基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1505-1517基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究李振雨1.2*，何民友12,刘晓霞12,曲丽媛1-2,周湘媛1-2,黄彩莹12，陈向东12,孙冬梅1.2广东一方制药有限公司；广东省中药配方颗粒企业重点实验室，佛山52 8 2 44摘要：研究布渣叶饮片到标准汤剂量值传递规律，为布渣叶配方颗粒及其相关制剂质量标准的制定提供参考。采用15批布渣叶饮片制备标准汤剂，测定标准汤剂出膏率、浸出物含量，建立布渣叶饮片和标准汤剂超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱,采用Thermo Fisher QE高分辨质谱对共有峰进行指认,并采用对照品确证。以相对峰面积为变量,对布渣叶饮片和标准汤剂指纹图谱进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），寻找差异变量,并对布渣叶标准汤剂中3种黄酮类成分的含量和转移率进行测定。结果显示，15批布渣叶标准汤剂出膏率范围在9.32%14.22%，浸出物范围在37.6 1%6 2.52%，建立15批布渣叶饮片和标准汤剂指纹图谱，相似度均在0.95以上，饮片和标准汤剂指纹图谱均标识出12 个保留时间相一致的共有峰，并指认出其中10 个化学成分，OPLS-DA分析共找到5个相对峰面积变化较大的色谱峰,分别为峰1、2、3、4、6,为酚酸和黄酮类成分。15批标准汤剂3种黄酮类成分的含量均在均值3倍SD范围内。其中牡荆苷的转移率最高,其次为水仙苷和异牡荆苷。该研究能够为布渣叶配方颗粒及其相关制剂质量标准的制定提供重要参考。关键词：布渣叶；饮片；标准汤剂；量值传递中图分类号：R282.4;R927.1D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.9.005Study on the quantity value transfer of Microctis Folium decoction piecesQU Li-yuan2,ZHOU Xiang-yuan2,HUANG Cai-ying*,CHEN Xiang-dong,SUN Dong-meil-22 Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula,Foshan 528244,ChinaAbstract:To provide reference for quality control of Microctis Folium formula granules and related preparations,the quantityvalue transfer rule from Microctis Folium decoction pieces to Microctis Folium standard decoction was studied.The standarddecoction was prepared from 15 batches of Microctis Folium decoction pieces.The paste rate and extracts of 15 batches of Mi-croctis Folium standard decoction were measured and the fingerprints of Microctis Folium decoction pieces and standard de-coction were established by ultra high performance liquid chromatography(UPLC).The common peaks were identified usingThermo Fisher QE high-resolution mass spectrometry and confirmed using reference materials.Using the relative peak area asa variable,orthogonal partial least square discriminant analysis(OPLS-DA)was performed on the fingerprints of MicroctisFolium decoction pieces and standard decoction to find difference variables and three flavonoids in Microctis Folium standarddecoction were determined.The results showed that the paste rate of 15 batches of Microctis Folium standard decoction ranged文献标识码：Aand standard decoction based on UPLC fingerprintand multi-component quantificationLI hen-yl*,HE Min-yu-,IU iao-ia-,Guangdong Yifang Pharmaceutical Co.,Ltd.;文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)9-150 5-13收稿日期：2 0 2 3-0 3-31基金项目：国家工信部2 0 2 2 年产业技术基础公共服务平台项目-中药全产业链质量技术服务平台（2 0 2 2-2 30-2 2 1)*通信作者Tel:86-757-85128602;E-mail:接受日期:2 0 2 3-0 6-0 21506from 9.32%to 14.22%and the extracts ranged from 37.61%to 62.52%.The fingerprints of 15 batches of Microctis Foliumdecoction pieces and standard decoction were established with a similarity of more than 0.95.Twelve common peaks with con-sistent retention times were identified in the fingerprints of the decoction pieces and standard decoction and 10 chemical com-ponents were confirmed.OPLS-DA analysis found a total of 5 chromatographic peaks with significant changes in relative peakarea,namely,peaks 1,2,3,4 and 6.All of them were phenolic acids and flavonoids.The contents of three flavonoids in 15batches of standard decoction were within the mean 3 times SD range.The transfer rate of vitexin was the highest,followedby narcissin and isovitexin.This study can provide an important reference for the formulation of quality standards for MicroctisFolium formula granules and related preparations.Key words:Microctis Folium;decoction pieces;standard decoction;quantity value transfer布渣叶为岭南特色药材，主要化学成分为黄酮、生物碱、类、有机酸等,具有促进胃肠蠕动和胃液分泌,降血脂,退黄,抗炎、镇痛、保护心血管,抗衰老等作用,为药食两用中药,最近几年对布渣叶的重视程度增加,研究也越来越多传统中药以汤剂为主要用药形式,汤剂为中药发挥药效的物质基础,并经过上千年的临床实践,因此,建立中药标准汤剂的质量标准，能够为中药配方颗粒等现代中药制剂质量标准的建立提供重要参考2 。目前,关于布渣叶标准汤剂的研究报道尚未见到,我司在进行布渣叶配方颗粒国家标准研究中，按照中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（以下简称技术要求），对标准汤剂的关键质量指标：出膏率、浸出物、指标性成分含量及转移率、指纹图谱进行研究,考察布渣叶饮片到标准汤剂的量值传递规律，为布渣叶配方颗粒及其相关制剂质量标准的制定提供参考。1仪器、试剂与试药1.1仪器Thermo 超高效液相色谱仪（Vanquish,赛默飞世尔科技有限公司）；ThermoVanquishFlex超高效液相-ThermoFisherQE高分辨质谱联用仪（赛默飞世尔科技有限公司）;AgilentZORBAXSBCis（2.1m m150 mm,1.8 m)色谱柱,Waters Cortecs T3(2.1mm100 mm,1.6 m）色谱柱；百万分之一天平饮片编号Decoction piece numberYP1YP2YP3YP4天然产物研究与开发（XP2 6,梅特勒-托利多公司）。1.2试剂分析级甲醇和乙酸乙酯购自西陇科学股份有限公司；色谱级甲醇购自默克股份有限公司；色谱级甲酸和乙酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司。1.3试药牡荆苷（批号：1116 8 7-2 0 17 0 4，含量：94.9%）、水仙苷（批号：111997-2 0 150 1，含量：93.1%）、山奈酚-3-0-芸香糖苷（批号：112 0 0 7-2 0 16 0 2，含量：90.8%）、咖啡酸（批号：110 8 8 5-2 0 17 0 3，含量：99.7%）、阿魏酸（批号：110 7 7 3-2 0 16 14，含量：99.0%）和機树苷（批号：112 0 0 0-2 0 18 0 2，供鉴别用）对照品均购自中国食品药品鉴定研究院；异牡荆苷（批号：ST09650120MG，含量：98.0%，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；对羟基肉桂酸（批号：JOT-10995，纯度：98.0%，四川普菲德生物技术有限公司）；紫云英苷（批号：B21704，纯度：98.6%）；异鼠李素-3-0-葡萄糖苷（批号：B21556,纯度：99.6%）均购自上海源叶生物科技有限公司。15批布渣叶药材经广州中医药大学中药学院黄海波教授鉴定均为椴树科植物破布叶Microcos paniculata L.的干燥叶。取15批布渣叶药材，去除杂质，制成布渣叶饮片，按照技术要求制备15批布渣叶标准汤剂,其产地信息见表1所示。表115批布渣叶产地信息表Table 1 Information on the origin of 15 batches of Microctis Folium标准汤剂编号Standard decoction numberTJ1TJ2TJ3TJ4Vol.35产地Origin广东省阳江市海南省五指山市海南省五指山市广东省阳江市Vol.35续表 1(Continued Tab.1)饮片编号Decoction piece numberYP5YP6YP7YP8YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15李振雨等：基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究1507标准汤剂编号产地Standard decoction numberOriginTJ5广东省阳江市TJ6广西壮族自治区玉林市TJ7广西壮族自治区玉林市TJ8广西壮族自治区玉林市TJ9广东省阳江市TJ10广东省湛江市TJ11广东省湛江市TJ12广东省湛江市TJ13广东省湛江市TJ14广东省茂名市TJ15广东省阳江市2方法与结果2.1布渣叶标准汤剂的制备取布渣叶饮片10 0 g,加水煎煮两次,第一次煎煮加水14倍量，浸泡30 min，武火加热煮沸后文火保持微沸30 min,趁热过滤,滤液迅速用冷水冷却;第二次煎煮加水12 倍量，武火加热煮沸后文火保持微沸25min,趁热过滤,滤液迅速用冷水冷却,合并两次煎液,减压浓缩,冷冻干燥,得布渣叶标准汤剂冻干粉。2.2出膏率和浸出物测定出膏率以标准汤剂冻干粉量计,计算公式为：出Table 2 Determination results of paste rate and extracts of 15 batches of Microctis Folium standard decoction标准汤剂编号Standard decoction numberTJ1TJ2TJ3TJ4TJ5TJ6TJ7TJ8TJ9TJ10TJ11TJ12TJ13膏率=（标准汤剂冻干粉总量/制备标准汤剂的饮片重量）10 0%。浸出物的测定方法为：取本品2g,精密称定,精密加人乙醇10 0 mL,照醇溶性浸出物（中国药典2 0 2 0 年版通则2 2 0 1）项下的热浸法测定,结果见表2 所示。15批布渣叶标准汤剂出膏率范围在9.32%14.2 2%，浸出物范围在37.6 1%62.52%，出膏率和浸出物数据均在均值的7 0%130%或均值3倍标准差（SD）范围内，符合技术要求的规定。表2 15批布渣叶标准汤剂出膏率和浸出物测定结果出膏率Paste rate(%)9.6114.2213.1412.399.899.3213.4113.7110.4613.6113.5513.5110.40浸出物Extract(%)39.2660.0558.3056.1040.4737.6151.8154.6146.5958.0557.3162.5240.681508续表 2(Continued Tab.2)Standard decoction numberTJ14TJ15最小值Minimumvalue最大值Maximumvalue均值Meanvalue标准差 Standard deviation(SD)均值的7 0%130%7 0%-130%of the mean均值3倍SDMean3SD天然产物研究与开发标准汤剂编号出膏率Paste rate(%)10.999.579.3214.2211.851.848.30 15.416.33 17.37Vol.35浸出物Extract(%)39.4339.9937.6162.5249.529.1534.66 64.3722.05 76.982.3指纹图谱的建立2.3.1色谱条件采用Agilent ZORBAX SB Cis（2.1 mm 150mm,1.8 m)色谱柱;以甲醇为流动相A,0.1%乙酸溶液为流动相B,梯度洗脱（0 33 min,9%17%A;33 37 min,17%25%A;37 45 min,25%28%A;45 60 min,28%80%A);流速为每分钟0.30 mL；柱温为30；检测波长为315nm;进样量为2 L。2.3.2对照品溶液的制备取咖啡酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸、牡荆苷、异牡荆苷、山奈酚-3-0-芸香糖苷、紫云英苷、水仙苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷和椴树苷对照品适量，精密称定,加甲醇制成每1mL含咖啡酸、阿魏酸、牡荆苷、异牡荆苷各15g、含山奈酚-3-0-芸香糖苷、水仙苷、椴树苷各40 g、含对羟基肉桂酸、紫云英苷和异鼠李素-3-0-葡萄糖苷各50 g的混合溶液。2.3.3供试品溶液的制备2.3.3.1布渣叶饮片供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛）约0.5g,置具塞锥形瓶中,加50%甲醇2 5mL,加热回流30 min,冷却,离心,取上清液蒸干,残渣加2 5mL水使溶解,用乙酸乙酯萃取3次,每次2 5mL,合并乙酸乙酯液,蒸干，残渣用50%甲醇溶解,并定容到10 mL量瓶，滤过，取续滤液，即得。2.3.3.2布渣叶标准汤剂供试品溶液的制备取本品适量,研细,取约0.1g,置具塞锥形瓶中,加甲醇2 5mL,超声处理（功率2 50 W,频率40kHz)45 min,离心,取上清液蒸干,残渣加2 5 mL水使溶解,用乙酸乙酯萃取3次,每次2 5mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣用甲醇溶解,定容到10 mL量瓶,过滤,取续滤液，即得2.3.4指纹图谱方法学验证2.3.4.1米精密度试验取布渣叶标准汤剂（编号：TJ2）供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件重复进样6 次，以5号峰牡荆苷为参照峰S,计算其余共有峰与 S 峰的相对保留时间RSD值在0.0 4%1.53%范围内，相对峰面积RSD值在0.34%2.41%范围内，表明仪器精密度良好。2.3.4.2重复性试验取布渣叶标准汤剂（编号：TJ2)约0.1g,平行6份，精密称定，按“2.3.3.2”项下方法制备供试品溶液6 份，采用“2.3.1项下色谱条件进样分析，以5号峰牡荆苷为参照峰S,计算其余共有峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.0 5%0.52%范围内，相对峰面积RSD值在1.14%2.8 4%范围内，表明该方法重复性良好。2.3.4.3稳定性试验取“2.3.4.2 重复性试验”项下供试品溶液，采用 2.3.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、2 4h进样分析,以5号峰牡荆苷为参照峰S,计算其余共有峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.0 3%0.47%范围内,相对峰面积RSD值在0.6 3%2.94%范围内,表明供试品溶液在2 4h内稳定性良好。2.3.5指纹图谱的建立采用2.3”项下指纹图谱方法，对15批布渣叶饮片和标准汤剂样品进行指纹图谱测定，采用赛默飞Chromleteon7软件将各批次样品指纹图谱以CDF格式导出,并导中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2 0 12.130 7 2 3），分别以YP1和TJ1样品指纹图谱为参照图谱，对15批布渣叶饮片和标准汤-YP15-YP14YP13YP12YP11-YP10YP9-YP8YP7YP6YP5-YP4YP3YP2-YP1Vol.35剂指纹图谱进行多点校正和峰匹配,并生成布渣叶饮片和标准汤剂对照指纹图谱,结果见图13所示。结果显示，15批布渣叶饮片和标准汤剂均标识李振雨等：基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究1012141618202224262830323436384042444648505254565860图115批布渣叶饮片指纹图谱Fig.1Fingerprints of 15 batches of Microctis Folium decoction pieces1509出12 个保留时间相一致的共有指纹峰,表明从布渣叶饮片到标准汤剂，各指纹峰所代表的化学成分均能进行有效的转移。910时间 Time(min)TJ15-TJ14TJ13TJ12TJ11TJ10TJ9TJ8TJ7TJ6-TJ5TJ4TJ3TJ2TJ1时间 Time(min)图2 15批布渣叶标准汤剂指纹图谱2681012141618202224262830323436384042444648505254565860Fig.2Fingerprints of 15 batches of Microctis Folium standard decoction1510天然产物研究与开发Vol.3512109111012R12Fig.3 Reference fingerprints of Microctis Folium decoction pieces and standard decoction注：R1:标准汤剂对照指纹图谱,R2：饮片对照指纹图谱。Note:R1:Reference fingerprint of standard decoction;R2:Reference fingerprint of2.3.6相似度计算分别计算15批布渣叶饮片和标准汤剂样品指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度,结果见表3所示,15批布渣叶饮片指纹图谱的相似度在0.957 表3木相似度计算结果Table 3Similarity calculation results饮片编号相似度Decoction piece numberSimilarityYP10.981YP20.984YP30.957YP40.966YP50.986YP60.989YP70.968YP80.958YP90.976YP100.995YP110.987YP120.995YP130.992YP140.972YP150.993468101214161820 222426283032343638404244 464850 52 54565860时间Time(min)图3布渣叶饮片和标准汤剂对照指纹图谱decoction pieces.0.995,15批布渣叶标准汤剂指纹图谱的相似度在0.9600.995,饮片和标准汤剂指纹图谱整体相似度较高，表明指纹图谱可作为共性特征,用于布渣叶饮片和标准汤剂的质量控制。标准汤剂编号Standard decoction numberTJ1TJ2TJ3TJ4TJ5TJ6TJ7TJ8TJ9TJ10TJ11TJ12TJ13TJ14TJ15相似度Similarity0.9760.9720.9750.9690.9670.9830.9620.9600.9860.9930.9920.9860.9950.9880.9772.3.7共有峰的指认取布渣叶标准汤剂（编号：TJ2）供试品溶液,采用液相色谱-高分辨质谱对共有峰进行指认，色谱条件均同“2.3.1”项下；质谱采用HESI离子源，离子Vol.35源参数为：鞘气流速35Arb;辅助气流速10 arb；喷雾电压3.2 kV;S-lens电压50 V;辅助器加热温度350；毛细管加热温度350。质谱扫描参数为：正、负离子扫描模式（dd-MSDiscover);扫描范围为1001500m/z;一级扫描分辨率为7 0 0 0 0 FWHM;李振雨等：基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究A1511二级扫描分辨率为17 50 0 FWHM；二级碰撞能量为40eV。分别采集供试品溶液在正、负离子模式下总离子流图（total ion chromatogram，T IC）及紫外吸收色谱图(见图4)。56.158.9059.195.2020.4722.203.0314.029.10B9.073.037.412422.13C610.6513.94520.4016.231.790图4布渣叶标准汤剂指纹图谱共有峰的指认Fig.4Identification of common peaks in fingerprint of Microctis Foliumstandard decoction注：A：负离子模式下TIC;B：正离子模式下TIC;C:UV315nm下色谱图。Note:A：T IC i n n e g a t i v e i o n mo d e;B：T IC i n p o s i t i v e i o n mo d e;通过化合物的精确分子量及二级质谱信息，结合本地质谱数据库资料及相关参考文献，推测峰1为咖啡酸,峰2 为对羟基肉桂酸,峰4 为阿魏酸,峰5为牡荆苷,峰6 为异牡荆苷，峰7 为山奈酚-3-0-芸Table 4Mass spectrometry identification results of Microctis Foliumstandard decoction峰号化合物Peak No.Compound1咖啡酸Caffeic acid2对羟基肉桂酸 4-Hydroxycinnamic acid31.6329.4438.5022.3131.5832.3820.6129.4032.4514.1523.4716.6731.5971029.3732.37323.29815.281020C:Chromatogram at UV 315 nm.表4布渣叶标准汤剂化学成分质谱鉴定结果实测值分子式离子模式Measuredtr(min)Molecularformula6.23C,H:0410.65C,H,O342.4551.9655.9858.5742.4859.1948.8657.7236.5145.111142.409433251.9238.4449:3552.1356.293040时间Time(min)香糖苷,峰8 为紫云英苷,峰9为水仙苷,峰10 为异鼠李素-3-0-葡萄糖苷,峰11为椴树苷。具体化合物信息见表4所示。Ion modevalue(m/z)M-H-179.033 9M-H-163.038 959.2959.33山125060主要碎片离子误差MainErrorfragmention(m/z)(m/z)-0.008 4135.043 8-0.008 4119.048 91512续表 4(Continued Tab.4)峰号Peak No.45678910112.3.8共有峰的对照品确证取布渣叶标准汤剂（编号：TJ3）供试品溶液和“2.3.2”项下对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，采用保留时间比对结合紫外-可见光3D光谱分析,进一步确证峰1为咖啡酸,峰2 为对羟基A64天然产物研究与开发分子式化合物离子模式Measuredtr(min)MolecularCompoundformula阿魏酸Ferulic acid13.94牡荆苷Vitexin20.40异牡荆苷Isovitexin22.13山奈酚-3-0-芸香糖苷29.37Kaempferol-3-O-rutinoside紫云英苷Astragalin水仙苷Narcissin异鼠李素-3-0-葡萄糖苷Isorhamnetin-3-O-glucoside椴树苷Tiliroside1Vol.35实测值主要碎片离子误差MainErrorIon modevalue(m/z)CioHio 04M-H-C2;H20 010M-H-C2i H20 O 10M-HC2,H3o 0 1sM-H-30.12C2;H2o Ol31.59C2:H32 0 1632.37C2 H2 0 242.40C30 H2 O 1352fragmention(m/z)(m/z)145.028 3、193.049 7-0.008 2431.098 0-0.007 6431.098 0-0.007 6593.151 2-0.007 3M-H 447.093 2M-H-623.161 9M-H-477.103 6M-H593.130 3肉桂酸,峰4为阿魏酸,峰5为牡荆苷,峰6 为异牡荆苷,峰7 为山奈酚-3-0-芸香糖苷,峰8 为紫云英苷,峰9为水仙苷,峰10 为异鼠李素-3-0-葡萄糖苷,峰11为树苷,结果见图5所示。1110177.054 3、117.033 6313.070 4,283.059 7313.070 4、283.059 7285.0399、255.029 8284.032.7、-0.007 4255.0297、227.034 4317.065 3,-0.007 1302.0419317.065 3、-0.007 5302.041 9177.054 5、-0.007 0163.038 8、145.028 3612B024681012141618202224262830323436384042444648505254565860Fig.5 Identification of reference substances for common peaks注：A：混合对照品，B：供试品。1：咖啡酸；2：对羟基肉桂酸；4：阿魏酸；5：牡荆苷；6：异牡荆苷；7：山奈酚-3-0-芸香糖苷；8：紫云英苷；9：水仙苷;10:异鼠李素-3-0-葡萄糖苷;11：椴树苷。Note:A：M i x e d r e f e r e n c e;B:Sa mp l e.1:Ca f f e i c a c i d;2:4-H y d r o x y c i n n a mi c a c i d;4:Fe r u l i c a c i d;5:Vitexin;6:Isovitexin;7:Kaempferol-3-0-rutinoside;8:Astragalin;9:Narcissin;10:Isorhamnetin-3-0-glucoside;11:Tiliroside.2.3.9化学计量学分析以5号峰牡荆苷为参照峰S,分别计算峰14、峰6 12 与S峰的相对峰面积,并以相对峰面积为变量采用Simcal4.1软件进行正交偏最小二乘法-判别式分析（OPLS-DA）,建立OPLS-DA模型,模型经过2 0 0 次置换检验，R和Q值右边均大于左边（见图6）,证实模型有效。采用Simcal4.1软件自234图5共有峰的对照品确证动生成OPLS-DA得分图（见图7），15批布渣叶饮片和标准汤剂各自归为一类,且样品集中度较高。以VIP1.0作为变量差异性筛选标准,15批布渣叶饮片和标准汤剂共筛选出5个差异标志物（见图8），以VIP大小排序,分别为峰4 峰6 峰2 峰3峰1。分别计算15批布渣叶饮片和标准汤剂中峰1、2、3、4、6 与S峰的相对峰面积,并计算15批样品1110时间 Time(min)Vol.35的相对峰面积均值（见表5）。结果显示，从饮片到标准汤剂峰1、2、3、4的相对峰面积明显增加,而峰李振雨等：基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究6 的相对峰面积则明显下降。0.51513R220-0.51-1.5-0.200.20.40.60.81图6OPLS-DA模型置换检验Fig.6OPLS-DA model replacement test23TJ42TJ91T1T32-1T132T315-34T3王2T10T7TJ8YP4YPAPYP12YP13YP9YP13YP1YP7YP853Fig.7OPLS-DA score plot2图7OPLS-DA 得分图01.00036*t11231.5O+S+1dIA10.50-0.5462Fig.8VIP score plot表5峰1、2、3、4、6 与S峰的相对峰面积均值Table 5 Average relative peak area of peaks 1,2,3,4,6 and S峰号Peak No.123二VarID(Primary)图8VIP得分图饮片Decoction piece0.1000.4770.081780标准汤剂Standard decoction0.2551.0560.2341514续表 5(Continued Tab.5)峰号Peak No.45(S)6天然产物研究与开发饮片Decoction piece0.4501.0001.452Vol.35标准汤剂Standard decoction1.2881.0001.0982.4牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷的含量测定2.4.1色谱条件采用 Waters Cortecs T3(2.1 mm 100 mm,1.6m)色谱柱;以甲醇为流动相A,0.1%甲酸溶液为流动相B;梯度洗脱(0 6 min,20%25%A;624min,25%32%A;24 32 min,32%40%A;32 35min,40%44%A）；流速为每分钟0.35mL;柱温为30；检测波长为339nm,进样量为1L。2.4.2对照品溶液的制备精密称取牡荆苷对照品2.913mg、异牡荆苷对照品5.197 mg、水仙苷对照品16.7 7 3mg，加7 0%甲醇制成每1mL含牡荆苷13.8 2 2 g、异牡荆苷25.465g、水仙苷7 8.0 7 8 g的混合溶液，摇匀，即得。2.4.3供试品溶液的制备2.4.3.1布渣叶饮片供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛)约2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加人7 0%甲醇50 mL,称定重量,超声处理(2 50 W,频率40 kHz)1h,取出,放冷，再称定重量,用7 0%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.4.3.2布渣叶标准汤剂供试品溶液的制备取布渣叶标准汤剂适量,研细,取约0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加人7 0%甲醇2 5mL，称定重量，超声处理（功率2 50 W，频率40 kHz）30min,取出,放冷,再称定重量,用7 0%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,取续滤液，即得，成分Component牡荆苷Vitexin异牡荆苷Isovitexin水仙苷Narcissin2.4.4方法学验证2.4.4.1 精密度考察精密吸取“2.4.2”项下混合对照品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件重复进样6 次，计算牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷的色谱峰面积RSD分别为0.27%、0.57%和0.6 2%，表明仪器精密度良好。2.4.4.2重复性考察取布渣叶标准汤剂（编号：TJ2)约0.1g,平行6份，精密称定，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液6份,按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，计算供试品溶液中牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷的含量均值为2.761、3.2 90 和13.92 0 mg/g，RSD 值分别为1.83%、0.97%和0.92%，表明该方法重复性良好。2.4.4.3乡线性关系考察精密称取牡荆苷对照品2.913mg、异牡荆苷对照品5.197 mg、水仙苷对照品16.7 7 3mg，置10 mL量瓶中,加7 0%甲醇制成每1mL含牡荆苷2 7 6.444g、含异牡荆苷50 9.30 6 g、含水仙苷156 1.56 6 g的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液0.5mL，置2、5、10、2 5、50 mL量瓶中，分别加70%甲醇至刻度，摇匀,制成系列浓度对照品应用液,取上述对照品储备液和应用液，按“2.4.1”项下色谱条件依次进样分析,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y）,对照品浓度为横坐标（X），绘制标准曲线,结果见表6 所示。结果显示,3种成分的线性回归方程相关系数r均大于0.9995,表明各成分在规定的对照品浓度范围内，峰面积与对照品浓度线性关系良好。表6 各成分线性考察结果Table 6 ILinear relationship results of each component回归方程Regression equationY=7 385.273X-4 091.821Y=9 297.332X-1 212.080Y=4 665.419X-22 676.221线性范围Linear range(g/mL)0.999 92.764 276.4440.999 95.093 509.3060.999 915.616 1 561.566Vol.352.4.4.4取牡荆苷对照品2.7 94mg、异牡荆苷对照品3.627mg、水仙苷对照品15.2 2 4mg，置2 0 mL量瓶中,加甲醇制成1mL含牡荆苷132.57 5g、异牡荆苷17 7.7 2 3g、水仙苷7 0 8.6 7 7 g的对照品储备液。精密吸取上述对照品储液0.5、1.0、1.5mL,平行3组，每组3份，分别置9个锥形瓶中挥干溶剂，已知量指标成分序号Index componentNo.牡荆苷Vitexin123456789异牡荆苷Isovitexin123456789水仙苷Narcissin123456789李振雨等：基于UPLC指纹图谱和多成分定量的布渣叶饮片和标准汤剂量值传递研究加样回收率试验Table 7Determination results of recovery rate of each component称样量Sampleweight(g)0.051 40.054 30.