黄岛口岸送检蜚蠊的分子鉴定.pdf

口岸卫生控制第 28卷 第 5期基金项目：1.山东省重点研发计划（重大科技创新工程）2021CXGC011306；2.河北省重点研发计划项目 213777109D；3.福建省社会发展引导性（重点）项目 2022Y0061黄岛口岸送检蜚蠊的分子鉴定刘迪1，张祎1，钱云开2，滕新栋1（通信作者）（1.青岛海关，山东 青岛 266071；2.秦皇岛海关，河北 秦皇岛 066000）摘要目的对黄岛口岸送检的蜚蠊进行种类鉴定。方法对黄岛口岸送检的 7 只蜚蠊依据形态特征进行形态学鉴定，确定蜚蠊种类。选取每只蜚蠊的小段后足，组织匀浆后提取线粒体基因组 DNA，利用基于线粒体基因组 COI 基因的 DNA 条形码技术进行序列扩增和分析，与 NCBIGeneBank 数据库中的序列进行比对，选取褐斑大蠊（Periplaneta brunnea，NC_039940.1）、澳洲大蠊（Periplaneta australasiae，KX640825.1）和黑胸大蠊（Periplaneta fuliginosa，NC_006076.1）等相关近似种构建系统进化树。结果捕获的 7 只蜚蠊形态鉴定均属于美洲大蠊，序列与 GenBank 中美洲大蠊（登录号：MT011509.1、MH184241.1、KU543637.1）COI 基因序列同源性为 98.91%100.00%，判断此次捕获蜚蠊均为美洲大蠊。系统进化树显示蜚蠊样本与美洲大蠊序列形成一个单系，与近似种蜚蠊显著区分开。结论通过形态学和分子鉴定手段，明确黄岛口岸送检的蜚蠊种类为美洲大蠊，为口岸蜚蠊防控提供了数据支持。关键词蜚蠊口岸分子鉴定中图分类号R185.3+5文献标识码Bdoi10.3969/j.issn.1008-5777.2023.05.008Molecular Identification of Cockroaches Submitted for Inspection at Huangdao PortLiu Di1，Zhang Yi1，Qian Yunkai2，Teng Xindong1（Corresponding Author）（1.Qingdao Customs，Qingdao Shandong 266000；2.Qinhuangdao Customs，Qinhuangdao Hebei 066000）AbstractObjectiveTo identify the species of cockroaches submitted for inspection at Huangdao Port.MethodsMorphological identification was conducted on 7 cockroaches submitted for inspection at Huangdao Portbased on their morphological characteristics，to determine the types of cockroaches.Select a small posterior foot ofeach cockroach，extract mitochondrial genome DNA after tissue homogenization，use DNA barcoding technologybased on Mitochondrial genome COI gene for sequence amplification and analysis，compare with the sequence inNCBI GeneBank database，Periplaneta brunnea（NC_039940.1），Periplaneta australiae（KX640825.1），and Periplaneta fuliginosa（NC_006076.1）were selected as related similar species to construct a phylogenetic tree.ResultsThe seven cockroaches belong to Periplaneta americana through morphological identification，and the sequence has 98.91%-100.00%homology with the COI gene sequence homology of Periplaneta americana（registration number：MT011509.1，MH184241.1，KU543637.1）in GenBank.Judged that the captured cockroaches are allPeriplaneta americana.The phylogenetic tree shows that the cockroach sample forms a single lineage with the Periplaneta americana sequence，which is significantly distinguished from similar species of cockroaches.ConclusionThrough morphological and molecular identification methods，it was determined that the cockroach species submitted for inspection at Huangdao Port were Periplaneta americana，providing data support for cockroach prevention媒介生物调查与分析-34第 28卷 第 5期蜚蠊，俗称蟑螂（cockroach），隶属于蜚蠊目（Blattaria）蜚蠊科（Blattidae），是与人类生活密切相关的室内卫生害虫，也是国境口岸常见的病媒生物，全世界已知有 5 000 多种1。蜚蠊是一种古老的昆虫，生命周期长、发育速度快、产卵多2。除交配产卵繁殖外，雌性蜚蠊还可通过孤雌生殖维持种群，繁殖能力极强。此外，蜚蠊还具有极强的环境适应能力，无水无食时可存活 1290 d。成虫及其卵鞘可通过火车、飞机、轮船等各类交通工具传播至世界各地并定居繁衍，例如已经定居中国的美洲大蠊、德国小蠊。蜚蠊的这些生物学特性使其易于在环境中大量繁殖并生存，而全球经济、人口、货物的快速流动及气候变化进一步为蜚蠊入侵及定殖提供了便利条件。传统的蜚蠊分类鉴定以形态学鉴定技术为依据，但诱蟑盒或粘蟑板捕获的蜚蠊经常存在残缺不全、辨认难度高等问题3。DNA 条形码技术自研发以来，因其准确度高、不受样品形态影响等多种优点，已成为识别和发现物种的强大分类学工具4-6。线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 I（COI）基因是 DNA条形码技术常用的靶点，目前也已有许多针对蜚蠊COI 基因的分类研究3，7-8。本研究通过形态学鉴定及 DNA 条形码鉴定相结合的方法对黄岛海关蜚蠊监测过程中捕获的 7 只蜚蠊进行鉴定。1材料与方法1.1标本来源本研究使用的样品来自 2023 年黄岛海关蜚蠊本 底 监 测 过 程 中 利 用 诱 蟑 盒 捕 获 的 蜚 蠊，共计 7 只。1.2形态学鉴定根据 我国蜚蠊目昆虫室内常见种类、分布及主要种的检索表9及 SN/T 4280.42016 国境口岸美洲大蠊形态及 DNA 条形码鉴定方法，利用体视显微镜对送检的蜚蠊进行形态学鉴定。1.3DNA 条形码鉴定取每只蜚蠊的一小段后足，按照核酸提取试剂盒（Takara 公司）说明书的要求进行线粒体基因组DNA 提取。PCR 引物及扩增条件参照文献进行10，扩增产物由上海生工青岛有限公司测序。测序结果通过 DNAman 软件分析处理后上传至 NCBI 进行序列比对。1.4NJ 进化树构建与分析将此 7 只蜚蠊的 COI 基因序列、美洲大蠊标准序列以及相似种蜚蠊序列导入 Mega11 软件，分析处理后采用邻接法构建 NJ 系统发育树（neighbor-joining tree）。2结果形态学鉴定结合分子鉴定结果显示，本次捕获的 7 只蜚蠊均为美洲大蠊。2.1形态学鉴定体视显微镜下观察，美洲大蠊体型大，前胸背板横椭圆形，中部有一标志性蝶形大斑，赤褐色至黑褐色，后缘褐色，由中央向后延伸呈须状，前缘有淡黄色“T”形小斑。前翅褐色无花纹，长度超过腹部末端。尾须较长而末端很细小。肛上板长大，中央有一深凹口。雄虫肛上板半圆形无色透明，雌虫肛上板略呈三角形赤褐色不透明。尾刺圆柱形。2.2DNA 条形码鉴定PCR 扩增产物测序后得到全长 658 bp 的序列。测序所得序列在 GenBank 中比对结果显示，7 只蜚蠊样本序列与 GenBank 中的美洲大蠊（登录号：MT011509.1、MH184241.1、KU543637.1）COI 基因相似性为 98.91%100.00%。（见表 1）。and control at the port.Key wordsCockroachesPortMolecular identification样本序号1234567物种名美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus，1758）相似度（%）100.00100.00100.0099.8499.6999.3998.91GenBank 号MH184241.1MH184241.1KU543637.1MT011509.1MT011509.1MT011509.1MT011509.1表 1蜚蠊样本 COI 基因相似性比对结果刘迪，等.黄岛口岸送检蜚蠊的分子鉴定-35口岸卫生控制第 28卷 第 5期2.3NJ 进化树构建与分析下 载 美 洲 大 蠊 登 录 号 为 MH184241.1、KU543637.1、MT011509.1 的标准序列，选取褐斑大蠊（Periplaneta brunnea，NC_039940.1），澳 洲 大 蠊（Periplaneta australasiae，KX640825.1）、黑 胸 大 蠊（Periplaneta fuliginosa，NC_006076.1）为 相 关 近 似种，从 NCBI 数据库中下载相应物种的 DNA 条形码序列，使用 Mega 11 软件构建系统发育树，进一步确认分子鉴定的结果。结果显示样品蜚蠊与美洲大蠊序列形成一个单系，与近似种蜚蠊显著区分开。样品蜚蠊与 GenBank 中美洲大蠊（MH184241.1、KU543637.1、MT011509.1）的遗传距离均0.02，且置信度为 100，证明本次捕获的蜚蠊均为美洲大蠊（见图 1）。图 1 基于 COI 基因序列构建的系统发育树3讨论形态学鉴定技术仍是目前普遍使用的鉴定技术，短时间内难以被其他方法完全取代。但已有许多研究表明，DNA 条形码鉴定技术可以弥补形态学鉴定技术的不足，二者结合可以有效提高物种鉴定的效率及准确性11-12。本研究通过形态学鉴定结合DNA 条形码鉴定的方法，明确了黄岛口岸送检的 7只蜚蠊均为美洲大蠊。美洲大蠊为蜚蠊科大蠊属的昆虫，原产于非洲北部，公元 16 世纪前后随人类活动进入美洲，随后传播至世界各地13。美洲大蠊是山东省常见蜚蠊物种14-15，在 20062019 年间多次全国蜚蠊监测中，美洲大蠊的数量也仅低于德国小蠊16-18，此次捕获的 7 只蜚蠊均为美洲大蠊也可证明该蜚蠊物种在黄岛口岸占比较高。美洲大蠊可通过体表机械性及体内生物性携带、传播多种病原微生物，已分离出痢疾杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等 40 种细菌，包括一些重要的耐药菌，以及乙肝表面抗原、脊髓灰质炎病毒、腺病毒等多种病毒19-20。此外，美洲大蠊还携带多种过敏原，被其污染的食物或者被咬都可能引发过敏反应，如皮炎、呼吸道过敏等21。美洲大蠊繁殖快、对环境适应性强、危害程度大，易于随国际航行船舶远距离扩散，从口岸入境后可迅速在适宜的生态环境中定殖甚至造成传染-36第 28卷 第 5期病的流行。积极进行输入性病媒生物监测及其携带传染病的防控对于预防上述现象的发生尤为重要。因此，国境口岸需进一步提高对病媒生物监测的重视，加大监测力度、密度和范围，防范口岸病媒生物及其传播传染病的输入。参考文献1 荆秀昆.蟑螂的防治 J.中国档案，2020（11）：83.2 凌浩宇，沈润华，郭升阳，等.我国口岸输入性蜚蠊现状与应对措施 J.中国国境卫生检疫杂志，2021，44（2）：142-144.3 陈壮志，杨志斌，李贵轲，等.基于 COI 和 18S rRNA基因对蜚蠊物种进行分子鉴定 J.广州化工，2016，44（13）：104-107，133.4 Bergsten J，Bilton DT，Fujisawa T，et al.The effect of geographical scale of sampling on DNA barcoding J.SysteBiol，2012，61（5）：851-869.5 Antil S，Abraham JS，Sripoorna S，et al.DNA barcoding，an effective tool for species identification：a reviewJ.Mol Biol Rep，2023，50（1）：761-775.6 Blaxter M，Mann J，Chapman T，et al.Defining operationaltaxonomic units using DNA barcode dataJ.PhilosTrans R Soc B：Biol Sci，2005，360（1462）：1935-1943.7 邱德义，魏晓雅，吴可量，等.德国小蠊及其近缘种的形态和分子鉴定 J.中国媒介生物学及控制杂志，2017，28（3）：220-225.8 陈红娜，褚宏亮，刘大鹏，等.我国室内常见蜚蠊的分子鉴定研究 J.中国媒介生物学及控制杂志，2018，29（1）：20-22，26.9 姚廉.中药蜚蠊的研究：我国蜚蠊目昆虫室内常见种类、分布及主要种的检索表 J.天津药学，1995（2）：37-41.10 刘迪，庄国栋，徐丽，等.青岛胶东国际机场通航前捕获蚊蝇的分子鉴定 J.中国国境卫生检疫杂志，2023，46（1）：20-24.11 Manoylov KM.Taxonomic identification of algae（morphological and molecular）：species concepts，methodologies，and their implications for ecological bioassessmentJ.J Phycol，2014，50（3）：409-424.12 Sun WX，Huang ST，Xia JW，et al.Morphological andmolecular identification of Diaporthe species in south-western China，with description of eight new species J.MycoKeys，2021，77：65-95.13 Lin L，Wen J，Li S，et al.Life-history traits from embryonic development to reproduction in the american cockroach J.Insects，2022，13（6）：551.14 刘峰，刘亚楠，孙钦同，等.山东省 2019 年蜚蠊监测分析 J.中国媒介生物学及控制杂志，2020，31（4）：477-480.15 王学军，孙钦同，亓宗宝，等.山东省 2016-2020 年蜚蠊监测分析 J.中国媒介生物学及控制杂志，2022，33（4）：525-529.16 岳玉娟，任东升，吴海霞，等.2019 年全国蜚蠊监测报告 J.中国媒介生物学及控制杂志，2020，31（4）：412-416.17 吴海霞，鲁亮，孟凤霞，等.2006-2015 年我国蜚蠊监测报告 J.中国媒介生物学及控制杂志，2018，29（2）：113-119.18 任东升，吴海霞，郭玉红，等.2018 年全国蜚蠊监测报告 J.中国媒介生物学及控制杂志，2019，30（2）：142-145.19 刘晓飞，刘娟，田蕾，等.美洲大蠊成虫肠道可培养细菌多样性研究J.微生物学通报，2015，42（11）：2207-2214.20 单振菊，邱德义，陈健，等.二代测序技术检测不同环境下美洲大蠊携带细菌的研究 J.中国媒介生物学及控制杂志，2017，28（6）：543-549.21 Xu ZQ，Zhu LX，Lu C，et al.Identification of Per a 13 asa novel allergen in American cockroach J.Mol Immunol，2022，143：41-49.收稿日期：2023-08-08刘迪，等.黄岛口岸送检蜚蠊的分子鉴定-37