基于基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌基因突变位点的检测分析.pdf

【基金项目】*1苏州市基础研究计划（医学应用基础研究）项目（编号：SKY2023220）；苏州市卫生青年骨干人才（编号：Qngg2021028）；苏州市生物医药产业创新医工结合协同创新研究项目（编号：SLJ2022022）；苏州市科教兴卫青年科技项目（编号：KJXW2022045）【作者简介】*2孙青（1994），女，检验师【通信作者】*3黄帆（1996），女，硕士，检验师【电子邮箱】DOI:10.13493/j.issn.1672-7878.2023.10-0020基于基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌基因突变位点的检测分析*1孙 青*2，宋华峰，黄 帆*3苏州市第五人民医院（苏州大学附属传染病医院）检验中心，江苏 苏州 215000【摘要】目的：分析基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）基因突变位点的检测情况，为耐多药结核的临床诊断提供依据。方法：收集 2020 年2023 年在苏州市第五人民医院就诊的 395 例结核患者的痰液标本，采用基因芯片技术对利福平耐药基因 ropB（511、513、516、526、531、533）和异烟肼耐药基因 KatG（315）、inhA（-15）突变位点进行检测，以罗氏固体培养绝对浓度法作为金标准，分析基因芯片技术对 MTB 耐利福平或异烟肼的准确性。结果：基因芯片技术对利福平耐药诊断的 Kappa 值为 0.80，符合率为92.15%，灵敏度为 87.74%，特异度为 93.77%，阳性预测值为 83.78%，阴性预测值为 95.42%，而对异烟肼耐药诊断的 Kappa 值为 0.87，符合率为 93.42%，灵敏度为 98.82%，特异度为 89.38%，阳性预测值为 87.43%，阴性预测值为99.02%。结论：基因芯片技术可以快速、高效地检测 MTB 耐利福平和耐异烟肼基因突变，与罗氏固体培养绝对浓度法高度一致，可为临床诊疗提供依据。【关键词】结核分枝杆菌；基因芯片技术；利福平；异烟肼；耐药基因【中图分类号】R 52；R 446.7【文献标志码】A【文章编号】1672-7878（2023）10-1108-05Detection Analysis of Gene Mutation Sites of Rifampin-or Isoniazid-resistantMycobacterium Tuberculosis Based on Gene Chip Technology*1SUN Qing*2,SONG Hua-feng,HUANG Fan*3Department of Laboratory Medicine,The Fifth Peoples Hospital of Suzhou(The Affiliated Infectious Disease Hospitalof Soochow University),Suzhou Jiangsu 215000,ChinaABSTRACTObjective:Toanalyzethedetectionongenemutationsitesofrifampin-orisoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosis(MTB)with the gene chip technology,so as to provide a basis for the clinical diagnosis of multidrug-resistanttuberculosis.Methods:Sputum specimens from 395 tuberculosis patients treated in the Fifth Peoples Hospital of Suzhoufrom 2020 to 2023 were collected,and the gene chip technology was utilized to detect the mutation sites of rifampinresistance gene ropB(511,513,516,526,531,533)and isoniazid resistance genes KatG(315)and inhA(-15).By usingthe Roche solid culture absolute concentration method as the gold standard,the accuracy of the gene chip technology onMTB resistance to rifampin or isoniazid was analyzed.Results:The Kappa value of the gene chip technology for thediagnosis of rifampin resistance was 0.80,the coincidence rate was 92.15%,the sensitivity was 87.74%,the specificitywas 93.77%,the positive predictive value was 83.78%,and the negative predictive value was 95.42%.The Kappa valueof the gene chip technology for the diagnosis of isoniazid resistance was 0.87,the coincidence rate was 93.42%,thesensitivity was 98.82%,the specificity was 89.38%,the positive predictive value was 87.43%,and the negative predictivevalue was 99.02%.Conclusion:The gene chip technology can detect the gene mutations of MTB resistance to rifampinand isoniazid in a rapid and efficient manner,which is highly consistent with the Roche solid culture absolute concentrationmethod and can provide a basis for the clinical diagnosis and treatment.KEY WORDSMycobacterium tuberculosis;gene chip technology;rifampin;isoniazid;drug resistance genesAnti Infect Pharm,2023,20(10):1108-1112抗 感 染 药 学Anti Infect Pharm 2023 October;20(10)孙 青，等.基于基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌基因突变位点的检测分析1108组别野生型单利福平耐药单异烟肼耐药利福平异烟肼耐药合计例数220669100395构成比55.701.5217.4725.32100.00表 1395 例患者样本中 MTB 的耐药情况（n/例，%）结 核 病 是 由 结 核 分 枝 杆 菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的以呼吸道传播为主的严重危害人类健康的全球性疾病1。耐多药结核病仍然是全球公共卫生安全面临的重大挑战，随着耐药结核病的发生率逐渐升高，一线抗结核药物的疗效减弱。据相关研究报道，耐多药结核病患者使用抗结核药物治疗的失败率高达 15%77%2-3。利福平（rifampicin，RFP）和异烟肼（isoniazid，INH）是最早发现且临床常用的 2 种一线抗结核药物，随着对 MTB 耐药分子机制研究的进展，有文献报道 MTB 耐利福平的主要分子机制是编码 RNA 聚合酶 亚单位的 rpoB 基因发生突变4，耐异烟肼的主要分子机制是编码过氧化氢酶-过氧化物酶的 KatG 基因和编码烯酞基还原酶的 inhA基因发生突变5。目前，结核耐药性检测的主要方法是体外药物敏感实验，包括固体药敏法和液体药敏法6，但这 2 种方法均依赖于结核分枝杆菌培养。传统药敏法不仅耗时长，而且成本较高，基因芯片检测技术的出现不仅实现了快速、早期对MTB 耐利福平和耐异烟肼的诊断，还能进一步对利福平 ropB 基因位点和异烟肼 KatG、inhA 基因位点进行分析。本研究通过基因芯片技术快速检测 MTB 的耐利福平和耐异烟肼的相关基因突变位点，并与罗氏固体培养绝对浓度法（金标准）进行比较，评价了基因芯片技术对利福平和异烟肼耐药性的诊断价值，从而为临床提供快速、准确的诊断和治疗依据。1资料与方法1.1一般资料收集 2020 年2023 年在苏州市第五人民医院就诊的 395 例结核患者的痰液标本，其中男276 例，女 119 例，平均年龄为（46.4519.31）岁。1.2方法1.2.1基因芯片法耐药基因检测试剂盒由博奥生物有限公司提供，检测基因主要包括利福平rpoB 基因、异烟肼 KatG 基因和 inhA 基因。用 4%NaOH 预处理痰标本，加核酸提取液后使用 ExtractorTM36 核酸快速提取仪提取核酸，将核酸扩增、变性后加入杂交缓冲液，在 BioMixerTM 芯片杂交仪中进行杂交反应，杂交 2 h 后，用 lideWasherTM8 芯片洗干仪进行洗涤和甩干，最后采用微阵列芯片扫描仪对结果进行判读。1.2.2罗氏固体培养绝对浓度法采用 4%NaOH预处理的痰标本，在无菌条件下加入 0.5 mL MGITOADC 营养添加剂和 0.1 mL MGIT PANTA 抗菌素混合溶液，加入 0.5 mL 处理好的标本，颠倒混匀后放入 BACTEC MGIT960 全自动分枝杆菌培养仪进行孵育培养。对阳性培养标本进行抗酸染色涂片，若抗酸染色涂片阳性则进行药敏试验。对培养获得的 MTB 采用罗氏固体培养绝对浓度法进行药敏试验，利福平浓度包括 0、50、250 g/mL，异烟肼浓度包括 0、1、10 g/mL。培养 28 d 后，若菌落数200，报告为敏感（S）；若菌落数200，报告为耐药（R）。1.3观察指标（1）395 例患者样本中 MTB 的耐药情况；（2）基因芯片检测 MTB 耐利福平突变位点结果。1.4统计学方法采用 SPSS 26 统计学软件分析数据。以罗氏固体培养绝对浓度法为金标准，采用 2检验计算基因芯片对利福平、异烟肼耐药诊断的 Kappa 值、符合率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。2结果2.1395 例患者样本中 MTB 的耐药情况选取 395 例结核患者临床样本中的 MTB，其中野生型为 220 例（占 55.70%），耐药型为 175 例（占 44.30%），耐药结核患者中耐多药结核占比最高（占 25.32%）。详见表 1。2.2基因芯片检测 MTB 耐利福平突变位点结果采用基因芯片检测 MTB 耐利福平 ropB 基因突变位点，共检测 395 例样本，其中未检测到利福平 ropB 基因位点突变 282 例（占 71.39%），在突变阳性标本中，MTB 耐利福平以 ropB 531（TCG-TTG）突变（占 19.49%）为主。详见表 2。2.3基因芯片检测 MTB 耐异烟肼突变位点结果利用基因芯片检测结核分枝杆菌耐异烟肼KatG、inhA 基因位点突变，共检测 395 例样本，其中未检测到异烟肼 KatG、inhA 基因位点突变 204 例（204/395，占 51.65%）；在突变阳性标本中，MTB 耐ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 October;20(10)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-878063071109为主，见表 3。2.42 种方法检测利福平和异烟肼药敏结果比较395 例样本基因芯片法和罗氏固体培养绝对浓度法（体外药敏法）试验结果比对显示：基因芯片检测 利 福 平 耐 药 的 Kappa 值 为 0.80、符 合 率 为92.15%、灵敏度为 87.74%、特异度为 93.77%、阳性预测值为 88.29%、阴性预测值为 95.42%；检测异烟肼耐药的 Kappa 值为 0.87、符合率为 93.42%、灵敏度为 98.82%、特异度为 89.38%、阳性预测值为突变情况野生型突变型基因KatGinhAKatGinhA基因位点315-15315-15密码子突变AGC-ACCAGC-AACC-TAGC-ACCC-T例数2041252604构成比51.6531.650.5015.191.01表 3基因芯片检测 MTB 耐异烟肼 KatG、inhA 基因突变位点结果（n/例，%）表 4基因芯片法和体外药敏法检测利福平和异烟肼的药敏结果比较药物利福平异烟肼基因芯片法耐药敏感合计耐药敏感合计体外药敏法（n/例）耐药93131061672169敏感1827128924202226总计（n/例）111284395191204395Kappa 值0.800.87符合率（%）92.1593.42灵敏度（%）87.7498.82特异度（%）93.7789.38阳性预测值（%）83.7887.43阴性预测值（%）95.4299.0287.43%、阴性预测值为99.02%，进行 Kappa 一致性检验，Kappa 值均0.8，高度一致，见表4。3讨论2022 年 WHO 全球结核病报告显示，结核病是目前除新冠肺炎（COVID-19）外的单一传染源的头号死亡原因，自 2015 年以来结核病发病率下降了10%，距离 2020 年下降 20%的目标仅完成了一异烟肼以 KatG 315（AGC-ACC）突变（占 31.65%）突变情况野生型突变型基因ropB基因位点511513516526531533密码子突变CTG-CCGCAA-AAACAA-CCAGAC-TACGAC-GTCGAC-GGCCAC-GACCAC-CGCCAC-TACCAC-CTCTCG-TTGTCG-TGGCTG-CCG例数2821001015311107704构成比71.392.530.000.250.000.251.270.760.252.780.0019.490.001.01表 2基因芯片检测 MTB 耐利福平 ropB 基因突变位点结果（n/例，%）ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 October;20(10)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-878063071110半7。结核病标准化学药物治疗方案主要依据MTB 药物敏感试验结果，药物被分为一线药物、二线药物等，其中利福平和异烟肼作为治疗结核病的一线药物组合，在抗结核治疗中的使用相当频繁，故这 2 种药物的耐药率越来越高。传统体外药敏法作为抗结核药物敏感试验的金标准，具有周期长，成本高等缺点，不能及时为临床医生提供有效的诊疗依据，因此，亟需一种能快速检测 MTB 对利福平和异烟肼的药敏情况的技术。近年来，随着分子诊断技术的发展，基因芯片技术被广泛应用于结核耐药性诊断，在耐利福平和异烟肼诊断方面，其与传统药敏法相比具有更加快速、准确和经济的优点8-10。本研究分析 395 例结核分枝杆菌感染患者病原菌的耐药情况结果显示，苏州地区结核病耐药情况主 要 为 利 福 平 和 异 烟 肼 双 重 耐 药 100 例（占25.32%），即耐多药结核占总阳性例数的一半以上，其中利福平 ropB 基因 531（TCG-TTG）突变 77 例（占 19.49%）和异烟肼 KatG 315（AGC-ACC）突变125 例（占 31.65%）占比最高，且基因芯片法和体外药敏法检测利福平和异烟肼药敏结果经 Kappa 一致性检验结果显示，Kappa 值均0.8，高度一致。据 WHO 要求，用于 MTB 的新的分子生物学检测的产品的灵敏度应超过 90%，特异应超过95%11。本研究中基因芯片检测利福平耐药的灵敏度、特异度分别为 87.74%和 93.77%，检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度分别为 98.82%和 89.38%，可见基因芯片技术作为 MTB 的新的分子生物学检测技术，并未完全达到 WHO 的标准，这可能与利福平和异烟肼的耐药机制有关，并非单一的基因突变导致 MTB 耐药，其可能原因还有：（1）固有耐药机制，如细胞壁渗透性降低、外排泵作用、细胞代谢等12；（2）蛋白翻译后修饰参与了 MTB 耐药，如InhA 蛋白 Thr 266 能发生磷酸化修饰，修饰后活性降低，改变细胞壁通透性，可能影响其对异烟肼的耐药性13；（3）其他蛋白的表达和修饰参与了 MTB耐药，如铁调节蛋白 HupB 发生乙酰化修饰也会影响 MTB 相应基因表达，使细胞产生对异烟肼的耐药性14，此外，PknG、SahH、KasB 等多种蛋白也可能参与异烟肼耐药性的产生15；（4）存在检测位点以外的突变，如 Sinha 等16发现新的耐利福平突变位点包括 528 密码子 Arg-Cys 突变、518 密码子 Asn-Asp 突变、506 密码子 Phe-Leu 突变、511 密码子Leu-Pro 突变、513 密码子 Gln-Val/Glu/Pro/Leu 突变和 510 密码子 Gln-His 突变。综上，基因芯片技术可以高效、快速地检测MTB 耐利福平和耐异烟肼基因突变，与罗氏固体培养绝对浓度法高度一致，对 MTB 药敏情况的快速诊断具有一定的应用价值，可为传统药敏提供有力的补充，进而为临床提供诊疗依据。参考文献1Kyu HH,Maddison ER,Henry NJ,et al.Global,regional,and national burden of tuberculosis,1990-2016:resultsfrom the Global Burden of Diseases,Injuries,and RiskFactors 2016 StudyJ.Lancet Infect Dis,2018,18(12):1329-1349.2Akkerman O,Aleksa A,Alffenaar JW,et al.Surveillanceof adverse events in the treatment of drug-resistant tuberculosis:a global feasibility studyJ.Int J Infect Dis,2019,83:72-76.3Dookie N,Rambaran S,Padayatchi N,et al.Evolution ofdrug resistance in Mycobacterium tuberculosis:a reviewon the molecular determinants of resistance and implications for personalized careJ.J Antimicrob Chemother,2018,73(5):1138-1151.4 Brown TJ,Herrera-Leon L,Anthony RM,et al.The use ofmacroarrays for the identification of MDR MycobacteriumtuberculosisJ.J MicrobiolMeth,2006,65(2):294-300.5Herrera L,Valverde A,Saiz P,et al.Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosisclinical strains isolated in the PhilippinesJ.Int J Antimicrob Agents,2004,23(6):572-576.6 宋媛媛，夏辉，赵雁林.结核分枝杆菌表型药物敏感性试验临界浓度设定发展历程J.中国防痨杂志，2023，45（7）：631-638.7World Health Organization.Global tuberculosis report2022（EB/OL）.(2022-10-27)2023-07-03.https:/iris.who.int/bitstream/handle/10665/363752/9789240061729-eng.pdf?sequence=1.8 王丹吉，刘巧，陆伟，等.基因芯片技术对耐多药结核病患者治疗的指导价值J.南京医科大学学报（自然科学版），2018，38（7）：983-987.9 许榕青，李丹，林银霞，等.基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价J.中国人兽共患病学报，2017，33（1）：43-48.10 李丹，杜德兵，吴文燕，等.基因芯片技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性分析中的应用J.检验医学，2019，34（2）：165-168.11 World Health Organization.High priority target productprofiles for new tuberculosis diagnostics:report of a consensusmeeting(EB/OL).(2014-08-29)2023-07-03.https:/www.who.int/publications/i/item/WHO-HTM-TB-ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 October;20(10)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-8780630711112014.18.12 Almeida da Silva PE,Von Groll A,Martin A,et al.Effluxas a mechanism for drug resistance in Mycobacterium tuberculosisJ.FEMS Immunol Med Microbiol,2011,63(1):1-9.13 Walker TM,Kohl TA,Omar SV,et al.Whole-genome sequencing for prediction of Mycobacterium tuberculosisdrug susceptibility and resistance:a retrospective cohortstudyJ.Lancet Infect Dis,2015,15(10):1193-1202.14 Sakatos A,Babunovic GH,Chase MR,et al.Posttranslational modification of a histone-like protein regulates phenotypic resistance to isoniazid in mycobacteriaJ.SciAdv,2018,4(5):eaao1478.15 Arora G,Bothra A,Prosser G,et al.Role of post-translational modifications in the acquisition of drug resistancein Mycobacterium tuberculosisJ.Febs J,2021,288(11):3375-3393.16 Sinha P,Srivastava GN,Tripathi R,et al.Detection of mutations in the rpoB gene of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains inhibiting wild type probe hybridization in the MTBDR plus assay by DNA sequencing directly from clinical specimensJ.BMC Microbiol,2020,20(1):284.（收稿日期：2023-09-05责任编辑：董雁/闵奇萍）DOI:10.13493/j.issn.1672-7878.2023.10-0021胸腔镜下肺叶切除术对肺癌合并肺结核患者血流动力学、免疫功能和血清炎症因子的影响*1吴玉姣1*2，秦科宇2，庄曙明3，张志新2*31常州市第三人民医院药事科，江苏 常州 213000；2常州市第三人民医院肺科，江苏 常州 213000；3常州市第三人民医院心胸外科，江苏 常州 213000【摘要】目的：探究胸腔镜肺叶切除术对肺癌合并肺结核患者血流动力学、炎症因子和免疫功能的影响。方法：回顾性分析 2016 年 1 月2020 年 12 月于常州市第三人民医院行胸腔镜肺叶切除术的 51 例肺癌患者资料，将 18 例肺结核合并肺癌者设为 A 组，33 例肺癌患者设为 B 组；比较 2 组患者的一般资料、围术期数据（手术时间、术中出血量、补液量、尿量、术后住院时间等）、动脉血气指标即动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）、动脉血氧饱和度（SaO2）值，手术前、后的免疫功能指标（CD4、CD8、CD4/CD8T 细胞亚群）、炎症因子即白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8（interleukin-6，IL-8）、C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）水平，以及术后并发症情况和生存率的差异。结果：A 组患者的男性、吸烟者的构成比高于 B 组（P0.05），且患者的术后住院时间较 B 组长（P0.05）；2 组患者术前、术后 7 d的 PaCO2、PaO2、SaO2水平经比较其差异无统计学意义（P0.05）；术前 2 组患者的 CD4、CD8、CD4/CD8等 T 细胞亚群水平经比较其差异无统计学意义（P0.05），术后A 组患者的 CD4、CD8等 T 细胞亚群水平低于 B 组（P0.05），CD4/CD8水平高于 B 组（P0.05），IL-6 水平高于 B 组（P0.05），且术后并发症气胸发生率高于 B 组（P0.05）；Kaplan-Meier 曲线显示，A 组患者的生存率低于B 组（P0.05）。结论：肺结核合并肺癌患者病理类型为腺癌的构成比较高，33.33%患者术后出现手术并发症，死亡率为 33.33%；在结核流行国家，肺结核合并肺癌行胸腔镜切除患者的死亡率高于肺癌患者，故对既往有肺结核的患者必须持续给予其相应的控制措施。【关键词】胸腔镜；肺叶切除术；结核；肺癌；生存曲线【中图分类号】R 52；R 181.3+2【文献标志码】A【文章编号】1672-7878（2023）10-1112-05【基金项目】*1常州市科技项目（编号：CJ20239024）；天晴医院药学基金（编号：Q202145）【作者简介】*2吴玉姣（1986），女，硕士，副主任药师【通信作者】*3张志新（1968），男，硕士，主任医师【电子邮箱】结核病和肺癌是重要的全球健康威胁，肺癌是最常见的呼吸系统恶性肿瘤，根据 WHO 国际癌症研究机构发布的数据，2020 年全球新发癌症病例累计达 1 929 万例，死亡 996 万例。肺癌是我国发病抗 感 染 药 学Anti Infect Pharm 2023 October;20(10)吴玉姣，等.胸腔镜下肺叶切除术对肺癌合并肺结核患者血流动力学、免疫功能和血清炎症因子的影响1112