黄酒酿酒酵母对醇类物质的代谢调控研究进展.pdf

822023 No.10(To1.352)酿酒科技2023年第10 期（总第352 期）LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGYD0I:10.13746/j.njkj.2022274黄洒酿酒酵母对醇类物质的代谢调控研究进展马博文（上海金枫酒业股份有限公司，上海2 0 150 1）摘要：醇类物质是酿酒酵母在酒酿造过程中产生的主要代谢产物之一，酒精发酵过程中酿酒酵母代谢是产生醇类物质的主要来源，深入研究黄酒酿酒酵母醇类物质的代谢调控机制，对于高级醇的含量控制以及定向培育产乙醇及芳香醇的黄酒酿酒酵母工业菌株具有重要的指导意义。本文系统综述了黄酒中主要醇类物质的代谢途径及基因敲除方法、诱变育种技术以及发酵环境变化在酿酒酵母对醇类物质代谢调控中的应用，对黄酒酿酒酵母对醇类物质代谢调控系统的建立有重要的理论意义，为实现黄酒中醇类物质含量的精准调控提供了参考。关键词：黄酒；酿酒酵母；酉醇类物质；代谢调控中图分类号：TS261.4TS261.1文献标识码：A文章编号：10 0 1-9 2 8 6(2 0 2 3)10-0 0 8 2-0 7Research Progress in Metabolic Regulation of Alcohols inHuangjiu by Saccharomyces cerevisiaeMA Bowen(Shanghai Jinfeng Winery Co.Ltd.,Shanghai 201501,China)Abstract:Alcohols are the main metabolites produced by Saccharomyces cerevisiae in the fermentation process of wine,and the me-tabolism of Saccharomyces cerevisiae in the process of alcoholic fermentation is the main source of alcohols.The in-depth study onthe metabolic regulation mechanism of alcohols in Huangjiu by Saccharomyces cerevisiae has important guiding significance for thecontent control of higher alcohols and the directional cultivation of industrial strains of Saccharomyces cerevisiae that produce etha-nol and aromatic alcohols.In this paper,the metabolic pathways of alcohols in Huangjiu,and the application of gene knockout tech-nology,mutagenesis breeding technology and fermentation environment control in the metabolic regulation of alcohols by Saccharo-myces cerevisiae are systematically reviewed.This paper has important theoretical significance for the establishment of the metabolicregulation system of alcohols in Huangjiu by Saccharomyces cerevisiae,and has provided reference for the precise control of the con-tent of alcohols in Huangjiu.Key words:Huangjiu;Saccharomyces cerevisiae;alcohols;metabolic regulation黄酒，是世界上三大古发酵酒精饮料之一，源于中国，唯中国有之，属于东方酿造的典型代表，在我国民族特产中占有一席之地。黄酒主要以大米、小麦和水为原料，麦曲和酒药为糖化发酵剂，经过浸米、蒸饭、糖化、发酵等工艺酿制而成，酒精含量为14%vol2 0%v o l，营养十分丰富，有“液体蛋糕”“酒中之瑰宝”的美称 2 。黄酒的酿造涉及复杂的生态微生物系统（包括真菌、酵母和细菌），用酒曲酿酒、双边发酵几乎保留发酵所产生的全部营养成分，如有机酸、氨基酸、酯类和维生素等 3,其中氨基酸种类多达2 0 种以上，含量十分丰富，黄酒中人体必需的8 种氨基酸含量是酿造酒中含量最多的 4。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是黄酒发酵的主导微生物，贯穿黄酒酿造生产过程，也是影响黄酒品质的关键因素，其性能的优劣直接影响黄酒的生产效率与风味品质 5，不同性状的黄酒酵母发酵作者简介：马博文（19 9 6-），女，硕士，研究方向为黄酒酿造与工艺，E-mail：ma b o w e n 12 18 16 3.c o m。83马博文黄酒酿酒酵母对醇类物质的代谢调控研究进展产生的风味物质也具有显著差异。高级醇是酿酒酵母在酒精发酵过程中产生的代谢副产物，是黄酒风味形成的重要组成部分，适量的高级醇能增加酒体的复杂程度，赋予酒丰满的口感，不同呈香特征的高级醇物质互相协作形成各类风格的酒，但其含量过高时，会破坏酒体结构，有异杂味产生。芳香醇是影响黄酒香气的重要化合物，是酵母合成细胞蛋白质时的副产物 6 ，其浓度对黄酒产品品质影响较大。不同的酵母菌株在发酵过程中代谢副产物的含量也存在显著差异 7 。适量的芳香醇（包括-苯乙醇、酪醇和色氨酸)对黄酒香气风味有积极贡献，赋予黄酒特有的醇香和圆润协调的酒体8 。-苯乙醇也是一种常见于黄酒中的芳香化合物9，具有典型的玫瑰芳香，-苯乙醇在黄酒中的浓度含量为40 130 mg/L，远高于其他发酵食品中的含量，对黄酒独特香气的形成有重要作用10 1研究意义及现状黄酒中的醇类物质主要包括乙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇等，每一种醇类化合物都赋予了黄酒不同的风味和香气。酿酒酵母主导酒精发酵过程醇类物质的生成，选育有优异乙醇耐受性和发酵活性的酿酒酵母对于发酵生产来说至关重要，研究黄酒酵母对乙醇的耐受机制有助于更好的筛选黄酒生产用工业酵母。酿酒酵母利用发酵原料中游离的氨基酸合成自身生长繁殖所需的蛋白质，当氨基酸中的氨基被利用后，残余的-酮酸经脱羧和加氢还原可生成相应的高级醇，高级醇的代谢途径包括埃里希途径（Ehrlich途径）和合成代谢途径(Harris途径），氨基酸分解生成相应高级醇的反应过程，是由酵母细胞中的氨基酸转氨酶、酮酸脱羧酶、脱氢酶等酶的催化活性决定的，选育酿酒酵母代谢过程中某些关键性酶活性降低或失活的菌株，可阻断或减弱生成高级醇的代谢途径，以此显著降低黄酒中高级醇含量 12 。高级醇的代谢机理（氨基酸的降解代谢途径和糖合成代谢途径）已有研究，但是发酵过程中的醇类物质相互影响，其他醇类物质代谢途径总体研究不深。本文系统综述了饮料酒中主要高级醇的代谢途径及诱变育种技术在酿酒酵母高级醇代谢调控中的应用，特别阐述了代谢工程技术如基因敲除方法、诱变育种技术以及发酵环境变化在酿酒酵母对醇类物质代谢调控中的应用。2黄黄酒酿酒酵母对醇类物质代谢调控的路径及基因2.1酿酒酵母乙醇代谢途径及调控基因乙醇耐受性机制取决于乙醇浓度 13,在10%vol乙醇下增强的乙醇耐受性可归因于氨基酸代谢，18%vol乙醇耐受性是由于脂肪酸代谢4。氨基酸在乙醇造成的逆环境中，可以稳定生物大分子结构，参与蛋白质装配、折叠、防止蛋白质变性15。饱和脂肪酸（例如棕榈酸、硬脂酸）和不饱和脂肪酸（例如油酸）都可以通过增强细胞膜渗透屏障来提高酵母的乙醇耐受性。在不同程度的乙醇胁迫下，通过调节膜流动性可以抵消乙醇的破坏性影响6 。在低浓度下（10%vol)下，高耐受性菌株能够通过增加不饱和脂肪酸的含量来保持相对恒定的流动性。唯一具有与脂肪酸代谢相关的差异单核苷酸多态性突变位点的基因OLE1，可以降低膜流动性下降的速度，从而最大限度地减少乙醇毒性的流化影响，使酵母能够更好地对抗乙醇的破坏性影响7。通过生物信息学分析，基因g5170的功能与黄酒酵母菌适应乙醇胁迫有关18 。通过敲除与过表达g5170基因两方面研究与验证，在高浓度乙醇环境胁迫下，基因敲除菌株YHJ7-g 517 0 的乙醇耐受性要比原始菌株YHJ7的表现弱很多。利用酿酒酵母表达载体质粒pYES2将新基因g5170转化到BY4741酵母菌株中，用半乳糖诱导法诱导新基因在BY4741重组菌中表达，g5170的重组酵母菌株对乙醇耐受性明显比对照菌株强。结果表明此基因的功能确实与黄酒酵母菌适应乙醇胁迫有关。2.2酿酒酵母芳香醇代谢途径及调控基因黄酒中的芳香醇主要由酿酒酵母HJO1通过842023 No.10(Tol.352)酿酒科技2023年第10 期（总第352 期）LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGYEhrlich途径和莽草酸途径合成，包括31个基因，负责酿酒酵母中芳香醇的生物合成 9)。在黄酒发酵的前12 0 h中，芳香醇的含量与芳香醇氨基酸的释放呈正相关，由于原料和微生物的代谢作用，酿酒酵母水解原料中的氨基酸产生游离氨基酸，随之基因GAP1HJO1（通透酶）、BAT2HJ01（转氨酶）、PDC1HJO1、PD C 5H JO 1（丙酮酸脱羧酶）和ADHIHJO1（酒精脱氢酶）形成了整合的Ehrlich途径，负责芳香醇的生物合成 2 0 。在酿酒酵母HJ01中，参与Ehrlich通路的基因GAPIHJO1、BAT2HJ01、PD C1H J0 1和PDC5HJ01启动子区域的突变增加了相关基因的启动子强度和转录水平。添加2 0 U/g酸性蛋白酶可以显著提高Ehrlich通路相关基因的表达水平，总芳香醇浓度增加34.7%2 1。由于酸性蛋白酶具有超强的蛋白质内切和外切酶活力，使自由氨基氮快速释放，从而提高芳香族游离氨基酸的释放 2 。发酵末期，由于酵母自溶，大量游离氨基酸和多肽随着发酵时间延长而增加 2 3。蛋白酶活力越高，黄酒酵母因芳香族游离氨基酸的释放率和利用率提高，促进芳香醇的合成 2 4。以上研究为提高黄酒中芳香醇的含量提供了重要的理论依据，可通过控制黄酒发酵中酸性蛋白酶的含量以及控制蛋白酶活力的高低来调控黄酒中芳香醇的含量。2.3酿酒酵母异丁醇代谢途径及调控基因黄酒中含有的多种物质会通过抑制乙醇代谢促进黄酒饮后不舒适的体验，在研究黄酒易上头时，通过考察不同物质对乙醇代谢的影响发现10种物质中异丁醇对乙醇代谢的影响最大 2 5。对半干型绍兴黄酒中主要的高级醇含量进行检测分析发现异丁醇是主要高级醇种类之一 2 6 ,异丁醇、异戊醇和-苯乙醇三者含量占黄酒高级醇总量的80%以上 2 。由于酿酒酵母细胞可通过缬氨酸代谢途径合成少量异丁醇，自然状态下作为酿酒酵母的次级代谢产物，异丁醇的发酵产量非常低。所以，增强酿酒酵母细胞对异丁醇耐受性并提高其异丁醇的合成能力对微生物发酵有重要意义。Dickinson等 2 8 在19 9 8 年通过13标记氨基酸首次确定了在自然状态下的酿酒酵母可由Ehrlich途径中的-酮戊二酸代谢合成异丁醇，但是是酿酒酵母细胞代谢中产生的微量副产物。Liao等 2 9 结合氨基酸合成途径、-酮酸的脱羧和还原途径，以-酮酸为底物，利用酮酸脱羧酶和醇脱氢酶首次通过非发酵途径合成了丁醇和异丁醇。Smith等 30 通过在酿酒酵母细胞中过表达基因KIVD、A D H 6 和ILV2,敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC6,使酿酒酵母细莽草酸途径艾利希途径4一磷酸赤藓糖磷酸烯醇式丙酮酸BAT1,BAT2,AR08,AR09苯丙氨酸酪氨酸苯丙氨酸.-AR03酪氨酸-AR04AR010,TH13DAHPTYR1PDC1,PDC5ARO1PDC6PHA2酮戊二酸乙醛一芳香醇EPSPBAT1,个ADHI-6AR02BAT2,SFA11分支酸AR08,酪氨酸 AR07AR09-苯乙醇酪醇TR预苯酸色氨酸色氨酸苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸 GAP1,BAP2,AGP1芳香族氨基酸注：酿酒酵母通过莽草酸途径和Ehrlich途径进行芳香醇生物合成的代谢概述。负责酶的基因在每个反应步骤（黑色长箭头）旁边以字母代号显示，莽草酸途径虚线短箭头代表基因的反馈抑制作用。图1酿酒酵母通过Ehrlich途径和莽草酸途径合成芳香醇85马博文黄酒酿酒酵母对醇类物质的代谢调控研究进展胞的异丁醇产率达到了6.6 mg/g。Br a t 等 3在细胞质中表达由ILV2、IL V 5、IL V 3、A R O 10 和ADH2组成的代谢途径，异丁醇产率达到6 30 mg/g葡萄糖。Chen等 32 在酿酒酵母细胞中过表达基因ILV2、I L V 5和ILV3，酿酒酵母细胞在微厌氧发酵条件下异丁醇的产率由0.2 8 mg/g葡萄糖提高到3.86g/g葡萄糖，在此基础上进一步过表达支链氨基酸转氨酶BAT2,结果显示，异丁醇的发酵产量增加了两倍。发酵过程中不断积累的异丁醇会对细胞生命活动产生抑制作用，也会直接影响异丁醇的产量。温智慧等 3 利用全局转录调控工程提高酿酒酵母异丁醇耐受性，优化了酿酒酵母细胞的缬氨酸代谢途径，在酿酒酵母菌株中过表达缬氨酸代谢途径中的乙酰乳酸合酶基因ILV2，二羟基异戊酸脱水酶的基因ILV3以及编码酮异戊酸脱羧酶的基因ARO10，得到的异丁醇产量与对照菌株相比提高了3.06倍。以上研究为进一步增强酿酒酵母异丁醇耐受性奠定了基础，进一步探索异丁醇耐受性的分子机制，为提高酿酒酵母的异丁醇发酵产量提供了新思路，也为黄酒上头感提供了新的解决方案。2.4酿酒酵母异戊醇代谢途径及调控基因高级醇含量过高对人体有毒害作用，异戊醇含量过高，会造成人体神经系统充血，而使人产生恶心、呕吐、头疼等中毒症状 34。运用诱变育种方法选育分枝链氨基酸营养缺陷型菌株，因其不能合成相应的氨基酸合成途径中与高级醇生成相关的酶，可以减少-酮酸积累，从而降低高级醇生成量。Rous等 35 通过紫外诱变的方法选育出一株异亮氨酸营养缺陷型突变菌株，用该突变株发酵时生成的异戊醇含量比出发菌株降低了50%。王鹏银等 36 利用N+离子注入技术诱变并筛选得到1株亮氨酸应用缺陷型酿酒酵母A713，发酵产物中异戊醇含量降低了39.58%。但诱变育种缺点明显，不利于工业化生产。基因工程育种有利于提高发酵产物的生成量，同时遗传稳定性强，结合异戊醇生成的代谢途径，Eden等 37 发现酵母中支链氨基酸的转氨作用受支链氨基酸转氨酶控制，分别为线粒体支链氨基酸转移酶和细胞质支链氨基酸转氨酶，支链氨基酸转氨酶的缺失可阻断或减弱支链氨基酸转变成-酮酸，进而减少亮氨酸生成异戊醇。通过同源重组技术分别对支链氨基酸转氨酶的编码基因BAT1和BAT2敲除，突变株RY1-3生长繁殖受到抑制，产高级醇的含量显著降低,异戊醇含量降低了2 5.31%38 。黄酒酿酒酵母菌株S.cerevisiaeAY15的LEU1基因缺失后，异丁醇的生成量提高了41.7%，异戊醇的生成量降低33.7%;LEU2基因缺失后，异丁醇的生成量提高了52.2%，异戊醇的生成量降低了2 8.7%39 。佐一含等 40 单敲除工业啤酒酵母S.cerevisiaeS-6的LEU2基因后，异戊醇生成量降低了11.8%。LEU1与LEU2基因的敲除能够提高异丁醇的生成量，同时降低异戊醇的生成量 41。肖冬光等 42 在过表达酿酒酵母编码醇乙酰基转移酶ATF1基因的同时，将酿酒酵母基因组中编码酯水解酶的IAH1基因敲除，结果降低异戊醇含量近一半。2.5酿酒酵母-苯乙醇代谢途径及调控基因作为酿酒酵母的次级代谢产物，目前已有研究证明黄酒酵母产生的-苯乙醇合成途径主要与环境中的氮源种类相关，当L-苯丙氨酸作为唯一氮源时，Ehrlich途径会优先合成代谢。L-苯丙氨酸为底物，通过芳香族氨基酸的转氨作用，生成苯丙酮酸，或在苯丙酮酸脱羧酶的作用下生成苯乙醛，进而脱羧生成-苯乙醇或脱氢生成苯乙酸。当环境中有更容易转化利用的氮源时，主要通过莽草酸途径代谢(43。苯丙酮酸脱羧酶催化苯丙酮酸生成苯乙醛的过程中相关的基因包括PDC1、PD C 5、PDC6、A R O 10 和THI34,PDC5基因编码酿酒酵母中的丙酮酸脱羧酶，能够催化丙酮酸脱羧成乙醛，同时具有丙酮酸脱羧酶活性 45,酿酒酵母菌株敲除PDC5基因后的突变株不仅阻断了苯丙酮酸合成苯乙醛的主路途径，而且加大了支路途径的末端产物-苯乙醇的胞外积累。通过敲除酿酒酵母PDC5基因的间接调控作用，能够提高合成-苯乙醇能力。研究发现酿酒酵母HJO1的PDT突变导致黄酒中-苯乙醇浓度较高，比典型酿酒酵母W303生产更多的-苯乙醇。在酿酒酵母HJO1中发现了PDT862023 No.10(Tol.352)酿酒科技2023年第10 期（总第352 期）LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY反馈抑制酪氨酸A糖酵解对羟基苯丙酮酸 对羟基苯乙醛一对羟基苯乙醇i4一磷酸赤藓糖磷酸烯醇式丙酮酸DAHP-DAHP合成酶反馈抑制莽草酸苯丙氨酸分支酶变位酶A分支酸苯丙氨酸一苯乙醛-苯乙醇预苯酸艾利希途径图2酿酒酵母通过艾利希途径合成-苯乙醇中的突变（I161K、L 2 39 P和Q250H)，发现来自酿酒酵母菌株HJ01和W303的纯化PDT被L-苯丙氨酸抑制。PDTHJ01的比活性是PDTW303的1.2 7 倍。它还表现出更高的底物亲和力、催化效率和热稳定性，但不太容易受到反馈抑制。此研究为黄酒酵母代谢工程提供了一个潜在的目标一示一一生产L-苯丙氨酸的酿酒酵母菌株。还有研究以-苯乙醇主要合成途径艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p，苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adhlp作为研究的重点 46 ,发现-苯乙醇和乙醇会严重抑制苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的催化活性，Aro10pHJ耐受-苯乙醇和乙醇的能力略高于酿酒酵母Aro10pS288C。外源添加0 30 0 mg/L-苯乙醇的情况下，醇脱氢酶对底物乙醛的催化反应仍旧保持高催化活性，且黄酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受-苯乙醇的能力相对来说高于酵母模式AdhlpS288C。R o ma g n o l i 等 47 研究发现组合敲除酿酒酵母CEN.PK113-D的ARO8、T Y R 1及ARO3基因，同时分别利用基因ARO4K229L和ARO7G141S替代ARO4与ARO7基因以解除底物反馈抑制现象，能够大幅度提高-苯乙醇的得率。3结论与展望目前酿酒酵母的主要醇类物质代谢途径已梳理清楚，代谢途径中的酶系及其编码基因已基本明确，但对酿酒酵母菌株的改造仍存在基因功能不明确、调控效果不理想、需要引入外源基因等诸多问题。目前研究集中于用生物调控法来实现酿酒酵母工业菌株高级醇代谢的精细化调控，但黄酒发酵过程是复杂的微生物反应体系，为达到黄酒酿酒酵母风味物质比例协调、提升黄酒品质的目标，可以利用微生物高通量、宏基因组分析、宏转录及靶标代谢组学等手段来深入研究酿酒酵母所处的外部环境条件和与之所对应的内部生理生化特征，在此基础上建立代谢调控系统和定向育种技术体系，进一步调控黄酒中的醇类物质，特别是乙醇和芳香醇的含量，芳香醇中含量高的挥发性物质（异丁醇、异戊醇、-苯乙醇对黄酒风味的影响很大，对产品的品质提升和饮后体验感的改善都十分关键，为黄酒的健康酿造提供理论基础。本文总结对于酿酒酵母醇类物质代谢调控系统的建立具有重要理论意义，对深入分析酿酒酵母代谢调控原理以此通过分子生物学技术选育特定酵母菌株，为达到实际生产过程中对生产产物的特定需求提供了重要的理论依据，为实现黄酒中醇类物质含量的精准调控提供了参考。参考文献：1傅金泉.黄酒生产技术 M.北京：化学工业出版社,2 0 0 52黄银.黄酒生产工艺中的安全风险分析与控制 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