灰霉病处理红颜草莓果实后相关抗病转录因子的表达量分析.pdf

农业与技术 农业科学灰霉病处理红颜草莓果实后相关抗病转录因子的表达量分析杨戎戈李梓薇黄林源王晶晶赵林林尹景伟羊晔王静文张艳(江苏省水文水资源勘测局扬州分局 江苏 扬州 扬州大学/江苏省作物遗传生理重点实验室/江苏省作物栽培生理重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心 江苏 扬州 扬州文水科技咨询有限公司 江苏 扬州)摘 要:本试验选取了“红颜”草莓不同发育时期的果实作为材料 灰霉病菌处理草莓果实后 提取草莓果实 检测灰霉病处理草莓果实后相关抗病转录因子的表达量 结果发现 不同发育阶段的草莓果实灰霉病发病时间和发病状态不同 对 个抗病相关转录因子表达量分析表明 灰霉病侵染后 基因表达量均有不同程度上调关键词:“红颜”草莓 灰霉病 转录因子 抗病性中图分类号:文献标识码:/收稿日期:作者简介:杨戎戈()女 本科 助理工程师 研究方向:水文水资源分析评价引言草莓为蔷薇科()草莓属()多年生常绿草本植物 草莓因外观美观 口感鲜嫩多汁 有“水果皇后”“水果牛奶”之美誉 其含有丰富的蛋白质、维生素、维生素、维生素 每 新鲜果实里约含有 维生素 以及有机酸如水杨酸、柠檬酸 草莓还含有草莓胺 具有很好的药用价值 中国的草莓野生资源丰富程度世界排行第 生产面积最大 本试验选用“红颜”草莓品种由日本引进 果实形状为长圆锥形 此品种休眠浅产量相对较大灰霉病是草莓生长成熟及采收贮藏中极易发生病害之 一 草 莓 灰 霉 病 是 由 灰 葡 萄 孢 菌()引起的病害 主要为害草莓叶片、茎、花以及果实部分 也对年产量和草莓的外观品质影响严重 灰葡萄孢菌具有生长繁殖迅速 易抗药 在以下依然繁殖的特点 本试验过程中 感染灰霉病的草莓果实果肉变软逐渐腐烂 果实表面生出灰褐色霉状斑点 未成熟的果实病变时 草莓果实会显现出淡褐色干枯病斑 转至呈干腐状 草莓生产过程中 此病菌普遍发生于果实转色期到果实成熟期 个月可危害 病情逐渐严重 后期为害严重会导致草莓减产 此病菌不经控制会对草莓栽培造成极大的经济损失本试验分析旨在于防治灰霉病的方法 筛选优良抗病的草莓品种 为未来抗病基因研究铺设道路 材料和方法 试验材料草莓的品种丰富 本试验挑选八倍体草莓品种“红颜”()作为试验材料 年 月 日 月 日 于江苏农林职业技术学院北校区连栋温室大棚内进行试验 大棚内白天温度在 夜间温度在 此期间 草莓生长状态良好 无病虫危害灰霉菌的培养方法:所用灰霉菌()由江苏农林职业技术学院农学园艺系试验田所得 使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(培养基)为病菌培养基在 培养基上接种用常规方法纯化后的灰霉菌 放入恒温箱培养 ()处理果实 应将培养基在超净工作台上切下并放入装有至少 无菌水的锥形瓶中 打开 个灰霉病培养基 将锥形瓶中的无菌水分别均匀倒入 个培养基中 用玻璃棒轻轻刮蹭培养基表面的灰霉菌核 将菌液倒入锥形瓶中 将培养基戳碎 倒入锥形瓶中 用干净的塑料纸封住瓶口 皮筋扣住 将菌液放在震荡器摇床上震荡 用 层纱布过滤 显微镜镜检调整 制备悬浮液(孢子悬浮浓度为)用于接种果实 试验方法 灰霉菌处理对不同发育时期草莓果实的影响 年 月 日于植物组织培养母液配制室内做试验 每组分别有红、白、青 种颜色的草莓 器 农业科学 农业与技术 材:纸 玻璃瓶或培养皿 针 酒精灯 菌液(灰霉病)刷子 喷壶 在每个玻璃瓶底部垫上大小合适的纸 用喷壶将纸喷湿 不要过湿 将针在酒精灯上灭菌后 在每个草莓的不同部位上戳 个洞(不用刺穿)此时选用不同发育时期的草莓果实 果实表皮颜色分别红、白、青 种 每个草莓戳洞后刷上灰霉病菌液 放入玻璃瓶中 做完 组后 加 组没有刷菌液与戳洞的对照实验 每组草莓中各有 个红、白、青草莓果实 放置在植物组织培养母液配制室内 每天观察是否发病 相同时间段刷一次菌液 等待发病取照 年 月 日发现草莓发病 给草莓拍照照片清晰 分组明确 在凝胶成像系统实验室内进行试验 佩戴好一次性手套 用小刀将草莓表面的籽粒和表皮仔细清除 剪裁大小正好的锡纸 将去了籽粒的草莓用刀片切成薄片状 用锡纸把草莓薄片包裹好 倒出部分液氮在泡沫盒内 把锡纸包裹的草莓切片放入液氮(个草莓用 个锡纸包裹 完成后立即放入液氮)标好姓名、组数、班级 从液氮中取出草莓锡纸 放入塑料袋中 放进超低温冰箱 草莓果实 的提取洗刷研钵研杵后放入灭菌锅灭菌 在研钵中倒入适量液氮进行预冷 从冰箱中取出植物组织样品 在确保样品不潮湿的状态下 把其加入预冷好的研钵中研磨 考虑到不彻底的研磨会影响 的质量和收率 应该把组织样品研磨至无明显可见颗粒的粉末状(期间应持续加入液氮)取出 的灭菌小管子 加入 的 再往其中加入 研磨后的粉末状样品 为更好地裂解液中无明显沉淀 可使用移液器反复吹打将上述裂解液置入离心机 离心新取 个 灭菌小管子 用移液枪提取 上清液 小心加入其中 加入体积为上清液/()的 震荡摇匀将所得液体置入离心机 低温离心 离心 以下离心机均设为 将上清液吸取至新的 灭菌小管子中 此时枪量程为 加入 的 (使用前请确认已加入 倍 )使用移液枪将溶液吹打混匀按照“的提取”流程进行以下步骤加入 得到 混合液 出现沉淀时使用移液枪将溶液吹打混匀第 次用移液枪吸 转入柱子 离心 弃滤液 第 次将剩余 混合液转入柱子中 离心 弃滤液在柱子中加入 的 离心 弃滤液在柱子中加入 的 离心 弃滤液(确认 中已经加入了指定体积的 乙醇)沿柱子管壁四周加入 有助于冲洗粘附在壁管上的盐分()管 将配制好的酶液加入 至柱子中 此时枪头一定要伸到柱子中间 放置 ()管 向柱子中央加入 的 尽量在边上绕一圈 离心 弃滤液在柱子中加入 的 离心 弃滤液(确认 中已经加入了指定体积的 乙醇)沿柱子管壁四周加入 有助于冲洗粘附在壁管上的盐分将滤液倒掉 再将管子空转 换管子 留中柱 将 放在金属浴上设置 预热 此时将盖子打开挥发酒精 每个中央加入 的 加入后放置 离心 此时有 个盖子 扔掉中柱 保留小管子配胶:往锥形瓶倒入 倍的 称取 琼脂 将二者混合均匀 用微波炉加热 直至药品呈透明状 向锥形瓶中加入 滴 混合均匀 准备做 块中等大小的胶 使用中梳 将小管子里的 用 标记 依次注入胶孔以及 的 跑胶时间大致为 灰霉菌处理对草莓果实中转录因子的影响表 灰霉病处理草莓果实后相关抗病转录因子的表达量分析基因名称(符号)登录号引物序列荧光定量 年 月 日在凝胶成像系统实验室()管 打到每个小管子里 放小离心机上离心 每个吸取 上次试验的 打到管底 将每个小管子置于金属浴显示 预热 小管子插到制冰机上 直至冷却 将()管加入至小管子每个为 (移液速度要快 加在管壁上)放在小离心机上离心 如果放置时间长 应储存在冰上 第 天 用移液枪加 进入每个小管子 将 农业与技术 农业科学每个草莓的 吸 分别加入小管子 放置在小离心机上离心 放置在 仪上进行 检测 此时做胶 用大梳(孔数要够)将每个小管子的 溶液全部点进去 此时不需用 标记 点入 结果与分析 灰霉菌处理对不同发育时期草莓果实的影响图 草莓果实经过 灰霉菌液处理 年 月 日将草莓刺伤并接种灰霉菌 同年 月 日肉眼观察部分草莓病变 从试验结果分析 不同发育阶段的草莓果实对灰霉病表现出不同程度的病变 时间中未用病菌处理的草莓对照组肉眼观察暂未发病 见图 本试验过程中即将成熟的草莓果实最先病变 表明灰霉病主要危害果实 在即将成熟的果实上最易发病 草莓果实 的提取 泳道:绿果 泳道:绿果对照 泳道:白果 泳道:白果对照 泳道:红果 泳道:红果对照 泳道:图 从草莓果实中提取 利用 流程从 的草莓果实中提取 从图 可知 得到了浓度高低将近相同的 灰霉菌处理对草莓果实中转录因子表达量的影响 泳道:绿果 泳道:绿果对照 泳道:白果 泳道:白果对照 泳道:红果 泳道:红果对照 泳道:图 灰霉菌处理对草莓果实中转录因子表达量从图 可知 图片亮度大致相同 使用 技术扩增得到的内参基因 此为得到的 浓度基本相同 可以进行以下试验 见图 图 抗病相关转录因子基因相对表达量 农业科学 农业与技术 讨论栽培作物的过程中 会有多种多样的病菌微生物侵害植物 本试验主要分析灰霉病处理草莓果实后相关抗病转录因子的表达量 试验分析结果发现 不同发育阶段的草莓果实灰霉病发病时间和发病状态不同 个抗病相关转录因子、以及 在受到灰霉病侵染后 基因表达量均有不同程度上调 本试验过程中 扩增得到的 量大致相等 试验较为顺利 现今已有大量关于草莓灰霉病的分子实验 等对灰霉病菌处理过的草莓进行了分子实验 本试验材料为八倍体“红颜”品种 查阅草莓灰霉病相关抗病转录因子文献 了解到这方面的研究相对二倍体草莓较少 因此将继续在分析基因表达的研究上 对草莓灰霉病的相关抗病转录因子进行更深层次的试验分析参考文献 曹娴 高清华 聂京涛 等.草莓灰霉病抗性遗传分析和分子标记初定位.上海交通大学学报(农业科学报)():.王玉坤 张放 祝庭耀.国内草莓生产现状与发展趋势.烟台果树 ():.:.林孔勋.杀菌剂毒理学.北京:中国农业出版社.:.李径略.陕西省草莓病虫害的调查.中国果树 ():.():.邱强 胡淼 王志田.草莓病虫与营养诊断图谱.北京:中国科学技术出版社.:.(.).():.王楠 王剑 尹丹韩 等.三重 检测草莓灰霉菌、炭疽病和黄萎病菌.中国农业科学 ():.(责任编辑 贾灿)