基于TLR4_MyD88_TRAF6信号通路探究电针对类风湿关节炎大鼠滑膜组织的影响.pdf

1102 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 文章编号:1005-0957(2023)10-1102-07 动物实验 基于 TLR4/MyD88/TRAF6 信号通路探究电针对类风湿关节炎大鼠滑膜组织的影响 苏俊贤,张誉,王志朝,罗倩,许志强,李凌瑶,郑双双(甘肃省庆阳市第二人民医院,庆阳 745000)【摘要】目的 观察电针干预通过调控 Toll 样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)/肿 瘤 坏 死 因 子 受 体 相 关 因 子 6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)通路对类风湿关节炎大鼠滑膜组织的影响,探究 TLR4/MyD88/TRAF6 信号通路作为电针干预新靶点的可能性。方法 将 48 只 Wistar 大鼠随机分为健康组、模型组、电针组和电针通路激活组,每组 12 只。制备类风湿关节炎大鼠模型,术后采用关节炎指数评分将符合类风湿关节炎诊断标准的大鼠进行后续实验,同时采用关节炎指数评估干预前后关节炎的改善情况。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法检测 4 组大鼠关节损伤及滑膜组织状况,用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测关节液肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和滑膜组织增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的含量,用流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率。采用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白印迹(Western blot,WB)法检测 4 组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 蛋白的表达。结果 健康组关节结构完整无病变;与健康组比较,模型组大鼠关节结构不完整,出现滑膜增生,关节炎指数评分显著升高(P0.05),TNF-、IL-1和 PCNA 的含量、软骨细胞凋亡率及滑膜组织中 TLR4、MyD88 和 TRAF6 mRNA蛋白的表达均显著升高(P0.05);与模型组比较,电针组关节结构相对完好,关节炎指数评分显著降低(P0.05),TNF-、IL-1和 PCNA 的含量、软骨细胞凋亡率及滑膜组织中 TLR4、MyD88 和 TRAF6 mRNA 蛋白的表达均显著降低(P0.05);与电针组比较,电针通路激活组关节炎指数评分显著升高(P0.05),TNF-、IL-1和 PCNA的含量、软骨细胞凋亡率及滑膜组织中 TLR4、MyD88 和 TRAF6 mRNA 蛋白的表达均显著升高(P0.05)。结论 电针干预可通过调控 TLR4/MyD88/TRAF6 信号通路,改善类风湿关节炎,并保护滑膜组织。【关键词】针刺疗法;电针;关节炎,类风湿;Toll 样受体 4;髓样分化因子 88;肿瘤坏死因子受体相关因子 6【中图分类号】R2-03 【文献标志码】A DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2023.10.1102 Study of the effect of electroacupuncture on synovial tissues in rats with rheumatoid arthritis based on TLR4/MyD88/TRAF6 signaling pathway SU Junxian,ZHANG Yu,WANG Zhichao,LUO Qian,XU Zhiqiang,LI Lingyao,ZHENG Shuangshuang.Qingyang Second Peoples Hospital of Gansu Province,Qingyang 745000,China Abstract Objective To observe the effect of electroacupuncture on synovial tissues in rats with rheumatoid arthritis(RA)by regulating the signaling pathway Toll-like receptor 4(TLR4)/myeloid differentiation primary response protein 88(MyD88)/tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)and discuss the possibility of this signaling pathway as a novel target for electroacupuncture intervention.Method Forty-eight Wistar rats were randomized into a healthy group,a model group,an electroacupuncture group,and an electroacupuncture+pathway 基金项目:甘肃省庆阳市科学技术局项目(2019y0007)作者简介:苏俊贤(1979),男,副主任医师,Email: 上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1103 activation group,with 12 rats in each group.The RA rat models were established.After the modeling operation,the rats whose arthritis index score met the RA diagnosis criteria continued the following experiments.The arthritis index was used to evaluate the improvement in arthritis after intervention.Hematoxylin-eosin(HE)staining was used to examine joint damage and synovial tissues of the four groups of rats;the enzyme-linked immunoassay(ELISA)was used to detect the contents of tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin-1(IL-1)in the synovial fluid and the content of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in the synovial tissues;flow cytometry was used to determine the apoptosis rate of chondrocytes.The mRNA and protein expression levels of TLR4,MyD88,and TRAF6 in the synovial tissues were detected using the fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR).Result In the healthy group,the joint structure was intact and showed no lesions.Compared with the healthy group,the joint structure was incomplete,synovial hyperplasia appeared,and the arthritis index score increased significantly in the model group(P0.05),together with notable increases in the contents of TNF-,IL-1,and PCNA,chondrocyte apoptosis rate,and TLR4,MyD88,and TRAF6 mRNA and protein expression in the synovial tissues(P0.05).Compared with the model group,the joint structure was relatively intact,and the arthritis index score decreased markedly in the electroacupuncture group(P0.05),together with significant decreases in the contents of TNF-,IL-1,and PCNA,chondrocyte apoptosis rate,and TLR4,MyD88,and TRAF6 mRNA and protein expression in the synovial tissues(P0.05).Compared with the electroacupuncture group,the arthritis index score was significantly higher in the electroacupuncture+pathway activation group(P0.05),and the contents of TNF-,IL-1,and PCNA,chondrocyte apoptosis rate,and TLR4,MyD88,and TRAF6 mRNA and protein expression in the synovial tissues all increased significantly(P0.05).Conclusion Electroacupuncture intervention can improve RA and protect synovial tissues by regulating the TLR4/MyD88/TRAF6 signaling pathway.Key words Acupuncture therapy;Electroacupuncture;Arthritis,Rheumatoid;Toll-like receptor 4;Myeloid differentiation primary response protein 88;Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 类风湿关节炎作为常见的慢性关节炎疾病,主要危害关节滑膜引起滑膜炎1,造成软骨组织的磨损,严重时甚至会导致关节畸形,丧失全部功能2。目前该疾病主要通过抗炎药物以及抗风湿药物进行治疗,治疗目的主要在于缓解和减轻关节炎症,保护关节,抑制病情的发展,而新的治疗方法还有待探索3-4。类风湿关节炎受多条信号通路的影响,Toll 样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)协 同 髓 样 分 化 因 子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)以及下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factorreceptor associated factor 6,TRAF6)是参与其发生发展的重要影响因子5。TLR4 属于模式识别受体,常作用于免疫细胞表面,参与识别病原相关分子,在诱导免疫应答和炎症反应中发挥重要作用6。MyD88 作为 Toll 样受体信号转导通路的下游蛋白,在传递上游信息后直接诱发疾病7,同时也可与TRAF6结合,激活致病因子,诱发炎症疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病等5。随着临床医学的进一步发展,近年来电针干预逐渐被医学界认可,并得到广泛的关注和支持8。电针能明显改善类风湿关节炎患者的关节疼痛,还能抑制大鼠胶原诱导型关节炎的炎症反应和骨质破坏9-10。由于电针干预可以有效改善炎症反应,抑制炎症递质的产生,因此已被应用于治疗类风湿关节炎等多种炎症疾病11,但其治疗类风湿关节炎时对滑膜组织具有怎样的作用及其作用机制还有待探索12。本研究基于TLR4/MyD88/TRAF6 信号通路观察电针干预对类风湿关节炎大鼠滑膜组织的影响,探究 TLR4/MyD88/TRAF6信号通路作为电针干预新靶点的可能性。1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 实验动物为 SPF 级健康成年 Wistar 大鼠购于北京祥瑞生物制品有限公司,许可证号 SYXK(京)2018-0029,体质量(20010)g,共计 48 只。大鼠在恒定的温度(252),湿度 50%70%和 12 h 光/12 h 暗循环1104 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 的环境下饲养,随意进食标准饲料和饮水。所有动物实验均在甘肃省庆阳市第二人民医院动物实验中心进行。48 只大鼠随机分为健康组、模型组、电针组和电针通路激活组,每组 12 只。1.2 主要试剂与仪器 型胶原酶(Gibco 公司,货号 C21901),血清肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒(上海邦景实业有限公司,货号BJ-S965453),白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)ELISA 检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,货号 ml112819),增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)ELISA 检测试剂盒(上海沪峥生物科技有限公司,货号 HS2297),TLR4/MyD88/TRAF6通 路 激 活 剂 脂 多 糖(lipopoly-saccharide,LPS)(北京百奥莱博生物科技有限公司,货号YT332),TLR4抗体(货号ab13556)、MyD88抗体(货号 ab219413)、TRAF6 抗体(货号 ab40675)和 GADPH 抗体(货号 ab9485)均购于 abcam 公司。荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(ABI 公司,7500),凝胶成像系统(上海生工生物有限公司,HE-120),温热电灸综合治疗仪(苏州好博医疗器械股份有限公司,HB-WZ1)。1.3 干预方法 模型组、电针组和电针通路激活组大鼠根据参考文献13-14提供的方法在背部皮下多点注射 1 mL 型胶原酶乳制剂(1 g/L,完全弗氏佐剂均匀乳化),此为初次免疫;1 周后在大鼠尾根部注射 0.2 mL 型胶原酶乳制剂以加强免疫,进而构建胶原诱导关节炎模型。健康组注射等量的生理盐水。初次免疫后第 14 天进行关节炎指数评分关节部位出现部分炎症反应为 0 分,小趾关节一并出现炎症反应为 1 分,小趾延伸至足部均出现炎症为 2 分,踝关节附近连同下部出现炎症反应为 3 分,踝关节及以下各部位均呈炎症状态为 4 分,模型组、电针组和电针通路激活组关节炎指数3 分时即为构建模型成功14。加强免疫后,模型组不做处理,电针组和电针通路激活组用 0.25 mm12 mm 针灸专用针刺入大鼠双侧四关穴(“合谷”和“太冲”),针头平刺进入 2.5 mm,接通温热电灸综合治疗仪导入电流(“合谷”接正极,“太冲”接负极,同侧穴位连一组电极),强度 2 mA,疏密波,频率为 5 Hz/15 Hz,治疗20 min。每日 1 次,持续 10 d。电针通路激活组每次电针结束后,腹腔内注射 1 mL LPS 溶液(1 mg/mL,生理盐水稀释);电针组注射等量的生理盐水。末次干预后进行关节炎指数评分。1.4 踝关节病理学变化 末次干预后,麻醉大鼠,剖开足部露出踝关节,向关节腔中注射 1 mL 生理盐水,回抽关节液 1 mL 冻存备用;取出踝关节,部分用于制备切片样品,剩余部分液氮处理冻存备用。切片样品采用甲醛固定,骨组织脱钙液脱钙处理,常规方法制作切片,厚度 5 m。严格按照染色试剂盒说明书方法染色处理,显微镜下观察病理学变化。1.5 关节处病理学指标检测 1.5.1 滑膜组织 取出预先冻存的关节液,3 000 r/min 离心 4 min,取上层液体,按照试剂盒说明书方法检测 IL-1和TNF-含量。取出部分预先液氮处理的踝关节滑膜组织,研磨成粉,加入组织裂解液充分裂解,静置 5 min,取上层清液,根据 ELISA 试剂盒说明书方法检测 PCNA含量。1.5.2 软骨组织 踝关节处剥离软骨组织,剪碎后加入胰蛋白酶消化 1 h,接着加入型胶原酶过夜消化,3 000 r/min离心 4 min,弃上清,加入 80 L 结合缓冲剂重悬细胞,加入 10 L 碘化丙啶和 Annexin V-FITC 的混合溶液,孵育 15 min,加入 500 L 结合缓冲剂,充分清洗,上机检测软骨细胞凋亡情况。1.6 荧光定量 PCR 检测 取出部分预先液氮处理的踝关节滑膜组织,研磨成粉,用总 RNA 提取试剂(total RNA extraction reagent,TRIZOL)提取总 RNA,利用反转录试剂盒将总RNA 反转录为 cDNA,上机检测 TLR4、MyD88 和 TRAF6的 mRNA 表达水平。引物序列由北京擎科生物技术有限公 司 合 成。G A P D H S e n s e p r i m e r为AGTTCAACGGCACAGTCAAG,Antisense primer 为TACTCAGCACCAGCATCACC;TLR4 Sense primer 为CGCTCTGGCATCATCTTCAT,Antisense primer 为CGAGGTAGGTGTTTCTGCTAAG;MyD88 Sense primer 为CTTGTTCTCTCTACCGTTGGTC,Antisense primer 为CCAAGTACTCGAAACCCATCTC;TRAF6 Sense primer 为GCGCTGTGCAAACTACATTT,Antisense primer 为上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1105 AAGGATCGTGAGGCGTATTG。采用 2Ct法计算 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA 相对表达量。1.7 蛋白印迹(Western blot,WB)法检测 取部分大鼠踝关节滑膜组织,液氮处理研磨成粉,加入裂解液,提取蛋白并测定其浓度,变性处理后加入12%SDS-PAGE 凝胶孔道,电泳结束后转膜处理,TBST清洗3次,每次10 min,5%脱脂奶粉于水平摇床封闭2 h,加入一抗(TLR4 抗体、MyD88 抗体、TRAF6 抗体、GAPDH抗体,1:500),4 下过夜。弃封闭液,TBST 清洗 3 次,每次 10 min。加入二抗(1:1 500),室温下孵育40 min,TBST 清洗 3 次,每次 10 min,风干后倒入混合显色液,浸泡 1 min,将膜取出,吸干多余液体,置于凝胶成像系统上进行条带灰度分析。1.8 统计学分析 采用 SPSS25.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用均数标准差表示,组间差异比较用单因素方差分析,数据两两比较采用 SNK-q检验。以P0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果 2.1 4 组干预前后关节炎指数评分比较 干预前和干预后,模型组、电针组和电针通路激活组关节炎指数评分均显著高于健康组(P0.05);电针组和电针通路激活组干预后关节炎指数评分较干预前显著降低(P0.05);电针组和电针通路激活组干预后关节炎指数评分均低于模型组(P0.05);电针通路激活组干预后关节炎指数评分较电针组显著升高(P0.05)。详见表 1。表 1 4 组干预前后关节炎指数评分比较(xs)单位:分 组别 n 干预前 干预后 健康组 12 0.000.00 0.000.00 模型组 12 6.580.551)6.630.511)电针组 12 6.650.521)4.720.431)2)3)电针通路激活组 12 6.620.531)6.210.351)2)3)4)注:与健康组比较1)P0.05;与同组干预前比较2)P0.05;与模型组比较3)P0.05;与电针组比较4)P0.05。2.2 干预后 4 组大鼠踝关节病理变化比较 健康组大鼠关节结构完整,无炎性细胞浸润,组织表面光滑平整,滑膜组织及软骨组织细胞排列紧密;模型组大鼠关节结构不完整,出现严重磨损,软骨组织存在大量炎性细胞,滑膜组织增厚明显;电针组大鼠关节结构轻度破坏,破坏程度较模型组轻,有少量炎性细胞浸润,滑膜组织厚度趋于正常;电针通路激活组大鼠关节结构破坏较电针组严重,有部分炎性细胞浸润,滑膜组织增生加重。详见图 1。健康组 模型组 电针组 电针通路激活组 图 1 干预后 4 组大鼠踝关节病理变化图(HE40)2.3 4 组关节处病理学指标比较 与健康组比较,其余 3 组关节液中 TNF-、IL-1和滑膜组织中 PCNA 的含量以及软骨细胞凋亡率均显著升高(P0.05);与模型组比较,电针组和电针通路激活组关节液中 TNF-、IL-1和滑膜组织中 PCNA 的含量以及软骨细胞凋亡率均显著降低(P0.05);与电针组比较,电针通路激活组关节液中 TNF-、IL-1和滑膜组织中 PCNA 的含量以及软骨细胞凋亡率均显著升高(P0.05)。详见图 2 和表 2。2.4 4 组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA表达水平比较 模型组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6的 mRNA 表达水平显著高于健康组(P0.05),电针组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA 表达水平显著低于模型组(P0.05),电针通路激活组 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA 表达水平显著高于电针组(P0.05)。详见表 3。1106 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 健康组 模型组 电针组 电针通路激活组 图 2 流式细胞仪检测 4 组软骨细胞凋亡情况图 表 2 4 组大鼠 TNF-、IL-1和 PCNA 含量及软骨细胞凋亡率比较(xs)组别 n TNF-/(pgmL1)IL-1/(ngmL1)PCNA/(ngmL1)细胞凋亡率(%)健康组 12 64.5717.81 0.780.17 4.921.74 5.161.83 模型组 12 124.6214.721)1.890.261)20.782.321)21.042.311)电针组 12 79.6523.241)2)1.230.311)2)8.621.411)2)11.654.161)2)电针通路激活组 12 107.7315.411)2)3)1.580.231)2)3)14.521.841)2)3)16.722.311)2)3)注:与健康组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05;与电针组比较3)P0.05。表 3 4 组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA 表达水平比较(xs)组别 n TLR4 mRNA MyD88 mRNA TRAF6 mRNA 健康组 12 1.000.04 1.000.06 1.000.23 模型组 12 3.370.141)3.740.311)8.250.751)电针组 12 1.340.231)2)1.410.171)2)3.260.341)2)电针通路激活组 12 2.870.211)2)3)2.640.261)2)3)6.140.571)2)3)注:与健康组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05;与电针组比较3)P0.05。2.5 4 组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的蛋白表达水平比较 模型组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的蛋白表达水平均显著高于健康组(P0.05),电针组滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的蛋白表达水平均显著低于模型组(P0.05),电针通路激活组大鼠滑膜组织TLR4、MyD88 和 TRAF6 的蛋白表达水平显著高于电针组(P0.05)。详见图 3 和表 4。图 3 4 组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的蛋白表达条带图 表 4 4 组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的蛋白表达水平比较(xs)组别 n TLR4/GAPDH MyD88/GAPDH TRAF6/GAPDH 健康组 12 0.590.09 0.640.05 0.670.06 模型组 12 2.650.171)3.270.411)2.740.141)电针组 12 0.740.111)2)1.270.241)2)1.040.221)2)电针通路激活组 12 2.060.131)2)3)2.130.261)2)3)1.860.231)2)3)注:与健康组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05;与电针组比较3)P0.05。上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1107 3 讨论 类风湿关节炎属全身性自身免疫疾病,以慢性危害关节为特征,伴有淋巴结肿大、皮下结节,滑膜组织病变残缺等特征,严重时会导致畸形,造成不同程度的残疾。滑膜组织参与了病变的整个过程,近年来滑膜组织病理学不断完善,滑膜病变程度也被认为是判断关节炎病情的重要指标15-16。西药与中药在治疗类风湿关节炎时,具有较多的不良反应,使患者难以坚持治疗干预17,而电针干预具有安全、便利等特点,因此已被广泛应用于类风湿关节炎的治疗中18。既往研究显示,四关穴在临床上常作为主穴用于治疗类风湿关节炎,且能有效减轻全膝关节置换术的术后疼痛19-20。故本研究以四关穴为针刺腧穴,旨在探讨 TLR4、MyD88 和TRAF6 通路作为电针干预靶点的可能性。本研究结果显示,健康组大鼠具有正常的关节及滑膜组织,且关节炎指数均为 0;模型组出现明显的类风湿关节炎病征;通过电针干预,局部病征消退,关节结构轻度破坏,有少量炎性细胞,滑膜组织增生减轻,关节炎指数显著下降,这说明电针干预可以有效缓解类风湿关节炎。关节炎伴随关节软骨的破坏以及骨质增生,在这一病理过程中细胞因子IL-1和TNF-起着至关重要的作用21。在患者滑膜及软骨间会有高表达的 TNF-和 IL-1产生,而正常关节间 IL-1和 TNF-的表达量极低,且两者与软骨损伤呈正相关,滑膜组织中 PCNA 含量的上升也加剧了关节炎的症状22。PCNA在类风湿关节炎患者的滑膜组织中表达升高,PCNA 又与细胞增殖相关,说明 PCNA 表达的增高导致滑膜增生,从而使关节破坏,加速病情进展23。因此,为进一步验证电针干预对滑膜组织的影响,通过试剂盒检测IL-1、TNF-和 PCNA 含量,发现患病大鼠 IL-1、TNF-和 PCNA 含量显著上升,而电针干预后 IL-1、TNF-和 PCNA 含量明显下降,这与过往文献24报道一致,进一步证明了电针干预对关节炎疾病的作用。有研究表明,关节炎作为炎症疾病,受多种炎症因子的调控,TLR4、MyD88、TRAF6 等蛋白的高表达会激活炎症因子,诱导疾病的发生5。本研究结果显示,类风湿关节炎大鼠滑膜组织中 TLR4、MyD88 和 TRAF6的 mRNA 及蛋白的表达均显著高于健康大鼠,而电针干预后滑膜组织中 TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA 及蛋白的表达均显著降低。为进一步验证电针干预对 TLR4/MyD88/TRAF6 通路的调控作用,在电针干预的同时向大鼠腹腔内注射通路激活剂,研究发现加入TLR4/MyD88/TRAF6 通路激活剂后,类风湿关节炎的缓解程度明显降低,且干预后关节炎指数下降程度低于电针组,IL-1、TNF-和 PCNA 含量下降被有效缓解。TLR4、MyD88 和 TRAF6 的 mRNA 及蛋白表达较电针组显著升高,这说明通路激活剂缓解了电针干预对通路的抑制作用,使关节炎改善变缓,进一步证明电针干预确实通过调节 TLR4、MyD88、TRAF6 等参与调控类风湿关节炎疾病。综上所述,电针干预可有效抑制 TLR4、MyD88 和TRAF6 的 mRNA 和蛋白的表达,改善关节及滑膜组织的结构,抑制炎症因子的表达,促进滑膜组织细胞增生和软骨组织细胞凋亡,降低关节炎指数评分,从而起到缓解类风湿关节炎的作用。可见,电针干预对类风湿关节炎具有很好的干预效果,有很大的应用空间,同时有多个通路参与调控类风湿关节炎,电针干预是否还通过其他通路参与缓解类风湿关节炎,仍需要进一步的实验加以说明。参考文献 1 PINCUS T,CASTREJON I,YAZICI Y,et al.Osteoar-thritis is as severe as rheumatoid arthritis:evidence over 40 years according to the same measure in each diseaseJ.Clin Exp Rheumatol,2019,120(5):7-17.2 SCHMUKLER J,BLOCK J A,PINCUS T,et al.Func-tional status measures and indices in rheumatoid arthritis:comment on the articles by Barber et al and England et alJ.Arthritis Care Res,2020,72(8):1185-1186.3 李泽,韩崇旭.IL-35 在类风湿关节炎中抗炎促炎作用及与疾病指标的关系J.检验医学与临床,2019,16(9):1299-1301.4 符碧琪,吴锐.依托芬那酯凝胶治疗类风湿关节炎局部抗炎镇痛疗效观察J.中国疼痛医学杂志,2016,2(2):159-160.5 SAAD M A,EL-SAHHAR A E,ARAB H H,et al.Nicorandil abates arthritic perturbations induced by complete Freunds adjuvant in rats via conquering TLR4-MyD88-TRAF6 signaling pathwayJ.Life Sci,2019,218:284-291.6 ALI M,YANG F,JANSEN J A,et al.Lipoxin suppresses inflammation via the TLR4/MyD88z/NFB pathway1108 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 in periodontal ligament cellsJ.Oral Dis,2020,26(2):429-438.7 WANG F,HU M,ZHU H,et al.MyD88 determines the protective effects of fish oil and perilla oil against metabolic disorders and inflammation in adipose tissue from mice fed a high-fat dietJ.Nutr Diabetes,2021,11(1):23-32.8 WU J,WANG S,LU Y,et al.Shifted hub regions in the brain network of rat neuropathic pain model after electroacupuncture therapyJ.J Integr Neurosci,2020,19(1):65-75.9 欧阳八四,高洁,车建丽,等.电针对活动性类风湿关节炎患者关节疼痛与生存质量的影响J.中医杂志,2010,51(12):1097-1100.10 谭连红,史亦南,孙诗月,等.电针对大鼠胶原诱导型关节炎的缓解效应及作用机制J.针刺研究,2021,46(8):649-655.11 段生艳,赵云龙,陈广超.电针治疗肝肾阴虚型类风湿关节炎临床疗效及对关节功能的影响J.针灸临床杂志,2019,35(6):37-40.12 彭旭玲,张永红,陈勇,等.电针辅助治疗膝骨关节炎疗效及对血清 Wnt-3、-catenin 和关节滑液中白介素水平的影响J.上海针灸杂志,2019,38(6):660-664.13 MIYOSHI M,LIU S.Collagen-induced arthritis mo-delsJ.Methods Mol Biol,2018,1868:3-7.14 GAO Q,QIN H,ZHU L,et al.Celastrol attenuates collagen-induced arthritis via inhibiting oxidative stress in ratsJ.Int Immunopharmacol,2020,84:106527.15 宋鹏,荆凯,魏鹏飞,等.AT2R通过NF-B信号对人膝骨关节炎滑膜组织成纤维样细胞中 IL-6,IL-1表达的影响J.中国老年学杂志,2019,39(9):2247-2251.16 ZHOU J,DENG Y,LI F,et al.Icariside attenuates lipopolysaccharide-induced neuroinflammation through inhibiting TLR4/MyD88/NF-B pathway in ratsJ.Biomed Pharmacother,2019,111:315-324.17 黄家福.中西药合用治疗类风湿性关节炎疗效分析J.实用中医药杂志,2019,317(6):56-57.18 CHEN B,LI M Y,XING L Y,et al.Participation of local exosomes of acupoints in the initiation of acupuncture analgesic effectJ.World J Acupuncture-Moxibustion,2019,28(4):263-267.19 周奕,潘浩,徐涵斌,等.宋南昌治疗风湿类疾病经验浅析J.中医外治杂志,2016,25(1):59-60.20 刘宗文,胡力,童新延,等.针刺四关穴配郄穴对全膝关节置换术后镇痛效果的临床研究J.风湿病与关节炎,2021,10(11):13-16.21 ARJUMAND S,SHAHZAD M,SHABBIR A,et al.Thymoquinone attenuates rheumatoid arthritis by downregulating TLR2,TLR4,TNF-,IL-1,and NFB expression levelsJ.Biomed Pharmacother,2019,111:958-963.22 TANG Q