atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45，No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211024基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响侯冠欣1，马亚娟2，王苗3，孙欣艺1，王利丽1，张闫1，张春晓1，张志强1*(1.河北科技师范学院，河北 秦皇岛 066004；2.河北农业大学，河北 保定 071001；3.武汉市动物疫病预防控制中心，湖北 武汉 430000)摘要：为研究编码ATP合酶琢亚基对大肠杆菌生物学特性的影响，本研究利用姿-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1(WT)基因缺失菌株LCE-1驻(KO)和基因回补株LCE-1驻/pBR322-(RS)，并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上，进一步分析基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响，结果显示，在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异，但在M9培养基中生长明显减缓；KO菌株的部分生化特性也发生了变化，对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变，琢-葡萄糖苷酶、茁葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力，结果显示基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力，结果显示基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定，结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染小鼠进行致病性试验，结果显示，WT菌株的LD50为4.12伊107cfu/mL，KO菌株的LD50为3.43伊108cfu/mL，KO菌株毒力下降1个数量级。本研究构建了大肠杆菌的基因缺失株，并证实AtpA蛋白在细菌的生化特性以及应对各种应激过程中具有重要作用，是大肠杆菌一个重要的多功能蛋白。关键词：貉源致病性大肠杆菌；姿-Red同源重组；基因缺失中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)08-0794-07Effect ofgene deletion on biological characteristics ofLCE-1 from raccoon dogsHOU Guan-xin1,MA Ya-juan2,WANG Miao3,SUN Xin-yi1,WANG Li-li1,ZHANG Yan1,ZHANG Chun-xiao1,ZHANG Zhi-qiang1*(1.Hebei Normal University of Science&Technology,Qinhuangdao 066004,China;2.Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;3.Center for Prevention and Control of Animal Epidemic Disease in Wuhan,Wuhan 430000,China)Abstract:To investigate the effect of the 琢 subunit of ATP synthase on the biological characteristics of(),the atpA gene deletion strain LCE-1驻(KO)was constructed by 姿-Red homologous recombination technique basedon a pathogenicLCE-1(WT)from raccoon dog,and the pBR322-atpA was constructed and transformed into the deletionmutant resulting in the complementary strain LCE-1驻/pBR322-(RS).On this basis,the effects ofgene deletion onthe growth and biochemical characteristics ofwere further analyzed.The results showed that there was no significantdifference between the growth of KO strain and WT strain in LB medium,while the growth of the KO strain obviously slowed收稿日期：2022-11-12基金项目：河北省省级科技计划资助(19226629D)；河北省高等学校科学技术研究项目(BJ2021055)作者简介：侯冠欣(1999-)，女，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事兽医传染病学研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authordown in M9 medium,and some biochemical characteristics of the KO strain altered,for instance the decomposition and utilizationof sucrose and inositol and the activities of 琢-glucosidase,茁-Glucuronic acid and arginine dihydrolase.The biofilm formation(BF)ability of the three strains was evaluated by tube test and microwell test,and it showed that the BF ability of the KO strainsignificantly reduced(0.01).Acid stress,alkali stress,heat stress and oxidative stress were tested to evaluate the stress ability ofthe three strains to environmental changes,the results showed that the sensitivity of the KO strain to acid stress,alkali stress,heatstress and oxidative stress significantly increased.The drug resistance of these three strains was determined by K-B disk method.The results showed that the KO strain were more sensitive to many kinds of antibiotics.The results of pathogenicity test on miceshowed that the LD50of WT strain and KO strain was 4.12伊107cfu/mL and 3.43伊108cfu/mL,respectively,and the virulence of theKO strain decreased by about 10 times compared to the WT strain.In this study,we successfully constructed thegenedeletion strain of,and found that AptA protein is an important multifunctional protein in,which plays an importantrole in the biochemical characteristics of bacteria and in the process of coping with various stress.Key words:pathogenicfrom racoon dogs;姿-Red homologous recombination;-knockout致病性大肠杆菌的感染非常普遍，多引起宿主以腹泻为特征的肠道感染，也可以造成多类型的肠道外感染1。在毛皮动物养殖中，由致病性大肠杆菌引起的毛皮动物肺炎近年来较为常发，且危害大，表现为呼吸道障碍为主的临床症状和肺、肾等多器官组织的出血性病理变化2。由于血清型复杂，目前针对大肠杆菌病的治疗仍以抗生素为主，但日益严重的菌株耐药问题给该病的防控带来重大困扰3。ATP是生命体储存和供给能量的主要形式，是生物生存必须物质，它的合成主要依赖于生物有氧呼吸和糖酵解两种方式。ATP合酶是普遍存在于生命体内的一种较为保守的多组分酶，能够以呼吸链产生的质子动力驱动合成ATP，是生命体有氧呼吸产能的关键酶4。在专性需氧菌中，ATP合酶是必需酶，与细菌生存相关5。抗结核药贝达喹啉即是通过抑制ATP合酶活性发挥抑菌活性6。ATP合酶同样存在于专性厌氧菌和兼性菌中，虽然其并不是细菌生存所必需，但其可以影响细菌的胞膜的极化状态以及致病过程5,7。大肠杆菌和沙门菌是典型的兼性菌，可以通过有氧呼吸和底物水平磷酸化两种方式提供能量，这是这些病原菌在体内外复杂环境中得以生存并造成感染的重要因素8。ATP合酶已被证实与沙门菌的胞内感染过程相关，并影响细菌毒力9，在大肠杆菌，ATP合酶是否同样具有相似的作用，尚不明确。本研究选取貉源大肠杆菌ATP合酶关键亚基琢编码基因，采用姿-Red同源重组技术缺失该基因后，分析ATP合酶对大肠杆菌生物学特性的影响，为基因功能的进一步研究奠定基础，同时也为貉源大肠杆菌致病机制的研究提供参考资料。1材料与方法1.1菌株、质粒及主要试剂貉源大肠杆菌LCE-1感受态细胞(以下简称WT菌株)、pKD46、pKD3、pCP20质粒由河北省预防兽医学重点实验室提供；DL2000 DNA Marker购自北京康为世纪生物技术有限公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo公司；L-阿拉伯糖购自Sigma公司。1.2-Red同源重组引物的设计与合成根据NCBI登录的大肠杆菌基因组序列(CP000468.1)设计引物(表1)。P1/P2用于从pKD3质粒中扩增打靶片段，引物由两部分组成：5端加下划线的部分与待敲除基因序列同源，3端未加下划线部分与质粒pKD3氯霉 素 抗 性 基 因两 侧 序 列 互 补。P3/P4 引 物 为pKD46质粒的鉴定引物，P5/P6引物位于基因开放阅读框外侧，用于缺失株的鉴定。P7/P8引物用于扩增基因完整开放阅读框，构建回补质粒。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司成。1.3貉源大肠杆菌基因缺失株及回补株的构建参考文献10，将pKD46质粒电转入LCE-1感受态细胞中，以pKD3质粒为模板，利用P1/P2引物扩增打靶片段基因，将其电转化含pKD46质粒的大肠杆菌LCE-1中，获得LCE-1/pKD46:，挑取单菌落进行PCR(P5/P6引物)鉴定正确后电转化pCP20质粒，即利用其FLP重组酶消除基因，获得缺失菌株侯冠欣，等.基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响第 8 期795LCE-1驻(以下简称KO菌株)，阳性菌42 培养以消除pKD46质粒，对该菌株利用引物P5/P6经PCR及测序鉴定。以大肠杆菌LCE-1基因组为模板，利用P7/P8引物扩增基因片段，克隆至pBR322载体中，构建回补质粒pBR322-，并经PCR(P7/P8引物)及测序鉴定。将其电转入缺失菌株LCE-1驻，构建回补菌株LCE-1驻/pBR322-(以下简称RS菌株)，采用PCR(P5/P6引物)及测序鉴定。并设置WT菌株、KO菌株作为对照，对比3株菌扩增片段的大小。1.4细菌生长曲线的测定将WT、KO、RS 3株菌37 培养至对数生长期(OD600nm值1.0左右)，取3种菌液按照1颐100比例分别接种LB和M9培养基中，37 同步培养，每隔1 h取样测定其OD600nm值，直至细菌进入平台期。重复上述试验3次，根据OD660nm值绘制生长曲线，比较WT、KO、RS 3株菌的生长特性。1.5细菌生化特性的测定利用自动生化鉴定系统(bioMerieux法国LAF020945)对WT、KO、RS 3株菌的生化特性进行比较。用固体培养基复苏WT、KO、RS 3株菌。刮取菌落加1 mL无菌生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度到0.5个麦氏浊度，分别吸取40 滋L菌液滴于生化鉴定卡检测孔中，06号孔每孔加入一滴液体石蜡，湿盒中37 培养16 h，将测试卡上机鉴定。1.6生物被膜(BF)形成能力的测定将WT、KO、RS 3种菌液接种至LB液体培养基中，37 振荡培养过夜。次日转接至液体培养基中，设置3个平行试验，28 培养48 h，然后洗去培养基，加入无水甲醇固定BF，结晶紫染色观察BF的形成能力。将WT、KO、RS 3种菌液37 振荡培养过夜培养，次日转接于96孔板中，28 培养48 h，设置3个空白对照和12个平行试验。用无水甲醇固定BF，加入结晶紫染色后清洗，测OD570nm值。根据OD570nm值分析各菌株BF的形成能力。1.7细菌对环境应激抵抗力的测定将 WT、KO、RS 3株菌接种于液体培养基中，过夜培养，次日转接至液体培养基中，培养至OD600nm=1。离心弃上清，1 mL PBS重悬，10倍倍比稀释，滴板，菌落计数。将3种菌液按1颐100的体积比分别转接于酸性(pH3.5)、碱性(pH10.5)条件下37培养1 h；42热应激条件下培养1 h；氧化应激条件为于含10 mmoL/L H2O2的生理盐水中培养1 h。对各应激条件下所培养的细菌进行平板计数后分析存活率，采用Prism5.0软件分析实验数据。1.8药敏试验参照文献10，利用K-B纸片法检测WT、KO、RS 3株菌对茁-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类以及青霉素类抗生素的敏感性。将WT、KO、RS 3种菌液均匀涂布于LB固体培养基的表面，贴药敏纸片后37 过夜培养观察。用卡尺测量抑菌圈直径的大小。1.9细菌的致病性试验参照文献方法11，利用BALB/c小鼠模型测定大肠杆菌各菌株的半数致死量(LD50)，以评估各菌株的致病力。将110只BALB/c小鼠随机均分为11组，每组10只，15组为WT菌株感染组，610组为KO菌株感染组，第11组为对照组。将WT和KO菌株37，振荡培养过夜，各菌株用等量的无菌PBS洗涤后3 500 r/min离心5 min，弃上清，进行平板计数。调整为同一浓度后10倍倍比稀释为5个稀释度，各稀释度按分组以200 滋L/只注射，对照组小鼠注射等量的无菌PBS，记录14 d实验组小鼠的存活数量，无菌摘除死亡小鼠的肝脏和脾脏，利用寇氏法计算WT和KO菌株LD50，分析两菌株致病性。2结果2.1貉源大肠杆菌基因缺失株以及回补株的构建与鉴定结果利用姿-Red同源重组技术缺失LCE-1表 1PCR 引物信息引物名称PrimersP1P2P3P4P5P6P7P8引物序列(5-3)Sequences(5-3)GAGTGAAGCTCACAACGAAGGTACTATTGTTTCTGTAAGTGACGGTGTTATCCGCATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAGATCTGACGGTAAGCAACAGCCTGTTTAGACAGGTCATCGTAAATGATCAGCGCATCTATGGGAATTAGCCATGGTCCATGAGTACTGCACTCGCAACGTCATGCTGCCACCTTCTGCTGTGAGTGAGGCTACCGCTGAGCCACGGAGTTGAAGAACGACATTTCTGTAAGTGACGGTGTTATCCAACGCTGCCAGTTCACGATA扩增片段长度(bp)Amplicon length(bp)11047862223/1442*/621*1123注：*为LCE-1/pKD46:扩增片段大小；*为LCE-1驻扩增片段大小Note:*amplicon length of LCE-1/pKD46:;*amplicon length ofLCE-1驻中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年796菌株的基因，获得基因缺失株LCE-1驻和基 因 回 补 株 LCE-1驻/pBR322-。将WT、KO、RS菌株进行PCR鉴定及测序，结果显示WT、KO、RS菌株扩增片段分别为1 123 bp、623 bp和1 123 bp，与预期结果均一致(图1)，表明正确构建貉源大肠杆菌基因缺失株LCE-1驻以及回补株LCE-1驻/pBR322。2.2细菌生长曲线的测定将 WT、KO、RS 3株菌分别在LB和M9液体培养基中培养，测定各培养时间的OD600nm值，绘制WT、KO、RS 3株菌的生长曲线图。结果显示，在LB培养基中三者的生长速率无明显差异(图2A)；在M9培养基中KO和RS菌株的生长速率均有不同程度的减慢，而且KO菌株培养6 h就达到了平台期(图2B)。表明基因缺失后，大肠杆菌可以利用某些碳源通过非ATP合酶途径供能。2.3细菌生化特性的测定利用自动生化鉴定系统对WT、KO、RS菌株进行生化特性比较。结果显示，与WT、RS菌株相比，基因缺失后大肠杆菌对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变，对琢-葡萄糖苷酶、茁葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生改变(表2)，表明能够影响大肠杆菌的代谢。2.4BF形成能力的测定结果利用试管法以及微量结晶紫法测定WT、KO、RS 3株菌BF形成能力，结果显示，KO菌株的BF明显比WT、RS菌株颜色浅，同时KO菌株的OD570nm值极显著低于WT菌株(0.01)，也低于RS菌株(图3、图4)。表明基因缺失后大肠杆菌BF形成能力下降。2.5细菌对环境应激抵抗力的测定结果对WT、KO、RS菌株进行酸应激(pH3.5)(图5A)、碱应激(pH10.5)(图5B)、氧化应激(H2O2)(图5C)以及热(42)应激(图5D)处理后平板计数。结果显示KO菌株的存活率极显著低于WT菌株(0.001，图5)，与WT菌M:DM5000 Plus DNA Marker;1:LCE-1;2:LCE-1驻;3:LCE-1驻/pBR322-图1大肠杆菌基因缺失株及回补株的PCR鉴定结果图2各菌株生长曲线测定结果侯冠欣，等.基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响第 8 期797M1235000bp3000bp2000bp1000bp700bp500bp250bp100bp表 2生化鉴定结果生化检测项目Biochemical testing items脂酶LIP茁N乙酰葡萄糖胺 茁NAGd-麦芽糖MALd-葡萄糖GLU蔗糖SACd-半乳糖酸盐同化GAT尿素酶URE精氨酸双水解酶ADH肌醇INO琢-麦芽糖 琢MALd-纤维二糖CEL茁-半乳糖苷酶 茁-GALL天冬氨酸芳胺酶AspAd-海藻糖TRE琢-葡萄糖苷酶 琢GLUL-阿拉伯糖LARA鸟氨酸脱羧酶ODC肌醇INDd-甘露醇MAN酚红RP5酮基葡糖酸盐5KGL-阿拉伯醇LARL赖氨酸脱羧酶LDC茁-葡萄糖苷酶 茁GLU丙二酸盐MNTd-山梨醇SOR茁 葡萄糖醛酸酶 茁GUR侧金盏花醇ADOL-鼠李糖RHA琢-半乳酸苷酶 琢GALD-阿拉伯醇DARL古老糖PLE-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-LCE-1LCE-1驻LCE-1驻/pBR322-Incubation time(hours)3210Incubation time(hours)3210WTKORSWTKORS151050151050AB抗生素Antibotics株相比，KO菌株抵抗应激的能力下降，RS菌株抵抗应激的能力有所恢复。表明基因调控大肠杆菌对抗酸应激、碱应激、氧化应激以及热应激。2.6药敏试验结果利用K-B纸片法对WT、KO、RS 3株菌的耐药性进行分析，结果显示，与WT、RS菌株相比，缺失后大肠杆菌对药物敏感性的提升不仅仅局限于氨基糖苷类和多肽类抗生素，对茁-内酰胺类和青霉素类抗生素的敏感性也不同程度的提高(表3)。表明基因影响大肠杆菌对氨基糖苷类和多粘菌素B，茁-内酰胺类抗生素和青霉素类抗生素的敏感性。2.7细菌的致病力试验结果利用小鼠模型测定WT和KO菌株的LD50，结果显示两株菌的LD50分别为4.12伊107cfu/mL和3.43伊108cfu/mL(表4)，相差10倍，表明缺失株毒力显著下降，提示基因与大肠杆菌毒力的密切联系。图3试管结晶紫法图4微量结晶紫法*:0.001A：酸性应激；B：碱性应激；C：氧化应激；D：热应激A:Acid stress;B:Alkaline stress;C:Oxidative stress;D:Heat stress图5细菌对环境应激能力的测定结果表 3LCE-1、LCE-1驻、LCE-1驻/pBR322-药敏试验结果头孢菌素类Cephalosporins喹诺酮类Quinolones多肽类Peptides氨基糖苷类Aminoglycosides茁-内酰胺类茁-lactams青霉素类PenicillinsWT strain1327824221218201023-KO strain3032242220161816-26261824RS strain25262025211421201825231622抑菌圈直径/mmDiameters of inhibition zone/mm头孢哌酮Cefoperazone头孢吡肟Cefepime头孢唑啉Cefazolin环丙沙星Ciprofloxacin氧氟沙星Ofloxacin多粘菌素 茁Polymyxin 茁丁胺卡那Amikacin氯霉素Chloramphenicol阿奇霉素Azithromycin大观霉素Spectinomycin氨苄西林Ampicillin羧苄西林Carbenicillin哌拉西林Piperacillin表 4LCE-1 株和 LCE-1驻株的 LD50测定结果菌株StrainLCE-1LCE-1驻PBS攻菌剂量(cfu/mL)Inoculum dose(cfu/mL)1伊1051伊1061伊1071伊1081伊1091伊1061伊1061伊1071伊1081伊1091伊PBS死亡情况Mortality0/100/103/106/1010/100/100/100/101/104/100/104.12伊1073.43伊108LD50/cfu/mLWTKORSWTKORS0.30.20.10*ABCD中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年798*150100500150100500WTKORSWTKORSWTKORSWTKORS50403020100150100500*抗生素种类Antibiotic types3讨论ATP合酶是一个由多组分构成的酶复合体，主要由膜内区F0和胞浆二者区F1组成，二者由中心轴和辅助支架连接，共同发挥作用，导致细胞代谢的重大变化。F0区是由a、b和c 3个亚基组成，F1区由琢、茁、酌、啄和着 5个亚基组成，每个亚基都是ATP合酶发挥作用必不可少的单元。贝特喹啉即是通过干预着亚基来抑制ATP合酶活性，进而发挥抗结核分枝杆菌活性。F1区的琢亚基由基因编码，与AT-Pase活力密切相关12，因此本研究以基因为对象，分析ATP合酶对大肠杆菌生物学特性的影响。大肠杆菌是兼性菌，可以利用单一碳源以有氧呼吸和底物磷酸化两种方式提供能量8。有研究表明，ATP缺失虽然并不会影响兼性菌在有氧条件下的生存，但会影响细菌的生长13。本研究发现在LB培养基中，KO菌株生长速度与WT菌株无明显差异，但在单一葡萄糖碳源培养基中，其生长远弱于WT菌株，表明大肠杆菌可以利用某些碳源通过非ATP合酶途径供能，这与铜绿假单胞菌的结果类似，铜绿假单胞菌可以利用精氨酸和丙酮酸供能14。ATP合酶失活不仅影响细菌供能方式向糖酵解转变，还会导致一系列代谢过程的改变，以及呼吸率和膜电位的改变13。本研究分析了基因缺失后大肠杆菌的部分生化特性，发现基因缺失会使大肠杆菌倾向于利用蔗糖和肌醇，同时一些代谢相关酶也发生了改变，其具体机制有待于进一步研究。大肠杆菌的耐药问题是临床治疗的重大困扰，在对大肠杆菌和葡萄球菌进行耐药相关基因的检测发现，ATP合酶缺失能够增加这两种细菌对氨基糖苷类和多肽类抗生素的敏感性，本研究也利用K-B纸片法对基因缺失后大肠杆菌对抗生素敏感性进行了评估，发现缺失后大肠杆菌对抗生素敏感性的提升不仅仅局限于氨基糖苷类和多粘菌素B，对其它的待测抗生素的敏感性也不同程度的提高。在金黄色葡萄球菌的研究中发现，ATP合酶与细菌BF形成相关12，本研究也证实了基因缺失后大肠杆菌BF形成能力下降，这也可以作为基因缺失大肠杆菌对多种抗生素敏感性普遍升高的一个解释。在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌的研究中都发现，ATP合酶失活会引起细菌胞内超氧化物自由基和过氧化氢水平上升12,15-16，而一部分抗生素抗菌活性的发挥则是依赖于该类物质，这也从另一方面解释了基因缺失所引起的大肠杆菌抗生素敏感性提高。ATP合酶失活不仅会引起细菌内部氧自由基的增多，也会导致细菌对外界活性氧的耐受性降低17，本研究的结果也证实了这一结果，基因缺失不仅大幅度降低大肠杆菌对过氧化氢的耐受力，对酸性、碱性以及热应激的敏感性均显著升高。ATP合酶缺失能够引起细菌毒力下降已在多种细菌中得到证实，这种毒力减弱变化可能由生长减缓、抗应激能力降低、溶血能力降低、BF形成能力减弱，对机体抗菌肽抵御能力降低等因素造成5。沙门菌等胞内菌中，ATP合酶更是被证实是有效的疫苗靶点，有望在后续针对该酶开发相应疫苗，以期在疾病防控中发挥作用。本研究利用小鼠模型评估基因缺失对貉大肠杆菌致病力的影响，发现基因缺失能够造成大肠杆菌毒力的显著下降1个数量级，表明ATP合酶与大肠杆菌毒力的密切关系。本研究构建了貉大肠杆菌ATP合酶琢亚基缺失菌株并评测了其生物学特性，证实了其与大肠杆菌生长、生化、BF形成、抗应激能力以及细菌毒力均密切关系，为进一步研究ATP合酶功能、大肠杆菌病的防控手段提供依据。参考文献：VILA 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