基于氧化应激的固态发酵白酒抑制肝癌HepG2细胞增殖.pdf

基于氧化应激的固态发酵白酒抑制肝癌 HepG2 细胞增殖周琦1袁管祺杰2袁耿燕1*渊1江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡 2141222江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡 214122冤摘要探究固态酿造浓香型白酒渊NX冤和酱香型白酒渊JX冤抑制肝癌细胞 HepG2 增殖的作用机制遥 采用细胞计数试剂盒 8渊CCK8冤法评价细胞增殖袁用试剂盒检测乙醇脱氢酶渊ADH冤尧过氧化氢酶渊CAT冤尧黄嘌呤氧化酶渊XOD冤的酶活以及活性氧渊ROS冤和一氧化氮渊NO冤的含量评价 HepG2 氧化应激酶的水平袁采用实时定量 PCR 检测氧化应激关键基因核因子 E2 相关因子 2渊NRF2冤及其下游基因醌氧化还原酶渊NQO1冤的表达遥 结果院100 mmol/L 乙醇渊ETOH冤浓度时 NX 和 JX 均能显著抑制HepG2 的增殖袁抑制率达 15%曰JX渊6.25100 mmol/L ETOH冤显著上调 HepG2 细胞内 XOD 和 CAT 的活力遥ROS 检测发现在12.5 mmol/L ETOH 时其含量达到峰值袁且受 JX 影响较大遥 NX渊6.25100 mmol/L ETOH冤较 JX 显著促进 NO 的生成遥 NX 和JX渊100 mmol/L ETOH冤均可显著抑制 HepG2 胞内 NRF2 及其下游基因 HQO-1 的表达遥 用抗氧化剂 N-乙酰-L-半胱氨酸渊NAC冤抑制氧化应激反应后袁NX 和 JX 抑制 HepG2 增殖的作用均消失袁同时也阻断其对 NRF2 和 HQO-1 表达的调控遥 结论院NX 和 JX 均通过促进氧化应激抑制肝癌 HepG2 细胞的增殖遥关键词中国白酒曰 肝癌曰 氧化应激曰 细胞模型文章编号1009-7848渊2023冤08-0060-07DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.007中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一袁 具有以酯类为主体的复合香味袁 在我国乃至世界都有着众多消费群体1遥 根据风味特征袁中国白酒有多种分类袁浓香渊NX冤和酱香渊JX冤是其中的典范遥 JX 高度酒的体积分数一般为 53%袁 总酸含量大于 1.5g/L袁乙酸乙酯含量高于 2.5 g/L遥 NX 型高度酒的体积分数一般在 52%袁乙酸含量在 0.5 g/L 与 1.7 g/L之间袁乙酸乙酯的含量通常高于 2.5 g/L2-4遥世界卫生组织渊WHO冤指出全球每年约有5.3%的死亡来自于有害使用酒精袁并且也是多种疾病以及一些损伤症的致病因素之一5遥乙醇及其代谢产物乙醛为明确的致癌物质袁 可导致消化道肿瘤尧肥胖及心血管疾病等6-10遥 中国白酒并不等同于乙醇溶液遥 酿造白酒是一种由多种粮食制成的蒸馏酒袁其生产工艺复杂袁包括固体糖化尧发酵尧曾蒸馏尧瓷瓶陈酿等遥 此外袁酒曲作为糖化发酵剂袁含有多种微生物和酶遥 复杂的酿造工艺和菌群为白酒功能成分的形成提供了丰富的物质基础遥目前研究发现白酒中含有大量的小分子生物活性化合物11遥吴寿岭等12研究不同饮酒量对糖尿病男性心脑血管事件的影响袁结果发现袁低饮酒组人群较不饮酒组及高饮酒组人群而言袁 其急性心肌梗死尧脑梗死和脑出血发生率显著降低遥 赵明德等13研究发现饮酒并不会引起小鼠血压的上升袁另外适量饮酒还能减轻小鼠主动脉粥样硬化袁这是由于适量饮酒会降低血液中纤维蛋白原浓度袁减少血小板的聚集袁 提升血液中高密度脂蛋白的浓度袁进而缓解动脉粥样硬化14遥在动物水平上有研究发现袁 白酒中风味物质能调节小鼠肠道菌群袁 减轻乙醇引起的肠屏障损伤袁并改善宿主代谢15遥 与此相似袁白酒也被报道通过调节肠道菌群改善大鼠高脂饮食引起的代谢疾病16遥 另外袁肿瘤研究发现 JX 能改善二乙基亚硝胺诱导的小鼠肝细胞癌袁显著降低 GPC3渊肝癌的一个早期形成指标冤表达量袁并通过抗氧化因子的激活起到保护肝脏的作用17遥KEAP1/NRF2 信号通路被证实参与细胞的氧化应激袁其中核因子 E2 相关因子 2渊Nuclear factorerythroid-2 related factor 2袁NRF2冤被发现在细胞的氧化应激中起重要作用遥 当细胞未受到氧化应激信号时袁Kelch 样 ECH 关联蛋白 1 渊Kelch-likeECH-associated protein 1袁Keap1冤 会与 NRF2 结合袁诱使 NRF2 泛素化降解曰然而袁在接收到氧化收稿日期院 2022-08-14第一作者院 周琦袁男袁硕士生通信作者院 耿燕E-mail院 灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月第 23 卷 第 8 期应激信号后袁NRF2 与 KEAP1 解离开袁 进入细胞核袁进而影响下游信号袁以此调控细胞内氧化应激反应18-19遥有研究发现 NX 中含有的 4-甲基愈创木酚和 4 乙基愈创木酚会通过此信号通路参与细胞的氧化应激20-21遥另外袁 有研究分别将 NX 和 JX 与相同浓度ETOH 作用于人肿瘤细胞袁 证实不论 NX 还是 JX都表现出对肿瘤细胞 Pol III 基因转录尧细胞增殖和集落形成的抑制作用22遥 不同白酒抑制肿瘤细胞增殖的作用机制不一致遥 本研究以人肝癌细胞HepG2 为对象袁比较同等浓度 ETOH尧JX 与 NX 作用细胞后对其增殖及氧化应激水平的影响遥1材料与方法1.1材料与试剂人肝癌细胞系 HepG2袁 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心遥乙醇渊色谱级冤袁国药集团袁酱香型白酒为贵州茅台酒样渊53%冤曰浓香型白酒酒样为野国窖 窑 1573冶渊52%冤遥CCK8 试剂盒袁碧云天生物技术公司曰乙醇脱氢酶渊ADH冤尧黄嘌呤氧化酶渊XOD冤尧过氧化氢酶渊CAT冤尧活性氧渊ROS冤尧一氧化氮渊NO冤试剂盒均订购于南京建成生物工程研究所遥1.2仪器与设备CFX Connect 荧光定量 PCR 仪袁 美国 Bio-Rad曰VE-180 垂直电泳槽尧VE-186 转移电泳槽袁天能科技有限公司曰恒温 CO2细胞培养箱袁美国赛默飞公司曰Nanodrop2000袁美国赛默飞公司遥1.3试验方法1.3.1细胞培养与传代细胞生长完全培养基院90 mL RPMI 1640 培养基袁10 mL 特级胎牛血清FBS袁1 mL 双抗遥 细胞培养在 37 益袁5%CO2恒温培养箱中遥当细胞密度达 80%90%时进行传代操作袁弃废弃的完全培养基袁并用 DPBS 洗 3 次袁加入胰酶消化 3 min袁后续使用完全培养基终止消化袁收集细胞于离心管中袁离心渊800伊g冤3 min遥 将得到的沉淀重新用完全培养基重悬袁 并以 1颐3 比例转至大皿中培养遥 传至第 3 代以后进行后续试验遥试验组分为 3 组袁 分别为 50%乙醇组渊E鄄TOH冤袁酱香型酒样组渊JX冤和浓香型酒样组渊NX冤遥1.3.2CCK8 法检测细胞增殖当细胞生长至90%时袁进行细胞传代操作袁加入完全培养基袁对消化得到的细胞进行重悬袁 以 2伊104个/mL 铺至96 孔板袁每孔加入完全培养基 100 滋L袁边缘孔每孔加适量 DPBS 防止液体蒸发遥 在 37 益袁5%CO2恒温培养箱中孵育 12 h袁接着继续给药 72 h遥结束给药后用含 10%CCK8 的完全培养基孵育 2 h袁用酶标仪在波长 450 nm 处检测吸光度遥1.3.3乙醇脱氢酶尧 过氧化氢酶和黄嘌呤氧化还原酶酶活测定预先以 3伊104个/mL HepG2 细胞均匀铺于 6 孔板中袁给药培养 72 h遥之后将废液吸出袁每孔加 DPBS 洗涤细胞袁重复 3 次遥 使用胰酶消化细胞袁以 400 滋L DPBS 重悬遥 将细胞悬液装入 1.5 mL EP 管中袁在液氮-室温环境下反复冻融3 次以破坏细胞膜释放胞内物质袁 后续采用试剂盒标注方法测试遥1.3.4活性氧含量测定将细胞均匀铺在 96 孔板中袁培养 72 h袁待细胞密度达 80%90%袁将废液吸出袁每孔加 100 滋L DPBS 洗涤细胞 3 次袁给药后继续培养 24 h遥 将废液吸出袁DPBS 洗涤细胞后加入 100 滋L 10 滋mol/L DCFH-DA 培养基孵育 1h袁收集细胞后离心袁取沉淀袁用于荧光检测遥1.3.5一氧化氮含量测定使用 96 孔板培养HepG2 细胞袁 在恒温箱中培养 72 h袁 待细胞长满后袁吸出 100 滋L 细胞培养液袁后使用试剂盒标注方法测定 NO 含量遥1.3.6荧光实时定量 PCR将 HepG2 细胞以 3伊104个/mL 密度均匀铺在 6 孔板中袁 共分为 4 组袁即 CTL渊对照组冤尧ETOH尧NX 和 JX遥 均按 ETOH 浓度 100 mmol/L 给药细胞 72 h袁 采用 Trizol 法提取HepG2 细胞的总 RNA袁 并用 DEPC 水完全溶解遥采用微量分光光度计渊Nanodrop冤测定 RNA 浓度袁进行 cDNA 扩增袁最后通过 SYBR green 扩增测定Ct 值遥 基因引物序列参见表 1遥1.3.7统计学分析本试验中数据以平均值依标准偏差表示袁采用单因素方差法分析渊ANOVA冤及图基渊Tukey冤事后检验法分析各组间差异袁*.P0.05袁*.P0.01 表示统计学上存在显著性差异遥基于氧化应激的固态发酵白酒抑制肝癌 HepG2 细胞增殖61中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期乙醇浓度Ethanol concentration/mmol 窑 L-1图 1白酒对 HepG2 细胞增殖的影响Fig.1Effect of Baijiu on cell proliferationof HepG2 cells图 2白酒对 HepG2 胞内乙醇脱氢酶活力的影响Fig.2Effect of Baijiu on intracellular ADHactivity of HepG2图 3白酒对 HepG2 胞内过氧化氢酶活力的影响Fig.3Effect of Baijiu on intracellular CAT activityof HepG2 cells2结果和分析2.1不同乙醇含量的白酒对 HepG2 细胞增殖的影响不同 ETOH 浓度的 NX 和 JX 对 HepG2 细胞增殖的影响见图 1遥在 100 mmol/L ETOH 浓度下袁ETOH 对 HepG2 细胞增殖的抑制作用并不显著袁而 NX 和 JX 均显著抑制 HepG2 的增殖袁 抑制率达 15%袁推测除白酒中存在具有抑制 HepG2 细胞增殖的物质遥2.2白酒对 HepG2 细胞内乙醇脱氢酶的影响ADH 大量存在于哺乳动物的肝脏细胞中袁能协助肝脏细胞代谢乙醇袁 代谢产物经过一系列反应参与三羧酸循环并以二氧化碳和水的形式排出体外遥 由图 2 可知袁 随着 ETOH 浓度的增加袁E鄄TOH尧JX 和 NX 都可显著提高细胞内 ADH 的活力袁三者在同一浓度下对 ADH 活力的调控差异并不显著袁 这表明 ADH 的酶活可能只与白酒中 E鄄TOH 浓度有关袁而受白酒中其它物质的影响较小遥2.3白酒对 HepG2 细胞内氧化应激酶的影响为探究不同风味白酒抑制 HepG2 细胞增殖与氧化应激的关系袁 分别检测 HepG2 内 CAT尧XOD 酶活以及 ROS 和 NO 含量遥CAT 是几乎暴露于氧气的生物体渊如细菌袁植物和动物冤中发现的一种最常见的酶袁其催化过氧化氢分解成水和氧袁是保护细胞免受 ROS 氧化损伤的非常重要的酶遥 如图 3 所示袁JX 对 HepG2 中CAT 的影响显著 性高于 NX 和 ETOH袁 在 50mmol/L ETOH 浓度下袁各组 CAT 相对酶活达到峰值袁JX 处理组的 CAT 活力较 ETOH 组与 NX 组上调近 3.5 倍遥 在 100 mmol/L ETOH 浓度时袁 各组CAT 活力较 50 mmol/L ETOH 浓度时略微下降袁而 JX 处理组较 NX 组 CAT 活力上调 7.7 倍袁较ETOH 组上调 15 倍遥XOD 是黄嘌呤氧化还原酶的一种形式袁它是一种产生活性氧的酶遥 如图 4 所示袁除 25 mmol/LETOH 浓度外袁JX 组在各浓度下对 HepG2 细胞中XOD 活力的影响均显著高于 NX遥ROS 作为线粒体电子传递链的副产物袁 在氧化应激反应时不断产生遥 过量的 ROS 水平会通过产生单一或双重损伤 DNA 嘌呤袁嘧啶或脱氧核糖修饰遥 DNA 交联和 DNA 甲基化模式的修饰袁以此基因名称引物序列渊5爷-3爷冤NRF25爷-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3爷5爷-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3爷NQO15爷-GAAGAGCACTGATCGTACTGGC-3爷5爷-GGATACTGAAAGTTCGCAGGG-3爷GAPDH5爷-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3爷5爷-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3爷表 1引物序列Table 1The sequence of the primer pairs乙醇浓度Ethanol concentration/mmol 窑 L-1乙醇浓度Ethanol concentration/mmol 窑 L-162第 23 卷 第 8 期图 4白酒对 HepG2 胞内黄嘌呤氧化还原酶活力的影响Fig.4Effect of Baijiu on intracellular XODactivity of HepG2图 5白酒对 HepG2 胞内活性氧产生的影响Fig.5Effect of Baijiu on intracellular ROS of HepG2图 6白酒对 HepG2 细胞一氧化氮产生的影响Fig.6Effect of Baijiu on NO productionof HepG2 cells图 7白酒对 HepG2 细胞 NRF2 和 NQO1 表达影响Fig.7Effect of Baijiu on the gene expressionof NRF2 and NQO1 in HepG2 cells对细胞产生影响遥检测结果如图 5 所示袁ETOH尧JX和 NX 对胞内 ROS 含量的促进作用在 12.5 mmol/L ETOH 浓度下达到峰值袁且 JX 显著高于 NX袁然而袁 在更高的 ETOH 浓度下 JX 和 NX 对 ROS 的影响无显著性差异遥部分免疫反应发生时袁 能产生大量的诱导型NOS 和超氧化物阴离子自由基袁 进而合成大量的NO 和 H2O2袁因此检测 NO 可反映细胞氧化应激水平遥 如图 6 所示袁NX 与 JX 相比袁在各浓度下都有着更强的促进 HepG2 细胞生成 NO 的能力遥另外袁当 ETOH 浓度达 100 mmol/L袁JX 较 ETOH 也有显著性的差异遥2.4白酒通过调节 NRF2 及其下游 NQO1 表达参与氧化应激NRF2 是调节细胞氧化应激的重要调控基因袁NQO1 为其下游关键基因遥 ETOH 下调部分 NRF2和 NQO1 的表达袁而 NX 及 JX 引起的抑制作用更加明显袁NRF2 的表达被显著抑制袁 约为对照组的40%遥 同样的袁NX 和 JX 也抑制了 NQO1 的表达袁并且两者的抑制率达到 50%渊图 7冤遥2.5N-乙酰半胱氨酸阻断白酒引起的 HepG2细胞凋亡N-乙酰半胱氨酸 渊NAC冤 作为谷胱甘肽的前体袁因内部带有的巯基能与氧自由基结合袁故其能显著降低氧化应激相关酶的酶活23遥 给予 NAC后袁 不论 NX 还是 JX 对 HepG2 细胞增殖的抑制效果都受到阻断袁如图 8遥 同样的袁NAC 也阻断 JX和 NX 引起的 NRF2 和 NQO1 表达水平的降低遥这一结果说明白酒通过抑制 NRF2 及其下游NQO1 基因的表达参与 HepG2 细胞的氧化应激反应袁进而发挥抑制增殖的作用遥3结论白酒按香型分大致分为 12 种袁其中 NX 和 JX渊a冤渊b冤基于氧化应激的固态发酵白酒抑制肝癌 HepG2 细胞增殖乙醇浓度Ethanol concentration/mmol 窑 L-1乙醇浓度Ethanol concentration/mmol 窑 L-1乙醇浓度Ethanol concentration/mmol 窑 L-163中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期图 8N-乙酰半胱氨酸协同白酒对 HepG2 增殖的影响Fig.8Effect of Baijiu on proliferation of HepG2after treated with NAC图 9N-乙酰半胱氨酸联合白酒对 NRF2 和 NQO1表达的影响Fig.9Effect of Baijiu on the gene expression of NRF2and NQO1 in HepG2 cells after treatment with NAC占市场份额最大遥近几年袁越来越多的研究发现该两种香型白酒的价值遥有研究发现 JX 经氯仿提纯得到的有机化合物能有效提高细胞抗氧化损伤能力24遥 有研究以小鼠肝实质细胞为对象袁发现 NX和 ETOH 对细胞脂质代谢存在显著性差异袁 提示NX 中的某些物质对肝脏脂质代谢存有一定益处25遥 也有研究发现 NX 中存有微量活性物质 4-甲基愈创木酚和 4-乙基愈创木酚袁影响 HepG2 细胞的氧化应激反应20-21遥本研究发现袁当 ETOH 浓度为 100 mmol/L 时JX 和 NX 都显著抑制 HepG2 细胞的增殖袁抑制率达 15%遥 为探究 JX 和 NX 抑制 HepG2 增殖的机制袁分别检测 ADH尧CAT尧XOD尧ROS 和 NO袁结果发现 JX 较 NX 和 ETOH 显著性提高 CAT 与 XOD的酶活袁 而 NX 处理 HepG2 后显著促进 NO 的生成遥 另外袁发现 JX 和 NX 在 100 mmol/L ETOH 浓度下能显著抑制 HepG2 内 NRF2 和 NQO1 的表达遥 同时氧化应激抑制剂 NAC 能阻断 JX 和 NX引起的细胞增殖抑制以及 NRF2 和 NQO1 表达的下调袁说明 JX 和 NX 通过调节 NRF2 和 NQO1 参与氧化应激反应遥总之袁 一定浓度的 NX 和 JX 能抑制 HepG2增殖袁并伴随着 NRF2 和 NQO1 表达下调遥 NX 主要通过促进 NO 的生成袁 而 JX 通过加强 CAT 和XOD 活力调控氧化应激反应遥 推测这一差异主要在于 NX 和 JX 的酿造工艺及原材料不同袁NX 和JX 存在不同的物质基础袁包括多元醇尧不饱和脂肪酸以及一些芳香族化合物等26遥 尽管本研究发现白酒对人肿瘤细胞 HepG2 有一定抑制增殖作用袁而过度饮酒会引起消化系统疾病袁诱导酒精性肝病遥在未来研究中应关注白酒内的活性物质袁挖掘白酒抗肝癌细胞增殖的物质基础及作用机制遥参考文献1宋书玉.一组数据照出中国酒业野发展生态冶J.中国酒袁 2021袁 267渊5冤院 40-45.SONG S Y.A set of data reveals the developmentecology of 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gene expression level of Nuclearfactor erythroid 2-related factor 2渊NRF2冤 and NAD渊P冤H quinone oxidoreductase 1渊NQO1冤 was measured by real-timequantitative PCR渊qRT-PCR冤.Results院 Compared with 100 mmol/L ethanol袁 NX and JX significantly inhibited HepG2proliferation.JX 渊6.25-100 mmol/L冤 had a higher promoting effect than NX on regulation of the XOD and CAT.Howev鄄er袁 NX 渊6.25-100 mmol/L冤 significantly enhanced the production of NO than JX.Both NX and JX 渊100 mmol/L冤 de鄄creased the gene expression of NRF2 and NQO1 in HepG2.Treatment with the antioxidant N-acetylcysteine 渊NAC冤 abol鄄ished the inhibition of cell proliferation and the down-regulation of NRF2 and NQO1 induced by both JX and NX.Con鄄clusion院 Both Luzhou-flavor and Maotai-flavor baijiu may inhibit the proliferation of hepatoma cell line HepG2 throughoxidative stress.KeywordsChinese Baijiu曰 hepatocellular carcinoma曰 oxidative stress曰 cell model66