宏基因组二代测序在肺结核诊断中的应用.pdf

宏基因组二代测序在肺结核诊断中的应用唐小莉 戴广川 高卫卫 陈珊珊 曾谊 【摘要】目的 探索宏基因组二代测序()在肺结核诊断中的实际临床应用价值 方法 对 例疑似肺结核患者支气管肺泡灌洗液()样本行、涂片、培养、比较 结果 与涂片、培养的诊断敏感度存在显著性差异(均 )与 之间无显著性差异()和 联合诊断敏感度明显提高()同时在筛查肺结核是否复发时诊断效率更高()结论 检测手段明显提高肺结核的诊断效能值得推广应用【关键词】宏基因组二代测序肺结核早期诊断复诊 【】().().().().().【】:./.作者单位:江苏 南京南京市第二医院结核科通信作者:曾谊:.目前我国每年新发肺结核患者约 万例结核病仍是我国传染病死亡主要原因及早诊断、及时治愈是消除传染源、控制结核病流行及降低死亡率的最重要措施 目前的病原学诊断工具包括抗酸杆菌涂片、微生物培养、/()、全基因组测序等分子检测 是一种新型、快速、简单、方便的临床感染性疾病鉴定的检测方法只需一次运行即可无偏倚地获得所有获得微生物核酸片段的序列信息通过分析和比较可鉴定所有微生物物种 在这项研究中我们回顾性分析 例疑似肺结核患者 的传统病原体检测方法与 结果并进行对比评估 在肺结核诊断中的临床价值资料与方法一、一般资料收集 年 月至 年 月在南京市第二医院收治的 例疑似肺结核患者从每位患者的 中取样分别送检(诺因生物南京)、涂片、培养、参照 肺结核诊断()以确定最终临床诊断包括临床诊断肺结核和确诊肺结核二、纳入及排除标准纳入标准:()门诊经痰涂片初步筛查为阴性的疑似肺结核患者()临床资料完整无缺失()临床样本和检测过程通过 的质量控制排除标准:()临床和实验室资料不完整()诊断不明确()临床样本未通过 质量控制()样品泄漏和污染本研究所有患者均已获得知情同意书并通过南京市第二医院伦理委员会审批()临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期三、方法 标本采集:纳入患者的 常规检测方法:涂片按照结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册 进行 培养采用 分枝杆菌快速培养法 按照利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测系统仪器使用说明书进行操作(美国 公司)检测结果自动判读 :根据标准程序采集纳入患者的 储存无菌冻存管中 小时内进行检测 样本按照 ()试剂盒步骤提取 处理产生 片段通过 扩增和环化反应产生单链环来构建文库 用于质量控制通过 平台对质量确认的文库进行测序排除人源序列后的其余数据与 建立的基于(/)的微生物参考数据库对比进行高级数据分析 本研究使用的参考数据库包含 种细菌、种病毒、种真菌和 种寄生虫 结核分枝杆菌()阳性 结果的阈值标准:是一种胞内分枝杆菌病原体核酸提取困难且 污染可能性小因此当至少 个读数被映射到种水平时 被认为是阳性四、统计学分析非正态分布的连续变量表示为中位数(四分位数间距)正态分布的连续变量表示为均值(标准差)分类变量表示为()组间差异采用 检验、卡方检验或 精确检验 以临床最终诊断为参考标准建立 列联表以确定敏感度、特异度、阳性预测值()和阴性预测值()结果以 置信区间()表示 与其他检测方法的敏感差异性用 检验使用 软件、软件和 软件进行数据分析 )二、不同检测手段在肺结核诊断中的效能在 例肺结核患者中 共检出 阳性 例 与涂片、培养、检出均阳性的病例仅 例 与涂片均阳性为 例、与培养均阳性为 例、与 均阳性为 例仅 阳性为 例仅涂片阳性为 例仅 阳性为 例 诊 断 肺 结 核 的 敏 感 度 和 特 异 度 分 别 为()和 ()和 分别为 ()和 ()涂 片 法 的 敏 感 度 和 特 异 度 分 别 为()和()培养法的敏感度和特异度分别为()和 ()的敏感度和特异度分别为()和()本组研究结果示 敏感度略低于 两者之间无显著性差异()与涂片和培养相比 的敏感度分别增加()()其 值均 两者之间存在显著性差异 将 和 两种快速诊断方法结合起来发现可有效提高肺结核检测的敏感度其敏感度可达 ()联合诊断效能优于四种方法中的任何一种(表)三、不同检测手段在肺结核复诊患者中的诊断效能将所有纳入的 例疑似肺结核病患者根据有无抗结核治疗史分为初诊病例和复诊病例两组 与初诊病例相比 复诊病例组的涂片()和()检 测 敏 感 度 提 高 培 养()和()检测敏感度降低但均无显著性差异 其临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期表 与涂片法、培养、在肺结核诊断中的比较()诊断方法敏感度()特异度()阳性预测值()()阴性预测值()()涂片法.(.).(.).(.).(.)培养法.(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.)注:与 组相比差异有统计学意义()复诊病例中 的敏感度为 涂片的敏感度为 培养的敏感度为 的敏感 度 为 与 涂 片()、培养()、()之间的敏感度对比均有显著性差异(表)表 与涂片、培养、在初诊与复诊病例中的敏感度比较()诊断方法初诊病例()复诊病例()值涂片(.)(.).培养(.)(.).(.)(.).(.)(.).注:与 组相比差异有统计学意义(个月的患者中 的敏感度为 涂片的敏感度为 培养的敏感度为 的敏感度为 涂片、培养、的联合诊断敏感度为 敏感度与涂 片()、培 养()、()的 值均 个月的患者中 与其他病原体混合感染占比 (/)非结核感染患者占比 (/)均检出非结核感染患者的致病菌涂片与 均未检出培养仅检出 例(表)表 与涂片、培养、在不同抗结核治疗时间复诊病例中的敏感度比较()诊断方法抗结核治疗时间 个月()抗结核治疗时间 个月()值涂片(.)(.).培养(.)(.).(.)(.).(.)(.).涂片 培养 (.)(.).注:与 组相比差异有统计学意义()五、对肺结核合并混合感染的诊断效能在 例肺结核患者中 结合常规检查方法共诊断出混合感染 例()例为 和真菌混合感染(黑曲霉 例、隐球菌 例、白色念珠菌 例、土曲霉 例、烟曲霉 例)例为 和常见细菌混合感染(副流感嗜血杆菌 例、肺炎克雷伯杆菌 例、巴西奴卡菌 例)例为 和非结核分枝杆菌()混合感染(鸟分枝杆菌 例、胞内分枝杆菌 例、龟分枝杆菌 例)例为 和病毒混合感染(人疱疹病毒 例、戊肝病毒 例)例为 和真菌、病毒混合感染(出芽短梗霉、人疱疹病毒)混合感染患者中除 外其它病原体均由 检出 其中 名患者(/)仅使用 方法同时检测出、真菌和(隐球菌、白色念珠菌各 例鸟分枝杆菌 例、胞内分枝杆菌 例、龟分枝杆菌 例)整体而言与常规培养和 相比 在鉴定混合感染、菌种以及真菌、病毒检测方面具有明显优势临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期讨 论目前传统病原微生物检测方法在临床肺结核病的诊断中仍在广泛应用但在敏感度、特异度、时效性及信息量等方面存在一定的局限性尤其对未知或罕见病原体无法进行快速识别 其中抗酸染色涂片法仅能提示分枝杆菌感染其灵敏度仅 且无法对 与 进行判别 培养法虽敏感性有所提高但需 周才能提供检测结果 通过 基因互补的探针虽然在 小时内能同时识别 和利福平()耐药性但无法检测 及进行菌种鉴定 本研究结果显示 与涂片、培养相比在肺结核诊断中敏感度具有显 著 性 差 异()这与之前的研究一致 与 相比其敏感性略低但两者之间无显著性差异()将 和 联合诊断进行分析数据表明有效提高结核病检测的敏感度 在时效性方面 周转时间为 小时长于 小时明显短于 培养与涂片时间相当 整体而言在肺结核的早期诊断中 较传统病原学检测方法具有一定优势尤其与 联合诊断时敏感度更高本研究结果显示 有助于肺结核患者的混合病原体诊断及非结核患者的其他病原体诊断与之前 对混合肺部病原体检测具有比常规检测更高的灵敏度 的相关报道相符 病毒检测常需临床医生预判并进行相关血清免疫学及 核酸检测进行诊断在本研究中发现的两例病毒感染仅通过 得到鉴定 本结果进一步突出 在识别单个标本中致病病原体方面的优势本组标本尤其在鉴定 菌种、真菌与病毒方面具有优越的可行性与 在结核、真菌、病毒诊断方面比传统培养更有优势 机体被结核感染后细胞免疫功能受损易继发、真菌(曲霉、肺孢子菌、隐球菌等)、病毒(巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、军团菌、诺卡菌等感染鉴于相关致病菌核酸提取率低故在无菌操作获取的 标本中检测出的上述病原体尽管序列数低仍需考虑其致病可能且由于抗菌药物使用对 的影响小于传统培养故建议根据检测结果可以进行抗菌药物治疗方案的调整 文献报道肺结核死亡的主要原因中肺结核合并感染死亡率最高 可以早期发现可能致病病原体指导抗菌药物的精准选择从而有望降低肺结核患者的病死率但尚需要大样本的研究证实由于抗结核药物抑制了结核菌的生长故有结核药物治疗史的患者常规涂片、培养法 阳性检出率较无治疗史者降低而 检出 阳性率无显著差异 我们根据患者有无抗结核治疗史将所纳入患者分为初诊病例和复诊病例两组我们的结果也表明 检出效率不受之前使用抗结核药物的影响()在复诊病例中除 与涂片、培养的检测效率均有显著性差异外 与 也存在显著性差异(个月的患者中 敏感度均大于涂片、培养、及三者的联合检测同时非结核感染患者()及 与其他病原体 混 合 感 染 患 者()占比均高于与对照组提示规范抗结核治疗后 被有效扼杀同时因结核感染后肺部结构改变局部廓清功能及免疫功能下降易继发混合感染 数据表明 可有效提高复诊病例的诊断效率评估是否复发为复诊患者及时精准诊治提供了一种可能且可能更适用于抗结核治疗时间 个月的复诊患者避免了非活动性肺结核患者的过度治疗同时可成为复诊患者分诊指标以决定患者是否能入住非结核病定点医疗机构就医综上所述 在肺结核早期诊断中敏感度优于涂片法、培养法与 检测相当与 联合诊断敏感度更高在肺结核合并混合感染方面具有优势可用于肺结核复诊患者评估是否复发值得推广应用 在这项回顾性研究仍有许多局限性 首先由于样本量小有部分结果表明了一定的趋势但没有达到差异显著性 因此未来需要纳入更多的患者进行研究 其次本研究只进行了 检测未进行 测序因此有可能遗漏一些 病毒 最后 目前尚缺乏统一的标准来确定检测到的病原微生物是否来自感染、定植或污染故结果需与临床相结合参考文献 .临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期:.():.():.中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.中华人民共和国卫生行 业标准:肺 结核诊 断:/.().:/.赵雁林 王黎霞 成诗明 等.结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册.北京:人民卫生出版社:.():.:.():.():.():.():.:.():.():.瞿介明 施毅.中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(年版)的更新与解读.中华结核和呼吸杂志 ():.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识.中华急诊医学杂志 ():.何霞 刘国标 梁志强 等.例肺结核病人死亡原因分析.实用预防医学 ():.:.收稿日期:出版消息(书讯)实用休克诊疗手册 年 月(中国)科学出版社出版 此书由重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科教授、博士研究生导师罗永艾主编国內 位临床各科专家、教授参加编写 作者团队历时三年精心写作在总结前人宝贵知识、经验的基础上跟踪休克研究领域的新进展汲取该领域的新知识、新理论、新技术并结合作者长期积累的临床经验阐述正确的临床思维、诊疗技术及急救方法 本书内容新颖注重实用重点突出简明扼要深入浅出可操作性强 可供各级医院临床医生、实习生研究生、规培生、进修生学习参考临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期