基于HPLC-Q-TOF-MS技术分析益气生津袋泡茶的化学成分及入血成分.pdf

论著基于 HPLC-Q-TOF-MS 技术分析益气生津袋泡茶的化学成分及人血成分中国医药导报2 0 2 3年9 月第2 0 卷第2 7 期王宏蕾肖薇吴剑坤首都医科大学附属北京中医医院药学部,北京10 0 0 10摘要】目的采用HPLC-Q-TOF-MS技术对益气生津袋泡茶的主要化学成分及入血成分进行鉴定。方法6 只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重2 8 0 30 0 g，采用随机数字表法分为给药组与空白组，每组3只。给药组灌胃4ml益气生津袋泡茶水提物（生药浓度为1g/ml),空白组灌胃4ml生理盐水,2 次/d,连续给药，第4天上午给药2 h后腹主动脉取血制备血清样品。采用WatersXselectHSST3Cis色谱柱（50 mm2.1mm，2.5m），正、负离子模式下采集袋泡茶水提物与血清样品中的化学成分；以0.1%甲酸水乙腈为流动相进行梯度洗脱。结果从益气生津袋泡茶水提物中鉴定出了17 个化学成分，主要为人参皂苷类成分。同时，在血清样品中检测到了8 个化学成分，分别为甜菜碱、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、哈巴俄苷、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、毛兰素。结论采用HPLC-Q-TOF-MS技术对益气生津袋泡茶中主要化学成分及人血成分进行定性分析有助于揭示益气生津袋泡茶的药效物质基础，为进一步的质量控制、药理学和活性机制研究提供参考。关键词益气生津袋泡茶;HPLC-Q-TOF-MS;入血成分;定性分析中图分类号 R917D0I:10.20047/j.issn1673-7210.2023.27.06Analyses of chemical constituents and components absorbed into blood ofYiqi Shengjin Bag Tea by HPLC-Q-TOF-MSWANG Honglei XIAO Wei WU JiankunDepartment of Pharmacy,Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 100010,ChinaAbstract Objective To identify the main chemical constituents and components absorbed into blood of Yiqi Shengjin BagTea by HPLC-Q-TOF-MS technology.Methods Six eight-week-old SPF male SD rats,weighing 280-300 g,were dividedinto administration group and control group by random number table method,with three rats in each group.In administrationgroup,4 ml of Yiqi Shengjin Bag Tea water extract was intragastric(the crude drug concentration was 1 g/ml),while in blankgroup,4 ml of normal saline was intragastric,twice a day for continuous administration,and blood samples were collectedfrom abdominal aorta 2 h after administration on the morning of the fourth day to prepare serum samples.A Waters XselectHSS T3 Cis chromatographic column(50 mm 2.1 mm,2.5 m)was used to collect the chemical components of YiqiShengjin Bag Tea water extract and serum samples under positive and negative ion modes;gradient elution was performedwith 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase.Results Seventeen compounds were identified from Yiqi Shengjin BagTea water extract,mainly ginsenosides.Meanwhile,eight chemical constituents were identified from the serum sample,which were betaine,ginsenoside Rgl,ginsenoside Re,harpagoside,pseudoginsenoside F11,ginsenoside Rbl,ginsenosideRd,and erianin.Conclusion HPLC-Q-TOF-MS technology was used to analyze the main chemical components of YiqiShengjin Bag Tea,which can help to reveal pharmacodynamic material basis of Shengjin Bag Tea,and provide reference forfurther quality control,pharmacology,and activity mechanism research.Key words Yiqi Shengjin Bag Tea;HPLC-Q-TOF-MS;Components absorbed into blood;Qualitative analysis益气生津袋泡茶由西洋参、生黄芪、麦冬、石斛等基金项目 毛克臣全国名老中医药专家传承工作室。作者简介】王宏蕾（198 6.12-）,女，硕士；研究方向：临床药学。通讯作者 吴剑坤（197 0.2-),女，主任药师；研究方向：临床药学与药事管理。30CHINAMEDICAL HERALD Vol.20 No.27September 2023文献标识码 A文章编号 16 7 3-7 2 10(2 0 2 3)0 9(c)-0030-05十味中药组成，为一种茶散剂叫,具有益气养阴、生津止渴，润肺清胃，滋肾宁心的功效，为首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，由王为兰、夏军及毛克臣三位中医药专家在糖尿病气阴亏虚的中医病机研究基础上研制而成，临床应用30 余年。研究证实,其在改善糖代谢及治疗干燥综合征等方面取得了较好的中国医药导报2 0 2 3年9 月第2 0 卷第2 7 期论著效果2-5。但是目前尚未开展其化学成分相关研究,药效物质基础仍不明确。分析入血成分可快速、准确地解析中药药效物质，也是中药质量标志物筛选的重要依据,是快速确定中药体内药效物质的有效途径之一6-8 。基于此，鉴定益气生津袋泡茶的化学成分及人血成分成为重中之重。液质联用技术以其快捷、高灵敏度、高分辨率等特点被广泛应用于中药原型成分与代谢产物的鉴别9-1。因此,本研究采用HPLC-Q-TOF-MS技术对益气生津袋泡茶的化学成分进行鉴定，并在此基础上对其入血成分进行分析表征，以期为益气生津袋泡茶的质量控制和药效物质基础的研究提供依据。1仪器与试药1.1实验仪器Agilent1200型高效液相色谱柱仪（美国Agilent公司）;TripleTOF5600四级杆飞行时间质谱（美国ABSciex公司);BT25S型电子分析天平（精度0.0 1mg，德国Sartorius公司）;BSA6202S电子分析天平（精度0.01g,Sartorius公司）;1-15PK型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）;CM-12型水浴氮吹仪（北京成萌伟业科技有限公司）。1.2药品与试剂益气生津袋泡茶为首都医科大学附属北京中医医院自制；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(成都普菲德生物技术有限公司，批号：140 32 6)；人参皂苷Re（上海源叶生物科技有限公司，批号：P27N6F6512)；甜菜碱、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1(中国食品药品检定研究院，批号:110 8 9 4-2 0 16 0 4,110 7 0 4-2 0 12 2 3、110 7 0 3-2 0 112 8);哈巴俄苷、哈巴苷、毛兰素（南京狄尔格医药科技有限公司，批号：D22052910、D 2 2 0 6 2 17 7、D 2 10 8 0 111）。色谱级甲酸、甲醇和乙腈（美国Fisher公司）。1.3实验动物8周龄SPF级SD雄性大鼠6 只，体重2 8 0 30 0 g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK（京)2 0 19-0 0 10，质量合格证号为：No.110324221103743637。本研究涉及的实验动物方案已得到北京中医药大学实验动物伦理委员会的批准(BUCM-4-2022061502-2062)。2方法与结果2.1 溶液制备2.1.1益气生津袋泡茶水提物制备称取益气生津袋泡茶内容物10 0.13g，加8 倍量去离子水，回流提取2 次，每次30 min，纱布滤过，合并两次提取液，50 水浴蒸至稠膏状,转移至50 ml量瓶中，离子水定容，得生药浓度为2 g/ml的水提物稠膏，-2 0 保存。分析前,取稠膏适量，稀释40 倍，0.2 2 m滤膜过滤，取续滤液，即得。2.1.2灌胃液制备取2.1.1 项制备的水提物稠膏适量，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成生药质量浓度为1g/ml的混悬液,4储存,作为灌胃液备用。2.1.3混合对照品溶液制备分别精密称取9.7 8 mg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、8.93mg甜菜碱、9.34mg人参皂苷Rb1、10.0 2 m g 人参皂苷Rgl、9.53m g 人参皂苷Re、9.64mg哈巴俄苷、9.7 1mg哈巴苷、11.33mg毛兰素，加甲醇超声溶解并稀释，制成浓度约为10 g/ml的混合对照品溶液。2.2动物实验采用随机数字表法将6 只大鼠分为给药组与空白组，每组3只。给药组灌胃4ml益气生津袋泡茶灌胃液,空白组灌胃4ml生理盐水,2 次/d,连续给药，第4天上午给药2 h后麻醉大鼠,腹主动脉采血并置于4以备后续处理分析。2.3血浆样品处理血浆样品分装于离心管中，4,350 0 r/min离心15min（离心半径为10 cm，下同）,取上清液，加人等体积乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀2 min，410 0 0 0 r/m i n离心10 min，吸取上清液用氮吹仪吹干，加50%甲醇200l复溶，4，10 0 0 0 r/min离心10 min，取上清液上样分析。2.4色谱条件与质谱条件2.4.1色谱条件WatersXselectHSST3Ci色谱柱（50 mmX2.1mm,2.5m);流动相为0.1%甲酸（A)-乙(B),梯度洗脱:0 3min,15%B;36min,15%B35%B;617 min,35%B65%B;1718 min,65%B95%B;1822min,95%B;2223min,95%B15%B;2327min,15%B。柱温40，流速0.3ml/min，进样体积3l。2.4.2质谱条件电喷雾离子源；分别采用正、负离子模式检测；质量扫描范围为m/z1001300；喷雾电压4500V；离子化温度50 0；碰撞能量35eV；气帘气30psi;喷雾气和辅助加热气分别为40、50 psi；去簇电压10 0 V。2.5益气生津袋泡茶提取物中化学成分鉴定采用Analyst1.7软件进行质谱数据采集与分析，对照品溶液与水提物的总离子流图见图1。通过质谱裂解碎片分析、对照品确认及相关文献12-13 报道数据进行比对，共鉴定出17 种化学成分，包括1个生物碱类成分、1个黄酮苷类成分、1个留体皂元、2 个环烯醚枯苷类成分与12 个人参皂苷类成分。鉴定出的化学成分的详细信息见表1。化合物鉴定时，其中8 个化合物经对照品比对后CHINA MEDICAL HERALD Vol.20 No.27 September 202331论著A3e72e70.6841e7Oe一234B1.5e0.46811.05.001.9490.0e123456789101112131415161718 1920212223242526C时间（min）0.5351.5e？1.0e75.0e60.0eD1.0e75.0e0.0eE0.2715e60.3690.9141.627 3.3334.827Oe12345678 91011121314151617181920212223 242526F时间（min)0.2965e60.405Oe123456G3e0.5832e70.7761e70.454Oe23456789101112131415161718192021 2223242526H3e2e70.5440.9991e7OeoA：对照品正离子模式；B：对照品负离子模式；C：水提物正离子模式；D：水提物负离子模式；E：空白组血浆样品正离子模式；F：空白组血浆样品负离子模式；G：给药组血浆样品正离子模式；H：给药组负离子模式。32CHINA MEDICAL HERALD Vol.20 No.27 September 2023中国医药导报2 0 2 3年9月第2 0 卷第2 7 期13.2152.1909.214.9.7693.4488.0868.988K6 78910111213141516171819 2021 222324时间（min）9.5088.95910.64712.9829.2650.6770.9001.22882.265234567891011121314151617181920212223242526时间（min）0.5312e81e60.686OeoJ0.3739.18310.84512345 67891011121314151617181920212223242526时间（min）17.62720.09916.98916.88010.4078.4478.6457.473891011121314151617181920212223242526时间（min）17.10717.21410.57610.3838.8769.8418.9909.85911.97614.678 16.851 17.6021234567891011121314151617181920 21 2223242526时间（min）图1总离子流图11.5908.5599.16910.8337.60010.98112.4587.58.08.59.09.510.010.511.011.517.15912.868116.64412.07714.861M人16.94617.56417.87817.37613.04316.68315.72616.846时间（min）AW18.10216.51419.29321.334八22.23623.546124.89419.86122.10624.46525.78119.18319.69021.60921.37320.34718.54119.900/21.85023.19924.223一人人人21.69721.59222.49121.03421.34620.06724.22810.84524.82823.740 24.41626.17621.71322.27322.51724.13025.16422.25923.51224.528中国医药导报2 0 2 3年9 月第2 0 卷第2 7 期论著表1益气生津袋泡茶中成分的鉴定结果保留时间峰号(min)10.53520.68632.26548.61459.18369.18379.72289.851910.0541010.5351110.8451210.9821311.0781411.0781511.0781612.3651713.190注“表示与对照品比对鉴定。确认,剩余9个化合物通过与文献报道的质量数与二级谱数据对比后鉴定。以化合物4的鉴定过程为例进行详细的说明。化合物4在负离子模式下准分子离子峰m/z为7 8 3.48 8 5M-H，元素组成分析，推测该化合物的分子式为C42Hz2013(-0.5ppm);其特征离子峰为连续脱去两分子葡萄糖生成m/z=621M-H-Glu和459M-H-2Glu,以及苷元上C-20位脱掉侧链后的碎片离子m/z=375M-H-2Glu-C,Hi2,与人参二醇型皂苷14 的裂解规律一致，且二级谱数与人参皂苷F2一致2),因此推测该化合物为人参皂苷F2。2.6益气生津袋泡茶入血成分鉴定给药组大鼠的血清样品中共鉴定出8 个原型吸收人血的成分,分别为甜菜碱、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、哈巴俄苷、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、毛兰素，其中5个人参皂苷类成分均来源于西洋参。3讨论益气生津袋泡茶临床用量为10 30 g生药/d,基于人体平均重量6 0 kg及人与大鼠剂量换算（系数6.3),280g大鼠给药剂量应为1.5 4.5g生药/d。而本研究中给药剂量为8 g/d,约为临床给药剂量的2 倍，是考虑到体内血中成分的含量往往很低，目前的技术存在检测困难的问题。因此,在保证给药剂量安全的情况下，通过提高给药浓度及3d多次给药的方式，增加血中成分的浓度,以满足检测的要求。此外,由于中药复方中化学成分复杂，常包含多种类型的化学成分，而有些化学成分在正、负离子模式下的响应差异较大15-17 ,同时,复方中各化学成分的含量存在显著差准分子离子峰分子式(m/z)实测C,HmNO2118.086 2M+HCisH240 10409.133 5M+C00HC2H2010447.129 8M+H+C42Hz,O13783.488 5MHC42Hz,0 14845.490 8M+C00HC4sHe2O1s991.548 4M+C00HC24HoO11517.168 2M+Na*CasH%O 19955.491 3M-HCs,Ha.0261 193.595 4M-HC42H20 14845.486 2M+C00HCs.H20231 107.594 1M-HCaH2O13829.493 9M+C00HC42H2013829.4951M+C00HCaH20,683.437 8M+C00HCs;HoO21123.593 0M+C00HC4sH2O1s991.5440M+C00HCisH20,319.154 9M+H偏差(ppm)-0.5-1.42.7-0.51.41.20.31.70.4-3.7-0.4-0.60.81.93.1-3.22.8异18-2 0。因此,为了实现对复方中化学成分进行较全面的表征，本研究分别采用正、负离子模式采集，对益气生津袋泡茶的主要化学成分进行定性识别。目前研究表明，西洋参总皂苷2 1-2 及多种人参皂苷单体如人参皂苷Re、Rg l、Rb 1、Rg 2 等能通过改善胰岛素抵抗,增强葡萄糖摄取,抑制葡萄糖输出,抑制肝脏糖异生及缓解糖脂代谢等途径来调节机体的糖代谢2 3-2 5。而本研究发现，益气生津袋泡茶中含有丰富的人参皂苷类成分，且多种皂苷被发现均能以原型方式人血（如人参皂苷Rb1、Re)。推测这些成分可能是益气生津袋泡茶改善糖代谢功效的物质基础。综上，本研究基于HPLC-Q-TOF-MS技术对益气生津袋泡茶中的主要活性成分进行快速识别，为明确其药效物质基础提供了一定的科学依据，也为该药的质量控制、剂型改进及进一步临床研究奠定了理论基础。参考文献1夏军,周琦，朱玲，等.益气生津袋泡茶对KKAy小鼠胰岛素抵抗影响的实验研究J.北京中医药,2 0 17,36(12)：1066-1067.2张会存，尚菊菊，王宁，等.益气养阴方对非酒精性脂肪性肝病大鼠胰岛素抵抗的影响J中国中医药信息杂志，2015,22(12):47-49.3王北,顾文,马丛,等.益气生津散治疗干燥综合征气阴两虚证临床观察北京中医药,2 0 18,37(11)：10 36-10 38，1042.4陈爱萍，温博，马从，等.毫针联合“益气生津散”治疗原发干燥综合征2 7 例临床观察J.江苏中医药,2 0 19,51(10):64-66.5佟丽,仇盛蕾.益气生津袋泡茶在气阴两虚型糖尿病前CHINA MEDICAL HERALD Vol.20 No.27 September 202333二级碎片(m/z)59,58201,183285,270,225621,459,375799,637,475783,637,475369,351,203793,731,569,4551149,1107,945653,635,491,161945,783,621783,637,475783,637,475637,475,161945,783,621783,621,459195,180,151化合物甜菜碱哈巴苷。毛蕊异黄酮葡萄糖苷。人参皂苷F212人参皂苷Rgla人参皂苷Rea哈巴俄苷人参皂苷Rol12丙二酰-人参皂苷Rb113拟人参皂苷F113人参皂苷Rbla20(S)-人参皂苷 Rg212)20(R)-人参皂苷 Rg202)人参皂苷F12人参皂苷Rb3或其异构体12 西洋参人参皂苷Rd3西洋参毛兰素石斛归属枸杞子玄参黄芪西洋参西洋参西洋参玄参西洋参西洋参西洋参西洋参西洋参西洋参西洋参论著期患者中的应用效果J.北京中医药,2 0 2 0,39(7)：7 50-752.6陈洪娇，杨文宁,尹仁芳，等.基于序贯代谢方法的痛风定胶囊体内代谢分析.中国实验方剂学杂志,2 0 2 2,2 8(24):160-170.7邹钊,李佳珊,徐颖，等.基于UPLC-Q-Orbitrap-MS 和分子对接技术的青盐方药效物质基础分析.中国实验方剂学杂志,2 0 2 2,2 8(2 2)：159-16 6.8魏飞亭，程昊,乔日发，等.UPLC-Q-TOF/MS鉴定大鼠灌服积壳提取物后的入血成分及其代谢产物.中国实验方剂学杂志，2 0 2 0,2 6(2 1)：16 1-17 2.9张童画,乔溪莹,徐浩然，等.基于UPLC-Q-Exactive-Or-bitrap-MS隔山消化学成分的鉴定.中成药,2 0 2 3,45(3)：807-814.10尹优，何瑞坤，黄焕迪，等.基于UPLC-Q-TOF/MS技术分析大高良姜醇提物的化学成分及胃溃疡寒证大鼠口服后的人血成分中华中医药学刊,2 0 2 2,40(11)：142-147.11周熙,罗辉泰,赖晓娜,等.高分辨质谱技术在中药分析中的研究进展刃分析测试学报,2 0 2 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