基于PI3K_Akt_caspase-9信号通路研究归芪白术方联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠胃癌细胞凋亡的影响.pdf

，：；网络出版时间：网络出版地址：基于 信号通路研究归芪白术方联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠胃癌细胞凋亡的影响黄勇，张晗，龚红霞，刘永琦，董焕成，陈红纲，房明，吴国泰，苏韫，（甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃省中医药防治慢性疾病重点实验室，甘肃省人民医院国家卫健委胃肠肿瘤诊治重点实验室，甘肃 兰州 ）：文献标志码：文章编号：（）中国图书分类号：；摘要：目的探讨归芪白术方联合奥沙利铂通过 通路对荷瘤小鼠的抑瘤作用及细胞凋亡的机制。方法建立荷瘤模型，随机分模型组、奥沙利铂组（）、奥沙利铂 归芪白术方高、中、低剂量组（、）；末次给药后切除移植瘤，计算抑制率；苏木精 伊红染色法（）观察瘤组织病理改变；免疫组化法（）检测 、表达；免疫印迹法（）检测 、及 通路表达情况。结果各用药组瘤重较模型组降低（）；与奥沙利铂组比，奥沙利铂 归芪白术方高、中剂量组瘤重降低（，）；模型组肿瘤细胞密集，未见组织坏死区；各用药组肿瘤细胞减少，有明显的组织坏死区和广泛炎性细胞浸润；与模型组比，各给药组 、收稿日期：，修回日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；胃肠肿瘤诊治重点实验室开放基金（）；中西医结合学科 年度 双一流 科研重点项目（）；甘 肃 中 医 药 大 学 研 究 生 创 新 创 业 基 金（）作者简介：黄勇（），男，硕士，副教授，研究方向：中医药防治肿瘤的分子病理学机制，：；苏韫（），女，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：中西医结合防治肿瘤及中医药防治常见病的免疫学，通信作者，：；吴国泰（）男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：药理学、中药药理毒理与安全性评价、动物实验技术的教学与科研工作，通信作者，：、蛋 白 下 降，而 、蛋白升高；与奥沙利铂组比，奥沙利铂 归芪白术方高剂量组 、蛋白下降（，），、升高（，）；奥沙利铂 归芪白术方中剂量组 、蛋白下降（），和 含量升高（）。结论归芪白术方可提高奥沙利铂抑瘤作用，促进胃癌细胞凋亡，其机制可能与 信号通路有关。关键词：归芪白术方；胃癌；细胞凋亡开放科学（资源服务）标识码（）：胃癌（，）是世界上第 大癌症和第 大癌症死亡的病因 ，也是世界范围内受到高度重视的健康问题之一。每年，近 万新的 病例被诊断出来，超过 万人死于这种疾病，占世界癌症死亡人数的 。中医药治疗 有自身的优点，它可以从多靶点、多通路、多层面发挥作用 。课题组前期研究表明，该方在临床试验上与化疗药联合应用具有增效作用，可以减轻毒副反应，提高 患者免疫力，提高生存期 ；还能通过降低 、的表达，抑制肿瘤组织中血管的形成 。研究发现 和 信号通路密切相关，共享下游共同的信号途径，包括 、等，它们都参与癌细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成 。其中 信号通路已中国药理学通报 ；（）：被认为与各种癌症和实体瘤的恶性转化、生长、增殖和转移有关 。本研究拟从 信号通路阐述其可能的作用机制，为归芪白术方治疗 提供实验依据。材料与方法 材料 细胞与实验动物 小鼠 细胞，批号为 ，购自武汉普诺赛生命有限公司。小鼠雌雄各半，级 只，体质量（），购自甘肃中医药大学 级动物实验中心，实验动物生产许可证号 （甘）；经甘肃中医药大学伦理委员会许可（）。实验药物归芪白术方通过甘肃中医药大学中药学杨秀娟副教授鉴定，由黄芪、当归、白术、白芍、酒大黄、陈皮、甘草组成，从甘肃中医药大学附属医院购买。奥沙利铂，山东罗欣药业公司，批号 。试剂 培养液（美国 公司，）；胎牛血清（杭州四季青生物公司，）；多聚甲醛（北京索莱宝有限公司，）；试剂盒（公司，）；，抗 体（，；抗 体（公 司，）；，抗体（碧云天公司，）；二抗（，）；抗体（公司，）。实验仪器 型倒置荧光显微镜（广州 公司），垂直电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪（公司），核酸蛋白分析仪（美国 公司）方法 培养细胞及建立小鼠 荷瘤模型 小鼠胃癌细胞用 培养基（含 胎牛血清）在 、孵育箱中培养。待 细胞长满后，调整密度为 ，并将 单细胞悬液接种于每只小鼠的右腋下。接种 触摸到结节时，且其直径大于 ，说明模型构建成功。模型建立及分组将造模成功的小鼠 随机分为 组，模型组、奥沙利铂组、奥沙利铂 归芪白术方高剂量组、奥沙利铂 归芪白术方中剂量组、奥沙利铂 归芪白术方低剂量组。依据人与小鼠的表面面积之比 计算用药剂量，奥沙利铂以 腹腔注射 （次 ），归芪白术方高、中、低剂量分别为 、（次 ），每次 ，给药周期为 ，模型组同等体积的生理盐水灌胃（次 ）。称取瘤重，抑瘤率末次给药 后，麻醉后处死小鼠，剥离皮下移植瘤，称质量并记录。抑瘤率 （对照组的平均瘤质量 给药组的平均瘤质量）给药组的平均瘤质量 。染色观察瘤组织形态瘤组织固定于 多聚甲醛溶液中。然后经过脱水、包埋后，再通过脱蜡、梯度酒精脱水、二甲苯处理、冲洗分化后 染色，用中性树脂封片，显微镜下观察。检 测 瘤 组 织 中 信号通路及凋亡因子蛋白表达取适量瘤组织提取蛋白，法检测蛋白浓度，在 水中煮沸变性 ，冰箱保存备用。配制 凝胶，电泳将蛋白质转移到 膜后，置于 脱脂奶粉中封闭 ，于一抗稀释液（、和 稀 释 倍 数 均 为 ，、稀释倍数 ）冰箱过夜。二抗稀释液（）中室温孵育 ，用 曝光。利用 软件分析蛋白条带灰度值，与 相比，得出各蛋白相对表达值。检测瘤组织中 信号通路蛋白表达将瘤组织的石蜡切片进行脱蜡、水化；抗原修复，洗涤 次；阻断内源性过氧化物酶，洗涤 次；室温封闭 ；加入一抗稀释液（），孵育过夜；再加入二抗稀释液（），室温孵育 ，滴加二氨基联苯胺（）复染封片。显微镜观察颜色改变，分析图像。统计学分析采用 软件，数据以珋 表示，方差齐用单因素方差分析，两两比较用方差分析中的 检验。结果 瘤质量、抑瘤率奥沙利铂组与奥沙利铂 归芪白术方高、中、低剂量组瘤质量均低于模型组（）；与奥沙利铂组比较，奥沙利铂 归芪白术方高、中剂量组瘤质量下降差异有统计学意义（，），见 ，。瘤组织形态 模型组肿瘤细胞数量密集，未见肿瘤坏死区域；奥沙利铂组肿瘤细胞数量降低，有明显的组织坏死区域和广泛的炎性细胞浸润。奥沙利铂 归芪白术方高、中剂量组肿瘤细胞密度下降，伴大范围的坏死区域和少量炎性细胞浸润，见 。中国药理学通报 ；（）（珋 ，）；，：；：；：；：；：；，小鼠瘤组织中 信号通路中的蛋白表达与模型组相比，各给药组瘤组织中 、蛋白表达明显下降，、蛋白表达明显上升（）；与奥沙利铂组相比，奥沙利铂 归芪白术方高剂量组中 、蛋白表达降低，、蛋白表达上升（，）；而 在奥沙利铂 归芪白术方中剂量组降 低，蛋 白 表 达 上 升（），见 ，。（珋 ，）；，（，）中国药理学通报 ；（）各组小鼠瘤组织中 蛋白表达与模型组相比，各给药组瘤组织中 、蛋白含量降低，、蛋白表达升高（）；与奥沙利铂组相比，奥沙利铂 归芪白术方高剂量组中 、蛋白含量下降，、蛋白表达升高（，）；而 、在奥沙利铂 归芪白术方中剂量组中降低（），见 ，。凋亡因子蛋白表达与模型组相比，各给药组瘤组织中 蛋白表达明显上升、而 蛋白表达明显下降（）；与奥沙利铂组相比，奥沙利铂 归芪白术方高剂量组中 蛋白表达明显上升，蛋白表达降低明显（），而 在奥沙利铂 归芪白术方中剂量组中表达上升（），见 ，。讨论 在中医学属于“胃脘痛”、“症瘕”、“反胃”等范畴 。患者的主要病机是脾虚湿盛、气虚血瘀，而归芪白术方具有攻补兼备、扶正祛邪的功 （）（珋 ，）；，中国药理学通报 ；（）（珋 ，）；，效，以黄芪为君药能大补中气；白术益气健脾，当归养血滋阴，白芍滋阴补血，三味合为臣药；酒大黄活血化瘀；陈皮理气行滞，行气以助活血，合为佐药；甘草为使药具有调和诸药之功 。前期我们已在动物实验中证实，归芪白术方可以靶向 双靶点抑制肿瘤的增殖和血管生成，而其对下游具体的作用途径尚不清楚，需要进一步探索 。等 通过体内外研究证实 可同时抑制 和 在非小细胞肺癌中的过度表达，同种抑制 的激活，以及 的磷酸化，导致细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡。通路是细胞内信号转导通路之一，它能够激活很多下游的效应分子，包括凋亡、转录、翻译、代谢和血管生成 等来调控肿瘤细胞的进程。通路通过 等配体激活细胞表面受体磷酸化 ，磷酸化的酪氨酸亚基被 转移到膜上，与相应的受体或受体结合蛋白结合，催化 的形成，进而激活下游的 ，从而参与细胞内外的信号传递 。作为凋亡的强效抑制因子，对细胞凋亡起着重要的调控作用。活化的 进一步磷酸化下游蛋白，如 、等介导细胞生长、增殖、细胞周期和糖代谢的调控 。当 被激活后，就会激活下游 ，然后诱导细胞骨架蛋白的水解，最后导致细胞凋亡 。本研究通过称取瘤重、计算抑瘤率和观察瘤组织病理形态的改变来研究奥沙利铂 归芪白术方对胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用，结果表明，与模型组相比，各给药组瘤重降低，奥沙利铂 归芪白术方高、中剂量组效果均明显于奥沙利铂组。归芪白术方在抑制肿瘤的生长上发挥了其扶正祛邪，增效减毒的功效，抑瘤作用显著。通过 观察到各给药组中 信号通路及凋亡因子蛋白表达含量的变化，结果表明与奥沙利铂组相比，奥沙利铂 归芪白术方高剂量组 、蛋白含量均下降，而 、表达升高；奥沙利铂 归芪白术方中剂量组 、蛋白含量下降，而 和 含量升高。提示奥沙利铂 归芪白术方可能通过抑制 信号通路中关键分子的蛋白表达，抑制 的发生发展。参考文献：，：，（）：，：，（）：，（）：李玲，王凤梅，刘永琦，等 归芪白术方辅助治疗胃癌患者的临床研究 中国临床药理学杂志，（）：，（）：张晗，苏韫，龚红霞，等 归芪白术方联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠 ，表达和血管生成的影响 中国实验方剂学杂志，（）：，（）：，：，（）：朱金霞，周思雨 浅析胃癌的中医药治疗 中医临床研究，（）：，（）：，中国药理学通报 ；（），（）：李春波，苏韫，薛轩，等 基于中药分子机制的生物信息学在线分析归芪白术方辅助治疗胃癌的作用机制 甘肃中医药大学学报，（）：，（）：，（）：吴沁航，鲍 刚，朱丽文，等 蓝萼甲素通过 信号通路诱导三阴性乳腺癌 细胞凋亡 中国药理学通报，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（，）：，（），（，），（），（，），（，），（，），（）；，（），：；中国药理学通报 ；（）