活血清热解毒方通过JAK_STAT信号传导通路调控动脉粥样硬化的分子机制探讨.pdf

中国中医急症 2023年10月第32卷第10期JETCM.Oct.2023，Vol.32，No.10 研究报告 活血清热解毒方通过JAK/STAT信号传导通路调控动脉粥样硬化的分子机制探讨Nguyen Xuan Huynh（阮春黄）1梁硕2孟毅3刘志勇3（1.河南中医药大学，河南 郑州 450003；2.河南中医药大学第二临床医学院，河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002；3.河南省中医院，河南 郑州 450002）中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1004-745X（2023）10-1728-05doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2023.10.007【摘要】目的 观察活血清热解毒方对动脉粥样硬化（AS）的改善作用，从JAK/STAT信号传导通路探讨其改善炎症反应的作用机制。方法 雄性SPF级Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（阿托伐他汀钙6.07 mg/kg）、中药低剂量组（活血清热解毒方1.2 g/kg）、中药高剂量组（活血清热解毒方4.8 g/kg）。对照组给予普通饲料，其余采用高脂饮食饲养联合腹腔注射维生素D3（VD3）的方法复制AS大鼠模型，成功后给药，每日1次，共12周。HE染色检测胸主动脉病理变化，ELISA法检测血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平，全自动生化分析仪检测血清脂质水平，Western blotting检测酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、细胞因子信号传导抑制因子3（SOCS3）蛋白表达。结果 与空白对照组比较，模型组大鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、低密度脂蛋白（LDL）、IL-6、IL-1、TNF-、MCP-1，主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平显著提高，血清HDL、IL-10水平显著降低（P0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠血清TC、TAG、LDL、IL-6、IL-1、TNF-、MCP-1，主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平显著降低，血清HDL、IL-10水平显著升高（P0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠血清TAG、LDL、IL-6、IL-1、TNF-，主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平明显降低，HDL水平显著升高（P0.05）。结论 活血清热解毒方能够降低AS大鼠模型血清脂质水平，减少IL-6、IL-1、TNF-、MCP-1等炎症细胞因子的表达，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路，抑制SOCS3蛋白表达有关。【关键词】动脉粥样硬化活血清热解毒方炎症反应JAK/STAT信号通路大鼠MolecularMechanismofHuoxueQingreJieduDecoctiononRegulatingAtherosclerosisthroughJAK/STAT Signaling Transduction PathwayNguyen Xuan Huynh，Liang Shuo，Meng Yi，Liu Zhiyong.Henan University of Traditional Chinese Medicine，Henan，Zhengzhou 450003，China.【Abstract】Objective：To oserve the effect of Huoxue Qingre Jiedu Decoction on atherosclerosis（AS）and to explore its mechanism of improving inflammatory response from JAK/STAT signal transduction pathway.Methods：Male SPF grade Wistar rats were randomly divided into the blank control group，model group，positive controlgroup（atorvastatin calcium 6.07 mg/kg），low dose group of traditional Chinese medicine（Huoxue Qingre Jiedu Decoction 1.2 g/kg），and high dose group of traditional Chinese medicine（Huoxue Qingre Jiedu Decoction 4.8 g/kg）.The control group was given normal diet，and the rest were fed with a high fat diet combined with intraperitonealinjection of vitamin D3（VD3）to replicate the AS rat model.After successful modeling，the drug was administeredonce a day for a total of 12 weeks.The pathological changes of thoracic aorta were detected by hematoxylin-eosin（HE）staining，and serum IL-6，IL-10，TNF-，MCP-1 and IL-1 were detected by ELISA.The level of serumlipids was detected by automatic biochemical analyzer，and the expression of JAK2，STAT3 and SOCS3 proteinwas detected by Western blotting.Results：Compared with the blank control group，the serum TC，TAG，LDL，IL-6，IL-1，TNF-，MCP-1，JAK2，STAT3，and SOCS3 proteins in the model group were significantly increased，while serum HDL and IL-10 levels were significantly decreased（P0.05）；compared with the model group，the serum TC，TAG，LDL，IL-6，IL-1，TNF-，MCP-1，JAK2，STAT3，and SOCS3 proteins in the positive control 基金项目：河南省中医药科学研究专项课题（20-21ZY1024）通信作者（电子邮箱：）-1728中国中医急症 2023年10月第32卷第10期JETCM.Oct.2023，Vol.32，No.10动脉粥样硬化（AS）是一种血管慢性炎症性疾病，以大动脉、中动脉内膜下脂质沉积、纤维组织增生、粥样斑块形成、血管壁硬化为主要特征1。AS形成和发展过程中导致的管腔狭窄、斑块破裂、血栓形成等是导致冠心病等心血管疾病发生的重要病理基础2。近年来，如何有效控制AS发生、降低终点事件的发生率是临床研究的焦点。以降脂药为主体的治疗方案仍旧是现阶段AS的主要治疗方案，虽然有一定的效果，但是存在副作用明显，且患者梗死后仍有复发的风险3。关于AS的发生机理目前尚无明确定论，近年来炎性学说逐渐成为研究的重点，免疫炎症成为抗AS新的突破口。伴随着中医药在临床上的广泛使用，其在心血管疾病中的良好的治疗效果也逐渐获得认可。中医药在调节免疫炎症反应防治AS领域也取得重要进展，诸多研究均证实活血、清热、益气等中药单体或复方在缩小AS斑块面积、减轻AS程度方面疗效卓著4-5。本院自拟活血清热解毒方契合“因瘀化毒、因毒致变”的理论，在AS患者中取得良好的效果，但是关于其具体作用机制仍有待深入探索。酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路是炎症因子转导的关键途径，参与细胞生长、迁移、死亡，调控免疫反应，在AS的发生和发展过程中发挥重要作用6-7。本次研究通过分析活血清热解毒方对AS大鼠JAK/STAT信号传导通路调控作用。现报告如下。1材料与方法1.1实验动物SPF 级 Wistar 大鼠 48 只，雄性，8 周龄，体质量180220 g，购于赛业（固安）生物科技有限公司，许可证号SCXK（冀）2021-003。适应性饲养1周后用于后续研究。分笼饲养，每笼 5 只，12 h 光暗同步，室温（242），相对湿度（555）%。本次研究经河南中医药大学动物伦理会审批通过，伦理批号：A202208407。1.2实验药物活血清热解毒方：太子参20 g，制首乌10 g，水蛭3 g，天麻6 g，胆南星3 g，全蝎3 g，决明子12 g，蜈蚣3 g，桃仁6 g，红花6 g。由医院中药房提供，清水煎熬，药液浓缩为含生药1.20 g/mL。维生素D3注射液（上海通用药业股份有限公司，国药准字H31021404）；阿托伐他汀钙（天方药业有限公司，国药准字H20093757）。1.3试剂与仪器TC/TAG（上海羽朵生物科技有限公司，货号：TC1239、TC1250）；HDL/LDL 试剂盒（长春汇力生物技术有限公司，K026a、K026b）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、MCP-1 ELISA试剂盒（ClinMaxTM公司，货号：IL6-H4218、ILB-H4110、IL0-H5219、TNA-H8211、CC2-H5255）；AK2、STAT3、SOCS3 一抗（Thermo Fisher 公司，货号：MA516565、PA586075、PA587485）。RT 200C全自动生化分析仪（美国Rayto公司）；Elx800 全自动酶标仪（美国BioTeK公司）。1.4模型制备48只大鼠随机分成空白对照组（n=8）和模型组（n=40），空白对照组给予普通饲料喂养，模型组通过高脂饮食饲养联合腹腔注射维生素D3（VD3）的方法建立AS大鼠模型8，大鼠在高脂喂养的同时按照700000 U/kg总剂量注射VD3溶液，分3 d注射。造模时间为3周，过程中随机监测精神和饮食状况，造模完成后随机处死6只大鼠，取主动脉组织进行病理检测，以主动脉有动脉粥样斑块形成为造模成功。造模过程中有2只大鼠死亡，死亡原因为进食过少。1.5给药方法造模组剩余32只大鼠随机分为模型组、阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组。除空白对照组正常饮食喂养外，其余各组均继续给予高脂饮食。阳性对照组给予阿托伐他汀钙2.6 mg/（kgd）灌胃，中药低剂量组给予活血清热解毒方1.2 g/（kgd）灌胃（相当于成人用药量），中药高剂量组给予活血清热解毒方4.8 g/（kgd）灌胃（相当于成人4倍用药量），空白对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，灌胃体积按10 mL/kg小鼠体质量计算，干预时间为12周。1.6标本采集与检测1.6.1主动脉病理学检测末次给药后腹腔注射戊巴比妥钠处死，左心室注生理盐水去除积血后，取下心脏和血管，液氮保存并移送至-80 冰箱保存；4%多聚甲醛固定血管，分离主动脉和心脏，常规方法脱水、透明、group，the low dose group of traditional Chinese medicine，and the high dose group of traditional Chinese medicinewere significantly decreased，while serum HDL and IL-10 levels were significantly increased（P 0.05）；comparedwith the positive control group，the serum TAG，LDL，IL-6，IL-1，TNF-JAK2，STAT3，and SOCS3 proteins inthe high-dose group of traditional Chinese medicine were decreased significantly，while the HDL level increasedsignificantly（P0.05）.Conclusion：Huoxue Qingre Jiedu Decoction can reduce the serum lipid level，IL-6，TNF-，MCP-1，and IL-1 in AS rats.Its mechanism may be related to the inhibition of JAK2/STAT3 signal pathwayand SOCS3 protein expression.【Key words】Atherosclerosis；Huoxue Qingre Jiedu Decoction；Inflammatory reaction；JAK2/STAT 3 signal pathway；Rats-1729中国中医急症 2023年10月第32卷第10期JETCM.Oct.2023，Vol.32，No.10浸蜡、包埋后制作病理切片。常规行HE染色，光镜下观察主动脉病理情况。1.6.2血清生化指标检测腹主动脉采血，1 500 r/min离心分离10 min，采用全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），ELISA 法检测血清 IL-6、IL-1、IL-10、TNF-、MCP-1。1.6.3Western blotting检测酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、细胞因子信号传导抑制因子3（SOCS3）蛋白表达主动脉组织标本，裂解、离心后取上清，BCA 试剂盒测定总蛋白浓度，经上样、电泳、转膜、洗膜、一抗、二抗、显影。使用ImageJ软件对目的蛋白条带和内参蛋白进行半定量分析，以-actin抗体为内参计算蛋白相对表达量。1.7统计学处理应用SPSS24.0统计软件。计量资料符合正态分布以（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1病理学检查结果HE染色结果显示，空白对照组大鼠主动脉具有完整的血管弹力纤维层结构，中膜平滑肌细胞规则排列，内膜边缘齐整，未见脂质沉积；模型组大鼠主动脉内膜出可见粥样斑块，部分可见破裂，中膜平滑肌细胞排列不规则，弹力纤维层断裂，可见钙化组织、纤维帽，斑块内有大量中央坏死物质；阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组相较于模型组病理改变得到有效改善，其中阳性对照组和中药高剂量组改善更为显著。见图1。2.2各组大鼠血脂指标的比较见表1。与空白对照组比较，模型组大鼠血清TC、TAG、LDL水平显著提高，HDL水平显著降低（P0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠血清TC、TAG、LDL水平显著降低，HDL水平显著升高（P 0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠血清TAG、LDL水平明显降低，HDL水平显著升高（P0.05）。2.3各组大鼠血清炎症因子水平的比较见表2。与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-1、TNF-、MCP-1显著升高，IL-10显著降低（P0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1、TNF-、MCP-1水平显著降低，IL-10水平显著升高（P0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1、TNF-显著降低（P0.05）。2.4各组大鼠JAK2/STAT3通路相关蛋白表达的比较见表3、图2。与空白对照组比较，模型组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平升高（P0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平显著降低（P 0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平显著降低（P0.05）。3讨论AS 可归于“胸痹心痛”“眩晕”“脉痹”等疾病范畴9。中医学认为“瘀血”“痰浊”“热毒”与 AS 的发生密切相关，其发病机制大致可概括为情志、饮食、年老、先天不足、外邪侵袭导致的阴阳失衡、脏腑功空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组图1各组大鼠主动脉病理观察（HE染色，400倍）组 别空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组n88888TC9.850.2315.682.35*10.381.89#13.752.16#11.352.05#TAG0.610.081.820.21*1.260.18#1.130.15#0.940.13#HDL3.950.381.560.24*2.930.27#2.820.20#3.190.17#LDL3.400.415.830.56*4.490.51#4.280.45#3.850.36#表1各组大鼠血脂指标的比较（mmol/L，xs）注：与空白对照组比较，P0.05；与模型组比较，#P0.05；与阳性对照组比较，P0.05。下同。表2各组大鼠血清炎症因子水平比较（xs）组 别空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组n88888IL-6（ng/L）0.780.094.560.35*2.290.23#2.170.34#1.970.19#IL-1（pg/mL）5.130.8612.752.28*8.291.16#9.381.52#6.750.95#IL-10（ng/mL）35.243.3012.381.12*24.853.23#22.502.74#25.832.56#TNF-（g/L）15.631.8545.524.35*32.304.10#34.353.56#28.353.58#MCP-1（ng/mL）18.642.2143.562.98*24.353.05#28.672.75#25.382.85#-1730中国中医急症 2023年10月第32卷第10期JETCM.Oct.2023，Vol.32，No.10能失调，而致痰、瘀、毒作用于脉道而发病10-11。近年来，现代医家对 AS 和易损斑块的中医病机的探讨愈发地深入，概括起来主要有脾虚与痰浊、瘀血说，肝肾亏虚、痰瘀阻络说，痰湿瘀说，毒邪致病说等12。结合现代医学，笔者认为“毒”“瘀”是AS发生的重要病机，AS 发病过程中炎症细胞浸润、炎症介质水平提高等与中医学“毒”“瘀”理论具有高度的相似性13。徐浩14提出“活血解毒-抑制炎症反应-稳定斑块”的假说，认为活血解毒在 AS 易损斑块干预中作用显著。本次研究从“毒”“瘀”理论出发，采用自拟活血清热解毒方对AS大鼠模型进行干预，结果显示动脉粥样硬化斑块和血脂浓度明显改善，证实活血清热解毒方降低AS大鼠模型血清脂质水平，阻断病理进程方面确有效果。方中太子参有益气健脾、生津润肺之功效；制首乌补肝肾、益精血；水蛭破血通经、逐瘀消癥；天麻息风止痉、祛风通络；胆南星清热化痰、息风定惊；全蝎、蜈蚣息风镇痉、通络止痛、攻毒散结；决明子清肝明目、润肠通便；桃仁、红花活血通经、散瘀止痛。全方共奏益气活血、逐瘀消癥、清热解毒之功，通过调节血脂代谢保护血管内皮细胞，增加斑块稳定性。AS进程中诸多炎症因子发挥重要作用，IL-1为靶点的单抗治疗被证实能够降低冠心病患者心血管事件的发生率15。IL-6广泛存在于机体各个部位，其形成受到白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-4（IL-4）等诸多因素的调控，其余相关受体结合介导细胞中的信号传递，激活AK2/STAT3信号通路，加强血管平滑肌细胞的增殖能力，加速AS的发展16。MCP-1是由巨噬细胞与单核细胞分泌，又被称为前炎性因子，能够使多种炎性细胞向病变部位聚集，尤其是单核细胞的聚集效应更为明显，对各种炎症因子的刺激做出应答。MCP-1还能活化白细胞并介导其产生其他炎症因子，诱导AS斑块内皮细胞移行，平滑肌细胞分裂，从而导致血栓斑块形成。JAK/STAT通路作为众多细胞因子转导的共同途径，在细胞生理病理变化中参与广泛，与AS密切相关。STAT3被激活后会通过基因的调节功能促进平滑肌细胞增殖17，导致AS的发生。SOCS3作为JAK2/STAT3信号通路的特异性阻断因子之一，其高表达会抑制该通路的正常传导功能，主要通过抗炎和调控细胞凋亡来抑制AS的发生与发展18。李妹娟等19研究发现抑制JAK2/STAT3信号通路后AS大鼠病理改变得以改善。本次研究显示，模型组 JAK2、STAT3、SOCS3、IL-6、IL-1、MCP-1、TNF-较空白对照组均明显提高，证实上述因子在AS发生发展过程中的重要作用。经过活血清热解毒方干预后，JAK2、STAT3、SOCS3、IL-6、IL-1、MCP-1、TNF-均明显降低，IL-10提示活血清热解毒方在抑制AK2/STAT3信号通路，调控炎症反应方面具有良好的效果。清热解毒中药大多具有抗炎作用，从而能发挥稳定易损斑块，防止其破裂的作用。本次研究结果显示，血清热解毒方能够降低AS大鼠模型血脂和炎症因子水平，抑制主动脉斑块的形成，发挥抗粥样硬化的作用，其机制可能与抑制 JAK2/STAT3信号通路和SOCS3蛋白表达有关。本次研究不足之处在于仅对雄性大鼠展开研究，未考虑性别对实验结果可能产生的影响，同时血清和蛋白表达检测的样本量偏小，且仅对颈主动脉展开研究，在今后的研究中需要进一步完善。参考文献1 王姝瑞，张翌蕾，焦伟杰，等.益气通脉方干预动脉粥样硬化模型小鼠血清氨基酸代谢的变化 J.中国组织工程研究，2023，27（28）：4441-4447.2 蔡婉，周华，葛文，等.清脂化瘀颗粒调控Keap-1/Nrf2/ARE介导的氧化损伤抗动脉粥样硬化的作用及机制研究 J.陕西中医，2022，43（2）：166-169，176.3 王弘宇，田野.血管外膜在冠状动脉粥样硬化发病机制中的新进展 J.中国动脉硬化杂志，2021，29（10）：896-902.4 朱友文，丁琼，尹婷，等.中药抗动脉粥样硬化机制研究进展 J.国际中医中药杂志，2022，44（12）：1464-1466，封4.5 张君冬，尹仁芳，陈琦，等.基于网络药理学及分子对接探讨当归补血汤治疗动脉粥样硬化潜在作用机制研究 J.世界科学技术-中医药现代化，2021，23（4）：1076-1085.6 浦冬青，刘政，周超，等.近10年动脉粥样硬化发病机制研究热点的可视化分析 J.世界科学技术-中医药现代化，2021，23（7）：2276-2284.7 邓欣，孟达，吴静宜，等.余甘子总酚对动脉粥样硬化组 别空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组n88888JAK20.320.050.740.13*0.620.14#0.580.15#0.500.08#STAT30.350.080.860.17*0.650.15#0.640.18#0.570.10#SOCS30.290.040.850.20*0.710.12#0.680.15#0.520.08#表3各组大鼠主动脉JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较（xs）A：空白对照组；B：模型组；C：阳性对照组；D：中药低剂量组；E：中药高剂量组图2各组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白条带-1731中国中医急症 2023年10月第32卷第10期JETCM.Oct.2023，Vol.32，No.10ApoE-/-小鼠肝脏保护作用机制的研究 J.中国病理生理杂志，2022，38（9）：1608-1617.8 谢彬，袁星，徐希科，等.中药复方抗动脉粥样硬化作用机制的研究进展 J.药学实践杂志，2021，39（4）：295-298，304.9 范增光，袁野.基于p38MAPK/NF-B信号通路探讨苏木提取物对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的机制研究 J.世界科学技术-中医药现代化，2022，24（6）：2294-2301.10崔京，李逸雯，罗斌玉，等.基于网络药理学和分子对接技术探讨活血解毒中药配伍抗动脉粥样硬化作用机制 J.中国药理学通报，2022，38（8）：1231-1238.11杨雪，郝二伟，张帆，等.种子类中药及其活性成分改善动脉粥样硬化的作用机制研究 J.中国药房，2020，31（7）：884-889.12魏亚男，朱博冉，姬梦姣，等.基于网络药理学探究补阳还五汤防治动脉粥样硬化的作用机制 J.中国药理学通报，2020，36（12）：1750-1755.13 王途.Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉中IL-6/JAK2/STAT3信号通路的调控作用及机制 D.承德：承德医学院，2020.14尚青华，徐浩，史大卓，等.冠心病血瘀证“瘀毒”病机转变的蛋白质组学研究 J.中西医结合心脑血管病杂志，2021，19（22）：3825-3829.15谭子富，李家权，于颖，等.商陆皂苷甲抑制TLR4/NF-B信号通路改善大鼠动脉粥样硬化的作用研究 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