。ICR雄性小鼠 32只，体质量 1822 g，购自湖北医药学院 实 验 动 物 中 心，动 物 生 产 许 可 证 号：SCXK（鄂）2019-0008，经湖北医药学院动物实验伦理审查委员会批准（2022-实 043），小鼠自由饮水进食，分 笼 饲 养，室 温 23 25，相 对 湿 度 50%70%，12 h 明暗交替，适应性喂养 3 d。DMEM 培养基和胎牛血清购自美国 Gibco公司，CCK-8试剂盒 购 自 日 本 同 仁 化 学 研 究 所，XO 购 自 美 国Solarbio公司，UA、氧嗪酸钾和次黄嘌呤均购自美国 Sigma 公司，UA、肌酐（creatinine，Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）检测试剂盒均购 自 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所，圣 草 酚（eriodictyol，EDT）（含量98%）购自陕西省宝鸡市辰光生物科技有限公司，TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，甘油醛-3-磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，AKT）、磷 酸 化 AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）、磷 脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷 酸 化 PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）和 B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体购自美国 CST 公司，Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗 体 购 自 美 国Abcam 公 司。高 效 液 相 色 谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 购 自 美 国Thermo 公司，全波长酶标仪购自美国 Molecular Devices公司。1.7CCK-8 法检测各组细胞增殖活性法检测各组细胞增殖活性采用含10%FBS 的 DMEM 培养基于 37、5%CO2条件下培养 NRK-52E 细胞。取对数生长期 NRK-52E 细胞调整密度为 1105 mL1，每 孔 100 L 接 种 于96 孔细胞培养板，待细胞生长融合至 80%，血清饥饿 12 h，弃去培养液，给药组每孔加入含 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0 mol L1 EDT 的培养液，同时设置空白对照组和溶剂对照组，每组 6 个复孔。培养 24 h 后，弃去培养液，每孔加入 100 L 含 10%CCK-8 的完全培养液，检测各组细胞于波长 450 nm 处的吸光度（A）值，并计算各组细胞增殖活性。细胞增殖活性=（实验组 A 值空白对照组 A 值）/（溶剂对照组 A值空白对照组 A值）。1.8建立腺苷诱导的高尿酸细胞模型建立腺苷诱导的高尿酸细胞模型取对数生长期 NRK-52E 细胞接种于 24 孔细胞培养板中培养24 h，设置空白对照组、空白给药组、模型组和不同浓度（2、10 及 50 mol L1）EDT 组，血清饥饿 24 h，同时预给药。空白对照组和模型组细胞更换含 2.5 mol L1腺苷的无血清培养液，空白给药组和不同浓度 EDT 组细胞更换含 2.5 mol L1腺苷和不同浓度 EDT 的无血清培养液，24 h 后，除61第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）空白对照组和空白给药组外，其余各组细胞每孔加5 U mL1 XO 1 L，6 h 后收集各组细胞上清液进行检测。1.9HPLC 法检测各组细胞中法检测各组细胞中 UA 水平水平色谱柱为Agilent-ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm250 mm，5 m），流动相为95%缓冲盐水溶液（0.52 mmol L1 1-戊烷磺酸钠和 0.2 mmol L1磷酸一钾，pH 4.0）-5%乙腈，流速 1.0 mL min1，检 测 波 长 254 nm，柱 温 40 ，进 样 量 1 L。精 密 称 取 对 照 品 UA 1.00 mg，加 0.02 mol L1 NaOH 溶 解 并 定 容 至1 mL，制成1 g L1 UA对照品溶液，混匀，0.45 m微 孔 滤 膜 滤 过。用 超 纯 水 稀 释 至 100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0 和1.562 5 mg L1共 7个浓度，HPLC法检测，以 UA浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。收集各组细胞培养上清液，4、12 000 g离心 15 min后取上清待测。1.10制备制备 HUA 小鼠模型和药物干预小鼠模型和药物干预SPF 级ICR 雄性小鼠随机分为空白对照组、空白给药组、模型组和 EDT（100 mg kg1）组，每组 8 只。模型组和 EDT 组小鼠采用次黄嘌呤（300 mg kg 1）联合氧嗪酸钾（300 mg kg1）连续腹腔注射 7 d制备HUA 小鼠模型19。空白对照组小鼠灌胃给予生理盐水，空 白 给 药 组 和 EDT 组 小 鼠 灌 胃 给 予100 mg kg1 EDT，连续 14 d，包括 7 d预给药。末次灌胃给药 2 h 后，摘各组小鼠眼球取血。上述各组小鼠灌胃和腹腔注射给药剂量均为 20 mL kg1。1.11试剂盒法检测各组小鼠血清中试剂盒法检测各组小鼠血清中 UA、Cr 和和BUN 水平及计算肾脏指数水平及计算肾脏指数取各组小鼠血清，按照试剂盒说明书中的方法检测血清中 UA、Cr 和BUN 水平。取小鼠两侧肾组织，称质量，计算各组小鼠肾脏指数：肾脏指数=小鼠肾脏质量（g）/小鼠体质量（g）100%。1.12TUNEL 法观察小鼠肾组织中细胞凋亡情法观察小鼠肾组织中细胞凋亡情况况将 4%多聚甲醛固定的小鼠肾组织进行脱水、浸蜡和包埋，切片（厚度 5 m），参照凋亡试剂盒说明书进行 TUNEL 染色处理，观察各组小鼠肾组织中细胞凋亡情况。1.13Western blotting 法检测各组小鼠肾组织中法检测各组小鼠肾组织中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax 和和 MMP-9蛋白表达水平蛋白表达水平各组小鼠肾组织匀浆后取上清，采用 BCA 法测定总蛋白浓度。取 2030 g组织蛋白样本经凝胶、电泳、转 膜 和 封 闭，加 一 抗 AKT（1500）、p-AKT（11 000）、PI3K（11 000）、p-PI3K（1500）、Bcl-2（12 000）、Bax（11 000）和MMP-9（11 000），洗膜，加二抗，均以15 000稀释，洗膜，ECL 显色。GAPDH 一抗以 18 000稀释，二抗以 110 000 稀释。采用 ImageQuant LAS 4000 凝胶成像仪分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平和 p-AKT/AKT 及 p-PI3K/PI3K比值。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋 白 条 带 灰 度 值，p-AKT/AKT 比值=p-AKT 蛋 白 表 达 水 平/AKT 蛋 白 表 达 水 平，p-PI3K/PI3K 比值=p-PI3K 蛋白表达水平/PI3K 蛋白表达水平。1.14统计学分析统计学分析采用 SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性，各组细胞中 UA水平，各组小鼠血清中 UA、Cr 和 BUN 水平及肾脏 指 数，各 组 小 鼠 肾 组 织 中 AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax 和 MMP-9 蛋白表达水平均符合正态分布，以 xs 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用 LSD-t 检验。以 P0.05），100.0 mol L1 EDT 组细胞增殖活性明显降低（P0.01），因此设置 2.0、10.0和 50.0 mol L1 3 个 EDT 浓 度 进 行 后 续 实 验。见表 3。2.8各组细胞中各组细胞中 UA 水平水平UA 标准曲线回归方程为 y=30.520 0 x+0.000 1（R2=0.999 2），表 明UA 在 0.001 562 50.100 000 0 g L1范围内线性关系良好。与空白对照组比较，模型组细胞中 UA水平明显升高（P0.01）；与模型组比较，2.0、10.0 和 50.00 mol L1 EDT 组细胞中 UA 水平明显降低（P0.05或 P0.01）。见表 4。2.9各组小鼠血清中各组小鼠血清中 UA、Cr 和和 BUN 水平及肾脏水平及肾脏指 数指 数 与 空 白 对 照 组 比 较，模 型 组 小 鼠 血 清 中UA、Cr 和 BUN 水平及肾脏指数明显升高（P0.01）；与模型组比较，EDT 组小鼠血清中 UA、Cr 和 BUN 水平及肾脏指数明显降低（P0.05 或P0.01）。见表 5。2.10各组小鼠肾组织中细胞凋亡情况各组小鼠肾组织中细胞凋亡情况与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中可见大量凋亡细胞；与模型组比较，EDT 组小鼠肾组织中凋亡细胞数明显减少。见图 7。表表 2分子对接结果分子对接结果TabTab.2 2Molecular docking resultsMolecular docking resultsTargetMAPK1PIK3CAHSP90AA1PIK3R1SRCEGFRTNFAPPARGAPDHRELAMMP-9MTORIL-2PDB ID6SLG5DXT4BQG5GJI2BDF3W2S2ZA53KTM1E3G1U8F1NFI6ESM5WBH1M48Affinity（kcal mol1）Gallic acid5.86.25.96.76.16.26.66.16.46.75.77.15.65.45-hydroxymaltol4.95.85.16.35.35.46.25.35.85.85.56.35.35.1(+)-pinoresinol7.38.38.17.38.08.36.97.48.48.97.68.27.28.25,7-dihydroxychromone5.96.57.07.06.66.46.56.57.76.76.17.86.46.3Penicillic acid5.25.25.56.15.15.04.35.05.55.24.85.85.15.0Eriodictyol7.39.29.87.98.59.17.08.49.29.48.810.88.47.4图图 4EDT与与 MMP-9对接模式图对接模式图Fig.4Docking pattern diagram of EDT and MMP-965第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）2.11各组小鼠肾组织中各组小鼠肾组织中 p-AKT/AKT 及及 p-PI3K/PI3K 比 值 和比 值 和 Bcl-2、Bax 及及 MMP-9 蛋 白 表 达 水 平蛋 白 表 达 水 平与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中 p-AKT/AKT 及 p-PI3K/PI3K 比值和 Bcl-2 蛋白表达水平明图图 5潜在作用靶点潜在作用靶点 GO功能富集分析功能富集分析Fig.5GO functional enrichment analysis on potential action targets图图 6潜在作用靶点潜在作用靶点 KEGG信号通路富集分析信号通路富集分析Fig.6KEGG signaling pathway enrichment analysis on potential action targets表表 3各组细胞增殖活性各组细胞增殖活性TabTab.3 3Proliferation activities of cells in various groups Proliferation activities of cells in various groups (n=6，xs）GroupBlank controlEDT(mol L1)0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0 20.0 50.0 100.0Proliferation activity of cells1.000 0.0411.194 0.0211.175 0.0281.157 0.0281.141 0.0371.130 0.0351.070 0.0231.018 0.0300.898 0.0200.776 0.024*P0.01 vs blank control group.66刘丽，等.基于筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症的网络药理学分析及其对高尿酸细胞模型和高尿酸血症显降低（P0.05 或 P0.01），Bax 和 MMP-9 蛋白表达水平明显升高（P0.01）；与模型组比较，EDT 组 小 鼠 肾 组 织 中 p-AKT/AKT 及 p-PI3K/PI3K 比 值 和 Bcl-2 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.05 或 P0.01），Bax 和 MMP-9 蛋白表达水平明显降低（P0.01）。见图 8。3 讨 论 目前 HUA 是一个全球性的公共卫生问题，是痛风、高血压、慢性肾病和肥胖等多种疾病的独立危险因素，已成为继高血压、高血糖和高血脂之后的“第四高”20。2021年数据21显示：我国 HUA患病率为 16.4%，并且呈现年轻化趋势。降低血清 UA 是防治 HUA 的首要策略。研究18显示：蛇菰可降低 HUA 患者的 UA 水平。但由于蛇菰成分较多，其降 UA的活性物质及作用机制尚不明确。本研究利用网络药理学方法，通过构建活性成分-预测靶点网络和 PPI 网络，多方面和多层次深入研究筒鞘蛇菰治疗 HUA 的主要活性成分和潜在靶点及其作用机制，进一步通过分子对接、高尿酸细胞模型和 HUA 小鼠模型实验进行验证，通过构建活性成分-预测靶点网络筛选出没食子酸、5-羟麦芽酚、（+）-松脂素、5，7-二羟基色原酮、青霉酸和 EDT 等 6 种活性成分，可能是筒鞘蛇菰治疗 HUA 的主要活性成分；通过 PPI 网络获取核心靶点14个，分别为MAPK1、PIK3CA、HSP90AA1、PIK3R1、SRC、EGFR、TNF、APP、AR、GAPDH、RELA、MMP-9、MTOR 和 IL-2；分子对接结果显示：主要活性成分与关键靶点具有较好的结合作用，其中主要活性成分 EDT 与 MMP-9的对接结果最优。本研究结果提示：EDT 可能为筒鞘蛇菰的主要活性成分。基于以上原因，本研究选择分子对接中与靶点结合活性最强的 EDT 用于后续的体内外实验验证，并对其作用机制进行研究。UA 是嘌呤代谢的终产物，腺苷被腺苷脱氨酶转化为肌苷，肌苷经嘌呤核苷酸磷酸化酶转化成次黄嘌呤，次 黄 嘌 呤 被 XO 转 化 为 黄 嘌 呤，进一步被XO 转 化 为 UA22-23。本 研 究 首 先 通 过 腺 苷 诱 导NRK-52E 细胞建立高尿酸细胞模型，采用 HPLC法检测细胞培养上清液中 UA 水平，结果显示：EDT 可明显降低细胞中 UA 水平；同时，采用氧嗪酸钾联合次黄嘌呤建立 HUA 小鼠模型，通过抑制小鼠体内尿酸酶来减少 UA 分解，补充外源性UA前体物质，从而增加其 UA生成，模拟 HUA的效果19，24。本研究结果显示：模型组小鼠血清中UA 水 平 明 显 升 高，表 明 HUA 小 鼠 造 模 成 功；EDT 组小鼠血清中 UA 水平明显降低，表明 EDT有降 UA 的作用。血清 Cr和 BUN 水平是评价肾功能的重要指标。本研究结果显示：EDT 可降低HUA 小鼠血清中 Cr 和 BUN 水平及肾脏指数，提示 EDT 可改善小鼠肾损伤。为阐明筒鞘蛇菰如何通过核心靶点产生作用，本研究进一步进行了靶点功能富集分析，KEGG 信号通路富集分析结果显示：筒 鞘 蛇 菰 的 作 用 可 能 与 HIF-1、VEGF、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、急性髓系白血病、表表 4各组细胞中各组细胞中 UA水平水平TabTab.4 4Levels of UA in cells in various groups n=6,xs,B/(g L1)GroupBlank controlBlank administrationModelEDT(mol L1)2.0 10.0 50.0UA 0.0000.0000.0000.0000.0330.001*0.0240.0010.0110.0010.0050.000*